Die Daten dieser Doktorarbeit liefern einen weiteren Beweis für eine wahrscheinlich speziesspezifische PDE4-Inhibitor-induzierte IL-6-Ausschüttung, an welcher Endothelzellen beteiligt sind (In-vitro-Ergebnisse). Zusätzlich konnte eine zumindest partielle Beteiligung von IL-6 an der Pathogenese toxikologischer Befunde, induziert durch einen PDE4-Inhibitor, bei der Ratte nachgewiesen werden (In-vivo-Ergebnisse).
Um an diese Ergebnisse weiter anzuknüpfen, könnte ein In-vitro-Versuch mit Primärzellkulturen aus Endothelzellen von beispielsweise Rattenaorten durchgeführt werden. Es wurde in vitro gezeigt, dass Endothelzellen eine Rolle bei der substanzinduzierten IL-6-Ausschüttung spielen, und in vivo wurde das Mesenterium als sehr empfindliches Gewebe herausgestellt. Eine Veröffentlichung zeigt, dass der PDE4-Inhibitor CI-1044 Blutflussänderungen in mesenterialen Gefäßen verursachen kann (KORKMAZ et al. 2009). Es ist zu vermuten, dass diese Blutflussänderungen nicht erst im Mesenterium ihren Ursprung nehmen. Da die mesenterialen Gefäße aus der Aorta entspringen, wäre man mit Endothelzellen der Aorta viel näher am Ort des eigentlichen vermuteten Geschehens in vivo. Neben IL-6 könnten dann auch andere Zytokine gemessen werden, wie zum Beispiel GRO/CINC-1 (Homolog zum humanen IL-8). Es wurde ein moderater Roflumilast-induzierter (10 - 100 µmol/l) Anstieg der IL-8-Ausschüttung von HUVEC in vitro gezeigt (MCCLUSKIE et al. 2006), außerdem war dieses Zytokin in vivo 4 h nach Gabe des PDE4-Inhibitors SCH 351591 bei Ratten erhöht (WEAVER et al. 2010).
Ein weiterer Ansatz wäre die Messung, ob BYK199404 ebenfalls zu Bluttflussveränderungen am Mesenterium führt, wie dies für CI-1044 festgestellt wurde (KORKMAZ et al. 2009). In dem Zuge wäre auch eine Messung der
Blutflussgegebenheiten an der Aorta, als Ursprungsgefäß, und an der A. testicularis, da die männlichen Geschlechtsorgane ein weiteres sensibles Organsystem für PDE4-Inhibitor-induzierte Veränderungen darstellen, interessant. Würde man darüber hinaus den PDE4-Inhibitor-induzierten Veränderungen der Hämodynamik medikamentös entgegenwirken, könnte man prüfen, ob die toxikologischen Befunde und die Blutflussveränderungen tatsächlich im Zusammenhang stehen. Auch ein Anknüpfen an die Befunde mit der IgG-Isotypkontrolle wäre eine Idee für einen Folgeversuch. Durch IgG konnten die PDE4-Inhibitor-induzierten toxikologischen Befunde nahezu ebenso vermindert werden wie durch den Anti-IL-6-AK. In Kapitel 5.5.2 wurde beschrieben, dass die Fc-Untereinheit eine Rolle bei der anti-inflammatorischen Wirkweise spielt (DEBRE et al. 1993; SAMUELSSON et al. 2001; KANEKO et al. 2006b). Vielleicht kann bei dem hier vorliegenden Geschehen die alleinige Verabreichung der Fc-Untereinheit des IgG die toxikologischen Befunde ebenfalls vermindern.
Auf Grund der scheinbar multifaktoriellen Pathogenese der PDE4-Inhibitor-induzierten inflammatorischen Läsionen kann davon ausgegangen werden, dass es keinen alleinigen Hauptvermittler dieser vermutlich speziesspezifischen toxikologischen Effekte bei der Ratte gibt. Bezüglich der Humanrelevanz der in suprapharmakologischen Dosierungen auftretenden toxikologischen Befunde kann auf Basis der In-vitro-Ergebnisse lediglich angenommen werden, dass IL-6 beim Menschen keine Rolle spielt.
6 Zusammenfassung
Sabine Tippelt
Untersuchung der Pathogenese der möglicherweise speziesspezifischen toxikologischen Effekte von PDE4-Inhibitoren bei Ratten
PDE4-Inhibitoren führen nach Gabe suprapharmakologischer Dosierungen bei Ratten zu entzündlichen Gewebe- und Gefäßläsionen, deren Humanrelevanz unbekannt ist. In der Ratte erwiesen sich vor allem das Mesenterium aber auch die männlichen Geschlechtsorgane als sehr sensitiv für die PDE4-Inhibitor-induzierte Organtoxizität.
Weiterhin zeigen sich entzündliche Blutparameterveränderungen, wobei IL-6 bei der Ratte offenbar eine größere Rolle spielt. Neben einem PDE4-Inhibitor-induzierten IL-6-Anstieg in vivo, wurde eine rattenspezifische IL-6-Ausschüttung nach Stimulation von Vollblut verschiedener Tierarten gezeigt. Aus diesen Gründen richtete sich der Fokus der vorliegenden Arbeit über die möglicherweise speziesspezifischen toxikologischen Effekte von PDE4-Inhibitoren bei Ratten auf das IL-6.
Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Rolle von IL-6 bei der Ratte an den durch PDE4-Inhibitoren herbei geführten entzündlichen Läsionen weiter aufzudecken, mit dem Endziel einen Beitrag zur Bewertung der Humanrelevanz der toxikologischen Befunde zu leisten. Dazu wurden eine In-vitro-Studie und mehrere In-vivo-Studien durchgeführt.
In der In-vitro-Studie wurden Endothelzellen von Mensch (HUVEC) und Ratte (RBE4) bezüglich Zellviabilität und IL-6-Ausschüttung nach Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen (0,001 - 10 µmol/l) des hier verwendeten PDE4-Inhibitors BYK199404 miteinander verglichen. Es wurden speziesspezifische Unterschiede deutlich, die RBE4-Zellen zeigten sich empfindlicher als die HUVEC. Dies äußerte sich in einer statistisch signifikant verminderten Zellviabilität der RBE4-Zellen als Reaktion auf hohe Konzentrationen BYK199404. Lediglich bei einer Konzentration von 0,01 µmol/l trat auch bei den HUVEC eine statistisch signifikant verminderte Zellviabilität auf. Die
IL-6-Konzentration war nur bei den RBE4-Zellen im Zellkulturüberstand erhöht, bei den HUVEC hingegen konnte keine IL-6-Ausschüttung durch BYK199404 induziert werden.
In den In-vivo-Studien wurde BYK199404 bei Wistar-Han-Ratten eingesetzt. Im ersten Studienabschnitt wurde nach einer vorangegangenen Dosis-Findung ein IL-6-Profil erstellt, um die IL-6-Ausschüttung als Reaktion auf BYK199404 auch in vivo zu bestätigen. Es erhielten 2 Gruppen von Tieren 1 oder 4 Applikationen BYK199404 (0,6 mg/kg/d), und die IL-6-Plasmakonzentration wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der jeweils letzten Applikation gemessen. Es zeigten sich IL-6-Werte von im Mittel 150 pg/ml, wobei die Plasmakonzentrationen 2 - 8 h nach der jeweils letzten Applikation am deutlichsten erhöht waren. Im zweiten Studienabschnitt wurden die BYK199404-induzierten toxikologischen Befunde zeit- und dosisabhängig charakterisiert. Dazu erhielten die Tiere 1, 4 oder 11 Applikationen mit verschiedenen Dosierungen BYK199404 (0,2 und 0,6 mg/kg/d). Es wurden Allgemeinbefinden, verschiedene Blutparameter, die Expression unterschiedlicher Gene sowie histopathologisch das Mesenterium und die männlichen Geschlechtsorgane untersucht. Die toxikologischen Befunde nahmen in Abhängigkeit von der Zeit zu, wobei hauptsächlich die mit der hohen Dosis behandelten Tiere Veränderungen zeigten. Als sehr sensitive Parameter stellten sich hierbei Haptoglobin, Fibrinogen, die Timp-1-Genexpression sowie histopathologische Veränderungen in Mesenterium und männlichen Geschlechtsorganen heraus. Der dritte Studienabschnitt verfolgte das Ziel, eine Antagonisierung des IL-6 herbeizuführen und somit die durch BYK199404 auftretenden toxikologischen Befunde zu vermindern oder sogar zu verhindern. Dazu wurden in zwei Interventionsstudien BYK199404 (0,6 mg/kg/d) und ein Anti-IL-6-AK (2, 5 und 15 µg/Tier/d) parallel verabreicht. Neben dem Anti-IL-6-AK wurde auch die IgG-Isotypkontrolle (5 und 15 µg/Tier/d) simultan zu BYK199404 verabreicht, um falsch positive Befunde durch den Antikörper-Isotyp auszuschließen. Bei beiden Interventionsstudien führte die parallele Gabe von Anti-IL-6-AK und BYK199404 zu einer gering- bis mittelgradigen Verminderung der substanzinduzierten toxikologischen Befunde. Neben dem Anti-IL-6-AK konnte aber auch die zusätzlich zur Substanz
verabreichte IgG-Istoypkontrolle in der Interventionsstudie II eine Verminderung der substanzinduzierten toxikologischen Befunde bewirken. Dabei war der Effekt des Anti-IL-6-AKs mit dem der IgG-Isotypkontrolle vergleichbar. Nur bei den histopathologischen Befunden der männlichen Geschlechtsorgane erwies sich die hohe Dosierung des Anti-IL6-AKs effektiver als die der IgG-Isotypkontrolle.
Die Daten dieser Doktorarbeit liefern einen weiteren Beweis für eine wahrscheinlich rattenspezifische PDE4-Inhibitor-induzierte IL-6-Ausschüttung, an welcher Endothelzellen beteiligt sind (In-vitro-Ergebnisse). Zusätzlich konnte eine zumindest partielle Beteiligung von IL-6 an der Pathogenese toxikologischer Befunde, induziert durch einen PDE4-Inhibitor, bei der Ratte nachgewiesen werden (In-vivo-Ergebnisse).
Auf Grund der scheinbar multifaktoriellen Pathogenese der PDE4-Inhibitor-induzierten inflammatorischen Läsionen kann man annehmen, dass es keinen alleinigen Hauptvermittler dieser vermutlich rattenspezifischen toxikologischen Effekte gibt.
Bezüglich der Humanrelevanz der in suprapharmakologischen Dosierungen auftretenden toxikologischen Befunde kann auf Basis der In-vitro-Ergebnisse lediglich angenommen werden, dass IL-6 beim Menschen keine Rolle spielt.
7 Summary
Sabine Tippelt
Investigation of the pathogenesis of the possibly species-specific toxic effects of PDE4 inhibitors in rats
Inflammatory changes of organs and blood vessels are caused by toxic doses of PDE4 inhibitors in different animal models. The relevance of these changes for humans is unknown. In the rat, a species shown to express inflammatory changes, the mesentery and the male reproductive organs are targets for PDE4 inhibitor induced organ toxicity.
Moreover blood parameter changes could be found and IL-6 apparently plays a major role in inflammation in the rat. Beside the IL-6 elevation in vivo, an IL-6 elevation could only be found in vitro after stimulation of whole blood from rats with a PDE4 inhibitor, but not in whole blood from monkey or human. These are the reasons to direct the focus within this work to the possible species-specific toxic side effects related to IL-6.
The aim of this doctoral thesis is to further investigate the role of IL-6 for the PDE4 inhibitor species-specific toxic lesions, and to make a contribution to assess the relevance for humans.
One in vitro study and several in vivo studies were carried out to reach this aim.
For the in vitro study endothelial cells from human (HUVEC) and rat (RBE4) were compared after stimulation with different doses (0.001 - 10 µmol/l) of the PDE4 inhibitor BYK199404 and their reactions were measured with reference to cell viability and IL-6 production. The results showed species-specific differences. The RBE4 cells were more sensitive to BYK199404 than the HUVEC. This became apparent in a statistically significant lower cell viability of the RBE4 cells after incubation with the higher concentrations of BYK199404. The HUVEC only showed a statistically significant lower cell viability at a concentration of 0.01 µmol/l. An increased IL-6 concentration could only be measured in the cell culture supernatant of the RBE4 cells. On the contrary no IL-6 production of the HUVEC was induced by BYK199404.
BYK199404 was administered orally to Wistar Han rats in the in-vivo-studies.
After performing a dose range finding study, an IL-6 profile measurement was carried out to demonstrate an IL-6 increase in vivo in the first phase. Two groups of rats received 1 or 4 administrations of BYK199404 (0.6 mg/kg/d), and the IL-6 plasma concentrations were measured at different time points after the last administration. The results showed an increase of IL-6 at the average of 150 pg/ml and elevations of IL-6- plasma concentrations were clearly seen between 2 - 8 h after the last administration.
The second phase consisted of a time and dose dependent characterization of BYK199404 induced toxic findings. The rats received 1, 4 or 11 oral administrations with different doses of BYK199404 (0.2 und 0.6 mg/kg/d). An analysis of general condition, different blood parameters, expression of variable genes and a histopathological evaluation of the mesentery as well as male reproductive organs was carried out. The results revealed an increase of toxic findings in a time dependent manner and these changes were mostly seen in animals treated with the high dose. Very sensitive parameters were haptoglobin, fibrinogen, Timp-1 gene expression and histopathologic changes in mesentery and male reproductive organs.
The aim of the third phase was to antagonize the IL-6 to decrease or eliminate the BYK199404 induced toxicity. Therefore two interventional studies were carried out in which BYK199404 (0.6 mg/kg/d) and an anti-IL-6 antibody (2, 5 und 15 µg/animal/d) were administered simultaneously. In addition to the anti-IL-6 antibody the IgG isotype control was also administered concurrently with BYK199404 to eliminate false positive findings. The concomitant gavages of BYK199404 and the anti-IL-6 antibody led to mild and moderate decreases in the toxic findings in both interventional studies. But also the concomitant gavage of BYK199404 and the IgG isotype control was able to reduce the substance induced toxic findings. The effectiveness of the anti-IL-6 antibody and the IgG isotype control was comparable, but for the histopathological findings at the male reproductive organs the high dose of the anti-IL-6 antibody was more effective than the IgG isotype control.
The data of this doctoral thesis provide evidence for a probable species-specific PDE4 inhibitor induced IL-6-production with an involvement of endothelial cells (in-vitro-results). Furthermore at least a partial involvement of IL-6 for the BYK199404 induced toxic changes could be shown (in-vivo-results). Because of the apparently multifactorial pathogenesis of the inflammatory lesions induced by PDE4 inhibitors there is probably no single responsible cause for the rat specific inflammatory changes. With regard to the relevance of the toxic effects for humans and based upon the obtained in-vitro-results, it seems that IL-6 did not play a role in humans.
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