3.4.1 Übersicht über die Stimulations-Studie
Die BYK199404-Konzentrationen zur Stimulation beider Zelllinien betrugen 0,01; 0,1; 1;
und 10 µmol/l. Von den RBE4-Zellen wurden 6 Passagen (p6, p10, p13, p14, p18, p19) und von den HUVEC 5 Passagen (p2, p3, p4, p5, p6) stimuliert, 3 Passagen der HUVEC (p4, p5, p6) wurden zusätzlich mit einer weiteren Konzentration von 0,001 µmol/l BYK199404 stimuliert. Als Positivkontrolle wurden alle Passagen beider Zelllinien mit LPS stimuliert. Dabei wurden die HUVEC mit dem LPS 0111:B4 und die RBE4-Zellen mit dem LPS 0127:B8 stimuliert. Die LPS-Konzentrationen für die Stimulation betrugen für beide Zelllinien 2 und 20 µg pro 1 ml Zellkulturmedium. Als Negativkontrolle diente eine Behandlung mit dem jeweiligen Komplettmedium. 24 h und 48 h nach der Stimulation beider Zelllinien wurde die Zellviabilität und der IL-6-Gehalt des Zellkulturüberstandes bestimmt (siehe Tabelle 17).
Tabelle 17: Versuchsübersicht der In-vitro-Studie
Zelllinie Stimulation mit: stimulierte
Passagen Zeitpunkte für
3.4.2 Kultivierungsbedingungen der HUVEC
Die HUVEC wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen mit 5 ml Komplettmedium in einem Brutschrank unter konstanten Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Die Basis des Mediums für diese Zellen war ein Endothelzell-Wachstums-Medium. 500 ml dieses Mediums wurden versetzt mit:
1. 23,5 ml Endothelzell-Wachstums-Supplement-Mix, FKS (bestehend aus: 0,02 ml FKS; 4 µl Endothelzell-Wachstums-Supplement/Heparin (ECGS/H; 3 mg/ml); 0,1 ng rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor, human (EGF); 1 ng rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor, human (bFGF); 1 µg Hydrokortison pro 1 ml Basalmedium);
2. 3,5 ml Gentamicin (50 µg pro 1 ml Basalmedium);
3. 2,5 µg Amphotericin pro 1 ml Basalmedium.
Der Mediumwechsel erfolgte alle 2 - 3 Tage.
3.4.3 Kultivierungsbedingungen RBE4-Zellen
Die RBE4-Zellen wurden auf 100 x 20 mm Zellkultur-Petrischalen mit 10 ml Komplettmedium in einem Brutschrank unter konstanten Bedingungen (37 °C, 5 % CO2) kultiviert. Die Kultivierungsgefäße mussten vorher mit Kollagen beschichtet werden.
Dazu wurde aus der Kollagen-Stammlösung (Collagen I, Rat Tail; 3 mg/ml) eine 1:50 Verdünnung mit Aqua bidest hergestellt. Pro 100 x 20 mm Zellkultur-Petrischale wurden 4 ml dieser Verdünnung aufgetragen und im Inkubator für 1 h bei 37 °C inkubiert.
Danach wurde die Kollagenverdünnung wieder abgesaugt. Das Komplettmedium für die RBE4-Zellen bestand aus:
1. 44 % F-10+GlutaMAX™-I Nutrient Mixture (Ham) 1x cell growth medium;
2. 44 % MEM Alpha+ GlutaMAX™-I MEM Alpha Medium 1x;
3. 10 % hitzeinaktiviertes (56 °C, 30 min) FKS, 4. 1 % L-Glutamin 200 mM;
5. 1 % Penicillin/Streptomycin 10 000 U/ml;
6. 1 ng/ml rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor;
7. 2,5 µg Amphotericin B pro 1 ml Komplettmedium.
Der Mediumwechsel erfolgte alle 2 - 3 Tage.
3.4.4 Passage von HUVEC und RBE4-Zellen
Passagiert wurde bei Erreichen einer Konfluenz von circa 80 %. Beim Passagieren wurden die Zellen mit Hilfe von EDTA und einem Trypsin/EDTA-Gemisch voneinander und vom Zellkulturgefäß gelöst und in ein Falkonröhrchen überführt. Nach Zentrifugation (HUVEC: 5 min, 250 g; RBE4: 6 min, 1500 g) wurde das verbleibende Zellpellet in 5 ml Komplettmedium resuspendiert. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 50 µl der Zellsuspension mit Trypanblau im Verhältnis 1 : 3 angefärbt und die Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Es wurden die 4 großen Kammern gezählt und folgende Formel angewandt:
(Zellzahl/4) x 3 x 5 x 10.000 = Gesamtzellzahl in 5 ml 3.4.5 Aussaat der HUVEC
Auf den Zellkulturgefäßen wurden 6 000 Zellen pro cm2 ausgesät.
Für die Stimulationsversuche wurden die Zellen in 48-well Platten mit 500 µl Komplettmedium pro Well und 6 000 Zellen pro Wellbeziehungsweise in 96-well Platten mit 100 µl Komplettmedium pro Well und 14 000 - 30 000 Zellen pro Well ausgesät. Mit der Stimulation wurde erst begonnen wenn eine Konfluenz von 100 % erreicht war. Die Grundfläche eines Wells der 48-well Platte betrug 1 cm2 und die der 96-well Platte betrug 0,28 cm2.
3.4.6 Aussaat der RBE4-Zellen
Auf den Zellkulturgefäßen wurden 2 500 - 5 000 Zellen pro cm2 ausgesät.
Für die Stimulationsversuche wurden die Zellen in 48-well Platten mit 500 µl Komplettmedium pro Well und 30 000 - 50000 Zellen pro cm2, ausgesät. Mit der Stimulation wurde erst begonnen, wenn eine Konfluenz von 100 % erreicht war. Die Grundfläche eines Wells betrug 1 cm2.
3.4.7 Herstellen der Lösungen und Stimulation der Zellen 3.4.7.1 PDE4-Inhbitor BYK199404
Für die Stimulation der Zellen wurden 0,001; 0,01; 0,1; 1 und 10 µmol/l Lösungen der Substanz BYK199404 hergestellt. Die Art der Herstellung dieser Lösungen war für beide Zelllinien gleich, sodass im Folgenden mit dem Wort „Komplettmedium“ immer das jeweilige Komplettmedium für die jeweilige Zelllinie gemeint ist. Das Molekulargewicht von BYK199404 beträgt 462,97 g/mol. Um eine 0,1 molare Lösung herzustellen, wurden 46,3 mg der Substanz BYK199404 in 1 ml Komplettmedium gelöst. Diese 0,1 molare Lösung wurde in aufeinanderfolgenden Verdünnungsschritten zu einer 0,00001 molaren Lösung weiter verdünnt (entspricht 10 µmol/l). Nach Sterilfiltration wurden weitere Verdünnungsschritte durchgeführt, um daraus die oben aufgeführten Konzentrationen zu erhalten.
Für den Stimulationsversuch wurde das Komplettmedium abgesaugt. Anschließend wurden je 2 Wells pro Verdünnung stimuliert.
3.4.7.2 Ansatz der Lipopolysaccharide (LPS) 0111:B4 und 0127:B8
Das LPS 0111:B4 wurde zur Stimulation der HUVEC verwendet und das LPS 0127:B8 wurde zur Stimulation der RBE4-Zellen verwendet. Da beide Zelllinien in den gleichen Konzentrationen des jeweiligen LPS getestet wurden, wird im Folgenden auf eine Differenzierung der LPS verzichtet. Das als Lyophilisat gelieferte LPS (1 mg) wurde in 1 ml PBS gelöst, sodass die Konzentration des LPS 1 mg/ml betrug. Die Zellen wurden mit 2 und 20 µg LPS pro 1 ml Komplettmedium stimuliert.
3.4.8 Bestimmung der Zellviabilität
Die Bestimmung der Zellviabilität wurde mit einem kommerziell erhältlichen Assay durchgeführt (CellTiter 96® AQeous One Solution Cell Proliferation Assay). Das Prinzip dieses Assays beruht darauf, dass eine MTS-Tetrazolium-Verbindung von lebenden, metabolisch aktiven Zellen zu einem Formazanprodukt reduziert wird. Dieses Formazanprodukt ist im Zellkulturmedium löslich. Nach einer Inkubationszeit kann die
Absorption dieses Formazanproduktes mit Hilfe eines Wellenlängen-Detektionsgerätes gemessen werden.
Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Kits durchgeführt. Die Inkubationszeit betrug 1 h, und die Lichtabsorption wurde mit dem Dynatech Laboratories MRX Microplate Reader gemessen.
3.4.9 Messung von Interleukin-6 (IL-6) im Zellkulturüberstand
Die quantitative IL-6-Bestimmung aus den Zellkulturüberständen erfolgte jeweils über einen Sandwich-ELISA mit kommerziell erhältlichen Kits (DuoSet® ELISA human IL-6 und DuoSet® ELISA rat IL-6). Die Durchführung beider ELISAs funktioniert nach dem gleichen Prinzip, deswegen werden sie im Folgenden gemeinsam beschrieben. Durch enzymatische Reaktion kommt es zu einer Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge. Diese Absorption wird mittels eines Detektionsgerätes gemessen und über die Intensität der IL-6-Gehalt quantifiziert.
Die ELISAs wurden gemäß den Anweisungen der Kits durchgeführt. Für die Messung einer Probe wurden 100 µl des Zellkulturüberstandes benötigt und die Lichtabsorption wurde mit dem Dynatech Laboratories MRX Microplate Reader gemessen.