Abschlussarbeit
Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz Universität Leipzig
Thema:
Speichel als alternative Matrix zum Drogenscreening bei opiatabhängigen Patienten in Substitutionstherapie
Dipl.-Ing. (FH) Stefan Lierheimer Dessau-Roßlau, Dezember 2014
Inhaltsverzeichnis
SeiteDeckblatt 1
Inhaltsverzeichnis 2-3
1 Einleitung 4
1.1 „Vertrauen ist gut, Kontrolle ist besser“ 4
1.2 Analytische Möglichkeiten 4
2 Ziel dieser Arbeit 5
2.1 Allgemeine Vorgaben 5
2.2 Bisheriges Vorgehen 5-6
2.3 Vorüberlegungen 6-7
3 Vorüberlegungen zur Wahl der Matrix 7
3.1 Probennahme 7
3.2 Probentransport und Lagerung 7-8
3.3 Probenintegrität 8-9
3.4 Analyse 9-10
4 Wahl der Matrix 10-11
4.1 Alternative Matrizes 11
4.1.1 Kopfhaar 11
4.1.2 Schweiß 12
4.1.3 Kapillarblut 12-13
4.1.4 Speichel 13-14
4.2 Speichel im Vergleich zu Blut oder Urin 14 4.2.1 Probennahme und Stabilität der Analyten 14
4.2.1.1 Blut 14-15
4.2.1.2 Urin 15
4.2.1.3 Speichel 15
4.2.2 Analyten und zu erwartende Konzentrationen 15
4.2.2.1 Blut 15-16
4.2.2.2 Urin 16
4.2.2.3 Speichel 16
4.3 Begründung für die Wahl der Matrix Speichel als Alternative 16
5 Die Matrizes Urin und Speichel 17
5.1 Matrix Urin 17
5.2 Matrix Speichel 17-19
6 Analytische Vorgaben für die Speichelanalytik 19
6.1 Auswahl der Analyten 19-20
6.2 Cutoffkonzentration 21-22
7 Material und Methoden 22
7.1 Immunchemische Verfahren 22
7.1.1 Überblick 22-23
7.1.2 Verwendete Tests für die Speichelproben 23 7.1.2.1 Greiner Bio-One Speichelquantifizie- 23 rungskit (Greiner Bio-One GmbH,
Kremsmünster, Österreich)
7.1.2.2 Amylase (Beckmann Coulter, Krefeld) 23-24 7.1.3 Verwendete Tests für die Urinproben 24
7.1.3.1 DRI Creatinine-Detect-Test (Thermo 24 Scientific, Passau)
7.1.3.2 CEDIAAmphetamin/Ecstasy-Assay 24-25 (Thermo Scientific, Passau)
7.1.3.3 CEDIABenzodiazepin-Assay (Thermo 25 Scientific, Passau)
7.1.3.4 CEDIACocaine Test (Thermo Scientific, 25 Passau)
7.1.3.5 DRIOpiat-Assay (Thermo Scientific, 26 Passau)
7.1.3.6 CEDIAMethadon-Metabolit (EDDP) 26 Assay (Thermo Scientific, Passau)
7.2 Entnahmesystem für die Speichelanalyse 26-30
7.3 LC/MS-MS 31
7.3.1 Analysensystem 31-34
7.3.2 Reagenzien und Standards 34-35
7.3.3 Kalibration und Qualitätssicherung 35-36
7.3.4 Extraktionssäulen 36
7.3.5 Probenvorbereitung 36-38
8 Patientenproben 38
8.1 Vergleich des bestehenden immunchemischen Urinscreenings 38-39 mit dem LC-MS/MS-screening im Speichel
8.2 Urinproben 39
8.3 Speichelproben 39-40
9 Ergebnisse 40
9.1 Urinproben 40
9.2 Speichelproben 40-42
10 Diskussion 42-44
11 Quellen 45-50
1 Einleitung
1.1 "Vertrauen ist gut, Kontrolle ist besser"
Die Anzahl der gemeldeten Substitutionspatienten in Deutschland stieg zwischen 2002 und 2010 von 46000 auf 77400 [1]. Die Verteilung der verwendeten Substitutionsmittel für die Patienten am 01.07.2010 war Methadon (57.7%), Levomethadon (23.0%), Buprenorphin (18.6), Dihydrocodein (0.3%), Diamorphin (0.3%) und Codein (0.1%) [2]. Gemäß der “Verordnung über das Verschreiben, die Abgabe und den Nachweis des Verbleibs von Betäubungsmitteln (Betäubungsmittel-Verschreibungsverordnung - BtMVV)” gilt unter anderem folgendes:
(2) Für einen Patienten darf der Arzt ein Substitutionsmittel unter der Voraussetzung des § 13 Abs. 1 des Betäubungsmittelgesetzes verschreiben, wenn und solange
4. die Untersuchungen und Erhebungen des Arztes keine Erkenntnisse ergeben haben, dass der Patient
c) Stoffe gebraucht, deren Konsum nach Art und Menge den Zweck der Substitution gefährdet.
Für die Erfüllung der Zulässigkeitsvoraussetzungen nach Nummer 4 Buchstabe c ist der allgemein anerkannte Stand der medizinischen Wissenschaft maßgebend.
d) das ihm verschriebene Substitutionsmittel nicht bestimmungsgemäß verwendet [3].
Die Durchführung der Substitution, sowie die Anforderungen an den substituierenden Arzt sind zudem in Richtlinien der Bundesärztekammer und der Deutschen Gesellschaft für Suchtmedizin e.V. geregelt [4] [5].
1.2 Analytische Möglichkeiten
Die analytischen Möglichkeiten zur Sicherstellung der oben angegebenen rechtlichen Vorgaben reichen gegenwärtig von relativ einfachen immunchemischen Urinteststreifen, die im akuten Verdachtsfall schnell Ergebnisse liefern, über instrumentenbasierende Immunoassays, die häufig eine unspezifische Übersicht der konsumierten Stoffe geben, dafür jedoch schnell durchzuführen und preiswert sind, bis zu sehr spezifischen Analysenmethoden wie die Flüssig- oder Gaschromatographie, gekoppelt mit einem Massenspektrometer, was eine eindeutige Identifizierung der eingenommenen Substanzen erlaubt.
2 Ziel dieser Arbeit
2.1 Allgemeine Vorgaben
Ziel dieser Arbeit ist es dem substituierenden Arzt eine mindestens gleichwertige Alternative zu der in unserem Labor eingesetzten immunchemischen Urinanalyse zu geben. Dies beinhaltet zum Einen die instrumentelle Analytik die es eventuell erlaubt mehr Informationen über die vom Patienten eingenommenen Drogen und Medikamente zu erhalten. Zum Anderen muss auch die Entnahme der Probe, die in der Arztpraxis durchgeführt wird, berücksichtigt werden. Es sollte geprüft werden ob die Probennahme für den Patienten und die Mitarbeiter der Arztpraxis einfacher, schneller und angenehmer durchgeführt werden kann. Das Ziel des Labors ist ebenfalls eine schnellere und kostengünstigere Analyse, aber vor allem auch eine höhere Flexibilität um auf Veränderungen des Konsumverhaltens der Patienten zu reagieren. Dabei ist zu berücksichtigen, dass für viele missbrauchsrelevante Substanzen die in den letzten Jahren zum Spektrum der konsumierten Drogen hinzugekommen sind, keine immunchemischen Testverfahren zur Verfügung stehen. Hier sind vor allem die sogenannten "Designerdrogen" aus dem Bereich der Phenylethylamine, Tryptamine, Piperazine, Cathinone, die synthetischen Cannabinoide, sowie die Opioide zu nennen [6] [7]. Um das Ziel einer Alternative zum Urindrogenscreening zu erreichen bedarf es der Auswahl einer geeigneten Probenmatrix. Abhängig von der Probenmatrix muss eine angemessene Analytik, die es erlaubt der Matrix Urin vergleichbare Nachweisfenster für einen kürzlichen Konsum bzw. Missbrauch relevanter Drogen oder Medikamente zu erhalten, etabliert werden. Die Praktikabilität des Analysensystems erfordert zusätzlich die Berücksichtigung der Analysenzeit, sowie der entstehenden Kosten.
2.2 Bisheriges Vorgehen
Routinemäßig gewonnene Urinproben von Patienten in Substitutionstherapie werden in unser Labor geschickt. Mit Hilfe von Immunoassays wird der Patient auf die sogenannte "Compliance" getestet. Compliance bedeutet, dass sich der Patient bezüglich der Einnahme seines Substituts und der Einnahme von Medikamenten an die therapeutischen Vorgaben seines behandelnden Arztes hält. Ein Patient der sich hingegen "Non-Compliant" verhält weist einen sogenannten "Beikonsum"
zusätzlicher Substanzen entgegen den rechtlichen Vorgaben aus Punkt 1.1 auf, ohne dies dem Arzt mitzuteilen, und gefährdet somit seine Therapie. Darüber hinaus kann der Patient, wenn die Abnahme der Probe nicht unter Aufsicht erfolgt, eine Fremdprobe oder eine manipulierte Probe abgeben um diese Non-Compliance zu verschleiern. Im Falle eines positiven Screeningergebnisses hat der Arzt die Möglichkeit eine Bestätigung des Immunoassayergebnisses anzufordern. Bei
positiven Gruppentesten die beispielsweise für Benzodiazepine zur Verfügung stehen kann durch eine Differenzierung festgestellt werden welche Benzodiazepine der Patient eingenommen hat.
2.3 Vorüberlegungen
Um nun das immunchemische Drogenscreening im Urin mit nachfolgender Bestätigung oder Differenzierung, wie es in unserem Labor durchgeführt wird, abzubilden, beziehungsweise zu verbessern sind einige Überlegungen erforderlich.
Es gilt zu klären, ob die Matrix Urin weiterhin verwendet werden soll, oder ob alternative Matrizes zur Verfügung stehen. Aus der Sicht des Arztes muss geklärt werden, ob die alternative Matrix den gleichen oder eventuell sogar weniger Arbeitsaufwand bedeutet. Darüber hinaus muss geklärt werden ob bzw. welche Möglichkeit der Patient hat, die Probe zu manipulieren, um seinen Beikonsum oder seine Non-Compliance zu verschleiern. Aus analytischer Sicht sind Urinproben problematisch, da die Menge der Matrixbestandteile von Probe zu Probe eine relativ hohe Variabilität aufweist (siehe 5.1). Dies kann zu sogenannten
"Matrixeffekten" bei der Analyse führen [8]. Dadurch kann beispielsweise bei einer Flüssigchromatographischen Trennung gekoppelt mit Massenspektrometrie die Sensitivität für einzelne Analyten verringert werden, was zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Es besteht auch die Möglichkeit dass Matrixbestandteile beispielsweise in immunchemischen Analysen kreuzreagieren und so falsch positive Ergebnisse erzeugen [9]. Durch eine Probenvorbereitung, wie sie für chromatographische Verfahren meistens durchgeführt wird, lassen sich Matrixbestandteile von der zu analysierenden Probe trennen, jedoch müssen hier der Zeitaufwand und die Materialkosten berücksichtigt werden. Eine alternative Matrix sollte deshalb möglichst wenige Matrixbestandteile beinhalten bzw. es sollte einfach möglich sein, diese von den Analyten zu trennen. Ein weiterer Punkt ist die Entscheidungsgrenze für ein Drogenscreening, die "Cutoff" genannt wird.
Konzentrationen die unterhalb des Cutoff liegen, werden als negativ bewertet. Für ein immunchemisches Screening im Urin sind diese Cutoffwerte willkürlich gewählt und orientieren sich an der Sensitivität der Analyse und der Vermeidung falsch positiver Ergebnisse. Die Nachweisfenster im Urin hängen von den Cutoffwerten ab und sind sehr variabel, da sie durch Flüssigkeitsaufnahme des Patienten stark beeinflusst werden [10]. Das Nachweisfenster gibt an wie lange ein Patient nach der Einnahme einer Substanz positiv auf diese Einnahme getestet werden kann. Um dem substituierenden Arzt eine gleichwertige Analyse zum immunchemischen Urinscreening zur Verfügung zu stellen ist es notwendig bei der Wahl einer Alternativmatrix die Cutoffwerte an den Nachweisfenstern für einzelne Drogen oder Medikamente zu orientieren. Bei der Wahl einer alternativen Matrix muss deshalb auch berücksichtigt werden, ob Analysensysteme zur Verfügung stehen um die notwendige Sensitivität zu erreichen. Während Immunoassays für
Urin eine ausreichende Sensitivität aufweisen sind bei anderen Körperflüssigkeiten, aufgrund der zum Teil erheblich niedrigeren Konzentrationen, aufwendigere Analysensysteme notwendig um eine Einnahme von Drogen oder Medikamenten genauso lange nachzuweisen. Neben der Sensitivität muss auch die Selektivität berücksichtigt werden. Immunchemische Verfahren können teilweise sehr selektiv sein, wie dies bei THC und Kokain der Fall ist, unspezifische Teste die auf mehrere Analyten aus der Gruppe der Opiate, Amphetamine oder Benzodiazepine reagieren, lassen hingegen keine Identifizierung eines Analyten zu. Eine nachfolgende Differenzierung positiver immunchemischer Ergebnisse ist in solchen Fällen immer notwendig. Der zeitliche, materielle und personelle Aufwand zur Bearbeitung der Proben muss ebenfalls berücksichtigt werden.
3 Vorüberlegungen zur Wahl der Matrix
Als biologische Matrix im klinischen Labor werden alle Komponenten und Bestandteile die neben dem Analyten in einer Probe vorhanden sind bezeichnet.
Einige Beispiele hierfür die auch als Gegenstand toxikologischer Untersuchungen eingesetzt werden, sind Urin, Blut, Haare und Speichel. Dabei zählen auch stabilisierende Komponenten die in vitro zur Probe gelangen, wie Pufferlösungen, zur Matrix. Die Wahl der Probenmatrix hängt ab von der Probennahme, dem Probentransport, der Lagerung vor und nach der Analyse, sowie der analytischen Untersuchung.
3.1 Probennahme
Faktoren die bei der Probennahme relevant sind, sind der Zeitaufwand um die Probe zu gewinnen, wie fehlerbehaftet, bzw. wie einfach zu bedienen das verwendete Probenentnahmesystem ist, ob die Probennahme invasiv ist, inwieweit die Gewinnung der Probe die Intimsphäre des Patienten verletzt, ob die Probe von medizinisch geschultem oder auch ungeschultem Personal gewonnen werden kann und wie hoch die Kosten für die Einzelprobe sind. Bei Patienten in Substitutionstherapie erfolgt die Probennahme unter Aufsicht um die Abgabe einer Fremdprobe, oder eine Probenmanipulation, wie Verdünnen der Probe mit Wasser, zu verhindern.
3.2 Probentransport und Lagerung
Beim Probentransport und bei der Lagerung ist es wichtig Informationen über die Stabilität und den eventuellen Abbau der zu untersuchenden Analyten, aber auch der Matrix und deren Stabilität unter den gegebenen Umweltbedingungen zu besitzen. Abbauprodukte von Matrixbestandteile die während des Transports und
der Lagerung entstehen können eventuell die Analysenergebnisse durch die oben beschriebenen Matrixeffekte auf andere Art beeinflussen, als dies bei einer frisch abgenommenen Probe der Fall ist. Zu den Faktoren die einen solchen Abbau beeinflussen bzw. verursachen können, zählen die Umgebungstemperatur, ob die Probe lichtgeschützt sein muss und ob die Probe steril ist. Bei der Stabilität der Analyten muss berücksichtigt werden, ob die Analyse möglichst zeitnah durchgeführt werden muss, oder ob eine längere Lagerung, unter geeigneten Bedingungen wie Einfrieren, keinen merklichen Einfluss auf die Analytkonzentrationen besitzt. Zusätzlich sind vor allem auch stabilisierende Maßnahmen der Hersteller von beispielsweise Speichelentnahmesystemen, wie Zusätze in Form von Puffern oder Salzen zu berücksichtigen, da auch diese Einfluss auf die Analyten oder Matrix haben können. Das Ziel solcher Puffer ist zum einen eine Verringerung der Variabilität der einzelnen Proben, z. B. durch Einstellung auf einen festen pH-Wert. Zusätzlich können auch konservierende Stoffe zugesetzt werden um ein Bakterienwachstum zu vermeiden, da auch diese durch Stoffwechselprozesse Matrixbestandteile und Analyten umwandeln können.
Urin der im Bereich der Drogen- und Medikamentenanalytik von Substitutions- patienten gewonnen wird, unterliegt keinen stabilisierenden Maßnahmen [11] [12].
Die entsprechenden Analysenergebnisse stellen eine Momentaufnahme der Probe zum Zeitpunkt der Analyse dar. Niedrige Analytkonzentrationen können dadurch falsch negativ werden, obwohl die Probe bei der Abnahme, eventuell mit Hilfe einer Teststreifenmessung, ein positives Ergebnis aufweist.
3.3 Probenintegrität
Zur Gewährleistung der Probenintegrität ist eine sogenannte "Perianalytik" an der Probe durchzuführen. Sie dient der Feststellung einer Probenmanipulation durch den Probanden. Eine Möglichkeit ist hier die Zugabe von haushaltsüblichen Stoffen wie Seife oder Essig [13]. Diese können während der Probenvorbereitung und bei der Analytik stören. Analyten die z. B. unter bestimmten pH-Bedingungen abgebaut werden, können so dem Nachweis entzogen werden. Neben dem Abbau kann beispielsweise bei immunchemischen Verfahren, durch manipulativ zur Probe gegebene Stoffe [13], eine Störung der Antigen-Antikörper-Reaktion (siehe 7.1.1) ein falsch negatives Ergebnis verursachen. Das Verdünnen der Probe mit Wasser ist eine weitere Manipulationsmöglichkeit. Dabei wird eine Verringerung der Analytkonzentration erreicht, so dass ein falsch negatives Ergebniss entsteht [13].
Die Durchführung der Perianalytik beinhaltet eine visuelle und olfaktorische Prüfung der Probe. Darüber hinaus können die Konzentrationen einzelner Matrixbestandteile wie z. B. das Kreatinin oder der pH-Wert in Urinproben bestimmt werden. Anhand von festgelegten Normbereichen können Probenauffälligkeiten in der Befundbeurteilung berücksichtigt werden. Beim Kreatinin im Urin gibt es beispielsweise Grenzwerte (siehe Punkt 5.1), um zu
prüfen ob die Probe durch Trinken oder nachträgliche Verdünnung manipuliert wurde. Wird eine bestimmte Kreatininkonzentration unterschritten wurde die Probe mit hoher Wahrscheinlichkeit nach der Abnahme mit einer Flüssigkeit verdünnt.
3.4 Analyse
Die Analyse im Bereich der Drogen- und Medikamentenanalytik ist der qualitative bzw. quantitative Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer Probe. Die Analyse beinhaltet, falls erforderlich, eine Probenvorbereitung. Dies kann zum Beispiel bei chromatographischen Verfahren eine Extraktion sein um Matrixbestandteile zu entfernen oder eine Verdünnung der Probe um die Konzentration der Matrixbestandteile zu verringern. Dabei muss berücksichtigt werden, dass bei einer Extraktion neben der Matrix auch Teile des Analyten verloren gehen können. Um ein optimales Analysenergebnis zu erhalten sollte möglichst viel von der Matrix entfernt werden und zugleich der größte Teil des Analyten in der Probe erhalten bleiben. Bei immunchemischen Verfahren ist im Regelfall keine Probenvorbereitung notwendig.
Im Anschluss erfolgt die Detektion. Bei chromatographischen Systemen, erfolgt vor der Detektion eine chromatographische Trennung der Probe. Dadurch werden Analyten und Matrixbestandteile zeitlich getrennt, um eine Substanz möglichst ohne Störeinflüsse anderer Substanzen zu vermessen. Bei der Detektion selbst wird in Abhängigkeit von der Art des Detektors ein elektrisches Signal erzeugt, das äquivalent zur Analytkonzentration in der Probe ist. Mit Hilfe einer vorher durchzuführenden Kalibration wird eine Eichkurve erzeugt. Dazu werden analytfreie Matrixproben mit definierten Konzentrationen des Zielanalyten versetzt.
In der Eichkurve werden diesen definierten Konzentrationen definierte elektrische Signale zugeordnet.
Der wichtigste Punkt für die Auswahl des Analysensystems ist die Fragestellung die mit der Analyse beantwortet werden soll. Im Bereich der Drogen- und Medikamentenanalytik kann dies beispielsweise eine Spiegelbestimmung eingenommener Medikamente sein. Dies soll eine Über- bzw. Unterdosierung ausschließen. Eine Überdosierung kann zu körperlichen Schädigungen bis hin zur Vergiftung bzw. dem Tod des Patienten führen. Eine Unterdosierung hingegen führt zur Unwirksamkeit des Medikaments. Die für diese Arbeit relevante Fragestellung betrifft die oben beschriebene Compliancetestung von Substitutionspatienten. Zum einen beinhaltet sie den Nachweis der Einnahme des Substitutionsmittels und der vom Arzt zusätzlich verschriebenen Medikamente.
Zum Anderen beinhaltet sie die eventuelle Einnahme von weiteren Drogen und Medikamenten. Sollte die Einnahme weiterer Drogen und Medikamente erfolgen, gefährdet dies die Substitutionstherapie, da der Arzt nicht mit entsprechenden Maßnahmen, wie erhöhte Dosierung des Substituts oder erweiterten psychologischen Betreuung, auf die Bedürfnisse des Patienten, reagieren kann. Für
die Entwicklung der Analytik stellt sich die Aufgabe ein möglichst großes Spektrum an Substanzen nachzuweisen. Ein wichtiges Problem das hier für Immunchemische Verfahren auftaucht, ist die Anzahl der Analysen. Während bei chromatographischen Verfahren viele Analyten verschiedener Analytgruppen innerhalb eines Analysenlaufes nachgewiesen werden können, müssen bei immunchemischen Verfahren mehrere Teste durchgeführt werden. Es gibt zwar Gruppenteste die den Nachweis mehrerer Analyten einer Analytgruppe wie Benzodiazepine, Amphetamine und Opiate erlauben, jedoch reagieren hier nicht alle Analyten im gleichen Maße. Der Cutoff gilt streng genommen nur für die
"Leitsubstanz" mit welcher der Test kalibriert wurde. Des Weiteren entgeht dem Arzt bei positiven Gruppentesten die Information welcher Analyt, bzw. welche Analyten das positive Ergebnis erzeugen. Darüber hinaus kann es zu falsch negativen bzw. falsch positiven Befunden kommen, wenn die Kreuzreaktivität (siehe 7.1.1) des Analyten erheblich von der Kreuzreaktivität der Leitsubstanz nach oben oder nach unten abweicht. Dies macht eine weiterführende Analytik zur Differenzierung des Screeningergebnisses notwendig, die den Kostenaufwand erhöht.
Die Analytkonzentrationen können in verschiedenen Matrizes sehr unterschiedlich sein, was unterschiedliche Anforderungen an die Sensitivität des Analysensystems richtet. Immunchemische Verfahren haben eine ausreichende Sensitivität für die Urinanalytik, da sie für diese entwickelt wurden. Es ist jedoch nicht praktikabel diese bedenkenlos für andere Matrizes wie Blut oder Speichel einzusetzen, da sich zum Einen die Zielanalyten unterscheiden können und zum Anderen die Empfindlichkeit nicht ausreicht um die Analyten mit einem praktikablem Cutoff nachzuweisen. Das soll heißen, immunchemische Verfahren die gegenwärtig auch für beispielsweise Speichel eingesetzt werden besitzen einen viel zu hohen Cutoff, da deren Sensitivität nicht ausreicht. Analyten können Immunchemisch im Speichel deutlich kürzer nachgewiesen werden als im Urin. Durch den Einsatz eines empfindlicheren Verfahrens wie der Flüssigchromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie können auch im Speichel bei niedrigerem Cutoff Nachweis- fenster wie im Urin erreicht werden. Chromatographische Verfahren besitzen gegenüber immunchemischen Verfahren eine deutlich höhere Sensitivität und Selektivität, sind jedoch zeit- und materialaufwendiger und teurer. Immun- chemische Verfahren erfordern bei einem Drogenscreening bei Substitutions- patienten jedoch mehrere Analysen, im Vergleich zur Chromatographie, wo eine Einzelanalyse ausreicht.
4 Wahl der Matrix
Die für ein Drogenscreening bei Substitutionspatienten am häufigsten eingesetzten Körperflüssigkeiten sind Urin und Blut [14] [15]. Eine alternative Matrix muss entsprechend den Vergleich mit diesen beiden Matrizes, im Bezug auf
Nachweisbarkeit und Nachweiszeit, standhalten.
4.1 Alternative Matrizes
Alternative Matrizes die gegenwärtig für ein Drogenscreening im Rahmen der Substitution eingesetzt beziehungsweise diskutiert werden, sind zum Beispiel Kopfhaar [16], Schweiß [17], Kapillarblut und Speichel [18] [19] [20].
4.1.1 Kopfhaar
Kopfhaar besitzt in Abhängigkeit von der Länge des zur Verfügung stehenden Materials, meist ein relativ langes Nachweisfenster. Dies bietet jedoch dem substituierenden Arzt kaum die Möglichkeit auf das Konsumverhalten des Patienten zu reagieren [21]. Im Rahmen der Substitutionstherapie ist es notwendig einen Rückfall früh zu erkennen um therapeutische Maßnahmen schnell einleiten zu können und so einen etwaigen Therapieabbruch zu verhindern. Repetitive kurzfristige Kontrollen des Patienten sind praktisch nicht durchführbar, da jedes Mal eine Haarprobe entnommen werden muss. Der Patient müsste ferner im Umgang mit seinem eigenen Haar eingeschränkt werden, da Haarbehandlungen wie Färben Einfluss auf die Analytkonzentrationen haben können [22]. Die Proben- nahme ist im Vergleich zum Urin für den Patienten und den Probennehmer bei der direkten Abnahme eventuell weniger unangenehm, erfordert jedoch mehr Zeit. Da Haarproben möglichst nah der Kopfhaut entnommen werden, entstehen hierdurch jedoch haarfreie Stellen auf der Kopfoberfläche, die von vielen Menschen kosmetisch als unangenehm betrachtet werden. Die Stabilität von Drogen und Medikamenten ist im Haar relativ gut [23]. Dies liegt daran, dass die Analyten nach der Probennahme weiterhin in der festen Haarmatrix eingeschlossen sind. Aus analytischer Sicht sind Haaranalysen relativ zeitaufwendig, da die Proben vorab gewaschen werden müssen um eventuelle äußerliche Kontaminationen zu beseitigen. Anschließend muss die Probe zerkleinert und homogenisiert werden.
Zum Schluss werden mit Hilfe eines geeigneten Extraktionsverfahrens die Zielanalyten aus der Probe gewonnen [24]. Die Analytik erfolgt meistens mit chromatographischen Verfahren, es sind aber auch immunchemische Verfahren beschrieben [25]. Immunchemische Verfahren sind jedoch nicht empfindlich genug, um einen einmaligen Konsum aufzudecken. Aus diesem Grund werden sie meist nur für das "Workplace Drug Testing" eingesetzt. Für ein Drogenscreening bei Substitutionspatienten ist es jedoch notwendig auch den einmaligen Konsum nachzuweisen. Aus diesem Grund ist es erforderlich, chromatographische Verfahren einzusetzen, die wiederum kostenintensiver sind.
4.1.2 Schweiß
Eine weitere alternative Matrix ist Schweiß. Die Zielanalyten für Schweiß sind häufig die Muttersubstanzen. Dies kann dazu führen das eine äußerliche Kontamination falsch positive Ergebnisse ergibt. Die Analytkonzentrationen sind sehr variabel und häufig sind die Konzentrationen der Metaboliten, soweit diese nachweisbar sind, deutlich niedriger als die der Muttersubstanzen[26]. Dies stellt hohe Ansprüche an die Sensitivität der Analysengeräte. Abhängig von äußeren Bedingungen wie Umgebungstemperatur und physischer Belastung des Probanden sind die gesammelten Probenmengen unterschiedlich, was eine Standardisierung erschwert [27]. Der Drogenschnelltest DrugWipe K der Firma Securetec (München) ist ein Beispiel für einen relativ schnell und leicht durchführbaren immunchemischen Test zum Nachweis von THC, Opiaten, Kokain und Amphetamin/Methamphetamin. Neben Schweiß kann der Test auch für Speichel eingesetzt werden kann und Ergebnisse zur aktuellen Beeinträchtigung liefern. Ein positives Ergebnis in einem der Teste lässt sich jedoch nicht aus dem Originalmaterial bestätigen, da es sich um einen sogenannten Wischtest handelt, bei dem nur eine sehr kleine und nicht definierte Menge an Schweiß auf einen Teststreifen überführt wird. Bei der Analyse "wandert" die Probe zudem mit Hilfe von Wasser zum Ort der Reaktion zur immunchemischen Detektion. Bei einem positiven Ergebnis muss zusätzlich eine Urin- oder Blutprobe entnommen werden, was wiederum zusätzliche Kosten erzeugt [28]. Darüber hinaus erfordert die Abnahme von Blut medizinisches Fachpersonal und eine zusätzliche Urinabgabe wäre ein Eingriff in die Intimsphäre der diesen Vorteil des DrugWipe K negieren würde. Für die Gewinnung einer ausreichenden Menge an Probenmaterial für ein chromatographisches Verfahren werden häufig sogenannte "Patches" eingesetzt.
Diese werden ähnlich einem Pflaster auf eine Hautpartie aufgebracht. Die Oberfläche der Patches ist vor einer äußeren Kontamination geschützt. Der Patient kann hier jedoch nicht ständig beaufsichtigt werden, da die Sammelzeiten von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen reichen. Eine Probenmanipulation kann in diesem Fall nie ausgeschlossen werden. Eine hohe Interindividualität der Analytkonzentrationen bei verschiedenen Patienten erschwert zusätzlich die Befundbeurteilung [29].
4.1.3 Kapillarblut
Weiterhin bietet sich Kapillarserum bzw. -plasma, oder alternativ Kapillarblut als Matrix an. Bei Patienten in Substitutionstherapie die Drogen intravenös konsumieren ist eine Blutentnahme aus der Armvene aufgrund von Vernarbungen und verminderter Stabilität des Venengewebes häufig schwierig für den Arzt und unter Umständen schmerzhaft für den Patienten [30]. Kapillarblut kann relativ leicht aus gut durchbluteten Extremitäten wie der Fingerbeere oder dem
Ohrläppchen entnommen werden und bedeutet für den Patienten keine tiefen Einstiche in das Gewebe, da nur die Oberfläche der Haut durchstochen wird. Die Entnahme ist relativ einfach und wird beispielsweise von Diabetikern zur Kontrolle des Blutzuckerspiegels, ohne Hilfe von medizinischem Personal, durchgeführt [31].
Die Analytkonzentrationen von Kapillarblut, -serum und -plasma korrelieren mit den Analytkonzentrationen von venös entnommenem Blut bzw. daraus gewonnenen Serum oder Plasma [32] [33] [34]. Problematisch ist die Gefahr einer Kontamination der Probe durch Substanzspuren auf der Oberfläche der Entnahmestelle. Da nur geringe Mengen von wenigen µL Blut entnommen werden, können schon geringe Analytmengen zu einer merklichen Kontamination der Probe führen. Ein weiteres Problem das bei Patienten in Substitutionstherapie berücksichtigt werden muss, ist, dass Blut eine infektiöse Körperflüssigkeit darstellt. Da unter Substitutionspatienten Viruserkrankungen wie HIV und Hepatitis weit verbreitet sind ist ein überaus sorgsamer Umgang mit den Proben erforderlich. Aus Kapillarblut kann zur Analyse Serum oder Plasma gewonnen werden. Die Referenzbereiche für Medikamentenspiegel beziehen sich meist auf die Analytkonzentrationen im Serum oder Plasma. Kapillarplasma und -serum muss jedoch durch Zentrifugation gewonnen werden und erfordert aufgrund der geringen Volumina eine hohe Genauigkeit bei der Bestimmung des abgenommenen Probenvolumens.
4.1.4 Speichel
Speichel als alternative Matrix benötigt ebenfalls kein medizinisch geschultes Personal zur Abnahme. Der Patient kann bei der Abnahme beobachtet werden, um Manipulationen auszuschließen. Auf dem Markt ist eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Speichelsammelsystemen verfügbar (siehe Tabelle 1). Das häufigste Sammelprinzip ist ein Speichermedium wie Baumwolle oder synthetisches saugfähiges Material. Dieses wird in den Mundraum eingebracht und nimmt dort den Speichel direkt auf. Je nach Hersteller wird so ein definiertes Speichelvolumen gewonnen. Anschließend wird die Speichelprobe meist in eine Pufferlösung mit definiertem Volumen gegeben, so dass die Analytkonzentrationen durch einen entsprechenden Umrechnungsfaktor direkt auf den Speichel bezogen werden können. Der Puffer enthält oftmals Zusätze die ein Bakterien- und Pilzwachstum hemmen, sowie ein Detergenz um eine unspezifische Adsorption der Analyten an der Oberfläche des Sammelgefäßes zu verhindern und eine desorption vom Speichermedium zu ermöglichen. Beim Saliva Collection System pH 4.2 (SCS) der Firma Greiner Bio-One (Kremsmünster) wird eine saure Pufferlösung direkt in den Mundraum eingebracht und vermischt sich beim Sammelprozess mit dem im Sammelzeitraum entstehenden Speichel. Dadurch können Adsorptionsverluste an den bei anderen Speichelsammelsystemen zwischengeschalteten Speichermedien verhindert werden. Des Weiteren wird durch die Pufferlösung der schwach saure
pH-Wert im Mundraum konstant gehalten. Da der Übergang von Analyten aus dem Blutkreislauf in den Speichel pH-abhängig ist (siehe Punkt 5.2) kann so ein konstanter Übertritt gewährleistet werden. Durch hoch sensitive Analysensysteme wie die UPLC-MS/MS können die teilweise sehr niedrigen Analytkonzentrationen im Speichel, trotz der häufig geringen Probenenvolumina, nachgewiesen werden.
Tabelle 1: Beispiele für Speichelsammelsysteme [35]
Name Hersteller
Quantisal Oral Fluid Collection Device Immunalysis, Pomona, CA, USA Intercept Oral Fluid Drug Test OraSure Technologies,
Bethlehem, PA, USA
Saliva Collection System pH 4.2 (SCS) Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich
Saliva Sampler StatSure Diagnostic Systems,
Framingham, MA, USA
Salivette Sarstedt, Nümbrecht
Cozart Drug Detection System Cozart Bioscience, Abingdon, OX, UK
OraCol Malvern Medical Developments,
Malvern, WOR, UK
OraTube Varian, Palo Alto, CA, USA
Oral-Eze Quest Diagnostics, Madison, NJ,
USA
Salicule saliva sampler Acro Biotech, Rancho Cucamonga, CA, USA
4.2 Speichel im Vergleich zu Blut oder Urin
Im nachfolgenden soll nun kurz erläutert werden welche Vor- und Nachteile zwischen den gängigen Matrizes Blut und Urin und der Alternativmatrix Speichel bestehen.
4.2.1 Probennahme und Stabilität der Analyten 4.2.1.1 Blut
Die Entnahme einer Blutprobe ist eine invasive medizinische Prozedur die, wenn auch ein relativ geringes, immer ein Risiko für den Patienten in sich birgt. Darüber hinaus erfordert sie jedoch vor allem geschultes Personal. Ein wichtiger Vorteil ist der Ausschluss einer eventuellen Manipulation der Probe durch den Patienten, was im Bereich der Drogenanalytik bei Substitutionspatienten relevant sein kann um
einen eventuellen Beikonsum unerlaubter Substanzen zu verschleiern. Des Weiteren sind für viele der kommerziell erhältlichen Entnahmesysteme Analytstabilitäten von Drogen in verschiedenen Studien und unter verschiedenen Lagerbedingungen belegt [36].
4.2.1.2 Urin
Die Entnahme einer Urinprobe ist nicht invasiv und deshalb für den Patienten gefahrlos. Sie ist auch durch nicht medizinisch geschultes Personal durchführbar.
Der Zeitaufwand ist hier relativ hoch, da die Probenahme unter Aufsicht erfolgt, um eine Manipulation des Probenmaterials bzw. die Abgabe einer Fremdprobe zu verhindern. Dazu bedarf es in der Regel einer gleichgeschlechtlichen Aufsichtsperson, die zum Beispiel in einer akuten Verdachtssituation nicht immer anwesend ist. Dieser Eingriff in die Intimsphäre wird darüber hinaus von vielen Menschen als unangenehm empfunden. Die entnommene Urinprobe wird im Regelfall nicht durch Puffer pH-stabilisiert. Durch die hohe Variabilität des Urin pH-Wertes zwischen 4.5 und 9.0 [37] kann ein Abbau pH-instabiler Substanzen auf dem Transportweg und während der Lagerung geschehen. Die Gefäße in denen Urinproben transportiert und gelagert werden unterliegen keiner Standardisierung [38], so dass abhängig vom Gefäßmaterial Adsorptionseffekte auftreten können, die ebenfalls zu Analytverlusten führen können.
4.2.1.3 Speichel
Die Entnahme einer Speichelprobe ist nicht invasiv. Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden Speichelsammelsysteme erfordern kein geschultes Personal und sind in der Anwendung unproblematisch. Kommerziell erhältliche Speichel- sammelsysteme versuchen die scheinbar einfache, aber von vielen Menschen als unangenehm empfundene Lösung des Ausspuckens zur Gewinnung zu umgehen.
Darüber hinaus ist es notwendig die Stabilität der Analyten bis zur Analyse zu gewährleisten. Dies geschieht häufig durch Pufferlösungen mit stabilem pH-Wert und Zusätzen die eine Absorption der Analyten im Transportgefäß oder am Sammelmaterial, sowie Bakterienwachstum, verhindern. Studien die die Wiederfindung und Haltbarkeit von Analyten in verschiedenen Sammelsystemen belegen [35] haben in den letzten Jahren zugenommen.
4.2.2 Analyten und zu erwartende Konzentrationen 4.2.2.1 Blut
Die nachzuweisenden Analyten sind hier am häufigsten die noch keinem Metabolismus unterworfenen Muttersubstanzen. Da die Fragestellung bei Blut-
proben in erster Linie die aktuelle Beeinflussung ist, können Metaboliten relevant sein, wenn diese pharmakologisch aktiv sind. Die zu erwartenden Analyt- konzentrationen bewegen sich dosis- und zeitabhängig häufig im Bereich von einigen ng/mL können aber abhängig vom Analyten bis zu mehreren µg/mL betragen.
4.2.2.2 Urin
Die nachzuweisenden Analyten sind hier am häufigsten die durch den Phase I- und Phase II-Metabolismus erzeugten Metabolite der jeweiligen Muttersubstanzen. Ziel des Metabolismus ist neben der Detoxifikation eine Erhöhung der Hydrophilie der Substanzen um deren renale Ausscheidung zu ermöglichen bzw. zu verbessern. Die zu erwartenden Analytkonzentrationen liegen hier häufig im Bereich von mehreren µg/mL.
4.2.2.3 Speichel
Die Zielanalyten sind wie im Blut die entsprechenden Muttersubstanzen. Die Metabolite dieser Stoffe sollten jedoch gegebenenfalls ebenfalls bestimmt werden, da Sie ein Beleg für die Aufnahme der Substanz sind und somit eine reine orale Kontamination ausschließen. Die erwarteten Konzentrationen liegen im Bereich von pg/mL bis zu µg/mL und können bei oraler Kontamination auch deutlich höher ausfallen [39].
4.3 Begründung für die Wahl der Matrix Speichel als Alternative
- Es ist keine besondere Schulung des Personals das die Probe entnimmt erforderlich.
- Die Entnahme der Probe ist nicht invasiv - Die Probennahme ist jeder Zeit möglich - Die Probennahme ist wenig zeitaufwendig
- Die Verwendung eines Speichelentnahmesystem erhöht die Vergleichbarkeit der Analysenergebnisse
5 Die Matrizes Urin und Speichel
5.1 Matrix Urin
Urin entsteht in der Niere als Filtrat des Blutes. Hauptaufgabe der Niere ist die Regulation des Wasser- und Elektrolythaushaltes des Körpers, sowie die Ausscheidung Stoffwechselendprodukten und Giftstoffen. Urin als Matrix unterliegt vielen intraindividuellen Einflüssen, wie Nahrungsaufnahme, Körper- gewicht, Alter, Geschlecht, körperliche Aktivität. Die täglich abgegebene Urin- menge liegt zwischen 0.5 und 2.0 Liter und besteht zu ca. 95% aus Wasser [40].
Der pH-Wert liegt normal im Bereich zwischen 4.5 bis 8.0 [41]. Ein wichtiger organischer Bestandteil des Urins ist Kreatinin. Es entsteht im Muskelstoffwechsel und die täglich ausgeschiedene Menge ist direkt proportional zur Muskelmasse.
Der Normalbereich liegt zwischen 30 mg/dL und 300 mg/dL [42]. Mit Hilfe von Kreatinin lässt sich die glomeruläre Filtrationsrate bestimmen [15]. Kreatinin wird in der Drogenanalytik als sogenannter perianalytischer Parameter eingesetzt um eine vom Probanden durchgeführte Probenmanipulation durch intentionelles, vermehrtes Trinken oder das nachträgliche verdünnen der Probe mit beispielsweise Wasser zu erkennen. Dabei gilt gemäß den Richtlinien zum "Workplace Drug Testing" der "European Workplace Drug Testing Society" für eine verdünnte Probe ein Cutoff von 2.0 mmol/L (22.6 mg/dL) Kreatinin im Urin [43]. Gemäß den Beurteilungskriterien zur Fahreignungsdiagnostik gilt eine Analyse als nicht verwertbar, wenn die Kreatininkonzentration unter 20 mg/dL liegt [76]. Das heißt, Proben mit Kreatininwerten von 20 mg/dL oder weniger können intentionell durch übermäßige Flüssigkeitsaufnahme oder durch direkte Probenmanipulation beeinflusst sein.
In der Drogen- und Medikamentenanalytik aus Urin sind viele der missbrauchs- relevanten Substanzen nicht direkt als Muttersubstanz oder nur in niedrigen Konzentrationen nachweisbar, da die häufig lipophilen Substanzen im Körper metabolisiert werden um die Ausscheidung über die Niere zu begünstigen. Die Glukuronidierung zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit begünstigt oft zusätzlich die Ausscheidung. Dies ist bei der Analytik einiger nachzuweisender Substanzen, wie zum Beispiel den Benzodiazepinen, insbesondere auch bei immunchemischen Verfahren zu berücksichtigen, da die Glukuronide im immunchemischen Test keine Kreuzreaktivität aufweisen.
5.2 Matrix Speichel
Speichel besteht zu ca. 99% aus Wasser. Darin sind in niedriger Konzentration eine Vielzahl von Elektrolyten, Enzymen wie die α-Amylase, Glykoprotein, Immun- globulin, Albumin, Poly- und Oligopeptid, Glukose sowie Sticksoffverbindungen
wie Harnstoff und Ammoniak enthalten. Die Bildung des Speichels erfolgt in den Speicheldrüsen (Abb. 1). Dabei bilden die drei großen Speicheldrüsen, die Ohrspeicheldrüse (Glandula parotidae), die Unterkieferspeicheldrüse (Glandula submandibularis) und die Unterzungenspeicheldrüse (Glandula sublingualis) den größten Teil. Darüber hinaus verteilt sich eine Vielzahl kleiner Speicheldrüsen in der Mundschleimhaut. Der normale Speichelfluss liegt bei 1.0 bis 1.5 Liter pro Tag. Die Speicheldrüsen können stimuliert werden, zum Beispiel durch mechanische Einwirkung, Geschmacksempfinden, Geruchssinn, Aktivierung des Symphatikus und Parasympathikus oder durch Medikamente. In diesem Fall erhöht sich der Speichelfluss von 0.25 bis 0.35 mL/min bis auf 1 bis 3 mL/min. Die ionischen Bestandteile des Speichels führen zu einem gepufferten System, das einen pH-Wert von 6 bis 7 besitzt. Bei stimuliertem Speichelfluss erhöht sich der pH-Wert auf bis zu 7.8. Zu den Aufgaben des Speichels zählt der Schutz des Mundraums vor mikrobiologischem Befall, Verdünnen von Stoffen vor deren Aufnahme, Beginn des Verdauungsprozesses im Nahrungsbrei mit Hilfe der α- Amylase als stärkespaltendem Enzym und die Mineralisierung der Zähne [44].
Abb. 1: Auslösung der Speichelsekretion [45]
Der Nachweis von Drogen und Medikamenten im Speichel gelingt durch den Übertritt der Analyten aus dem Blut in die Speicheldrüsen. Dies geschieht mit diesen Substanzen in erster Linie durch passive Diffusionsprozesse. Dabei stellt sich ein Gleichgewicht zwischen Speichel und Plasma ein, welches als "S/P-Ratio"
[46] bezeichnet wird. Das Verhältnis hängt ab von der Lipophilie, dem Molekular- gewicht, der Molekülgröße, dem pKa-Wert, der Proteinbindung und der Konzentration der Substanz, sowie dem pH-Wert des Speichels. Für die Konzentration ist hier die Proteinbindung des Analyten im Blut von Bedeutung, da für den Austausch nur der freie Analyt zur Verfügung steht. Der pKa-Wert der Substanz und die Lipophilie beeinflussen den Diffusionsprozess durch die Lipidmembranen. Wenig bis ungeladene Teilchen können diese leichter durch- dringen. Da der pH-Wert des Blutes relativ konstant bei ca. 7.4 liegt ist der Anteil
an ionisiertem Analyten im Blut konstant. Der pH-Wert des Speichels kann sich wie oben beschrieben durch stimulieren des Speichelflusses vom leicht sauren ins leicht basische bewegen. Dabei werden Stoffe mit basischem pKa im Sauren Speichel und Stoffe mit saurem pKa im basischen Speichel angereichert, da der höhere Ionisierungsgrad die Rückdiffusion durch die Lipid-membran verringert.
(Abb. 2) Die meisten missbrauchsrelevanten Drogen und Medikamente haben einen neutralen bis basischen pKa-Wert [47] [48] [49].
Abb. 2: Schematischer Übertritt von Drogen/Medikamenten in den Speichel [48]
6 Analytische Vorgaben für die Speichelanalytik
6.1 Auswahl der Analyten:
Die Auswahl der im Speichelscreening untersuchten Analyten orientiert sich zum einen an den in unserem Urinscreening mittels Bestätigung oder Differenzierung nachweisbaren missbrauchsrelevanten Drogen und an den Erfahrungswerten des Laborleiters. Um den unter Punkt 8.1 beschriebenen Vergleich mit dem Urinscreening durchzuführen, werden diese ebenfalls in Gruppen zusammengefasst. Das in unserem Labor eingesetzte Speichelsammelsystem (siehe Punkt 7.2) erfordert eine Bestimmung des Speichelanteils, zur Ermittlung des Verdünnungsfaktors, die Photometrisch erfolgt. Da die tatsächliche gesammelte Speichelmenge von Probe zu Probe variiert kann mit Hilfe des Verdünnungsfaktors die Analytkonzentrationen direkt für den Speichel angegeben werden. Um sicher zu stellen, dass die eingesandte Probe Speichel enthält wird im Rahmen der Perianalytik zusätzlich die Amylasekonzentration bestimmt. Im Rahmen des LC-
MS-Screenings wird darüber hinaus noch die Cortisolkonzentration bestimmt. Die zusätzliche Bestimmung des Speichelanteils, sowie die visuelle und olfaktorische Bewertung der Speichelprobe dienen dazu, die Perianalytik abzurunden und gegebenenfalls sicherzustellen, dass die eingesandte Probe richtig abgenommen und nicht manipuliert wurde.
Tabelle 2: Analytenauswahl für das Drogenscreening im Speichel Analytgruppe Analyten
Substitutionsgruppe: Methadon, Buprenorphin
Amphetamingruppe: Amphetamin, Methamphetamin, MDA (3,4 - Methylendioxyamphetamin), MDMA (3,4- Mehtylendioxy-N-methylmethamphetamin), MDEA (3,4-Methylendioxy-N-ethylamphetamin), MBDB (2-Methylamino-1-(3,4-
methylendioxyphenyl)butan, BDB (2-Amino-1-(3,4- methylendioxyphenyl)butan, Mephedron, Methylon, Butylon, PMA (4-Methoxyamphetamin), PMMA (4- Methoxymethamphetamin)
Benzodiazepingruppe: Diazepam, Nordiazepam, Oxazepam, Temazepam, Flunitrazepam, 7-Aminoflunitrazepam, Clonazepam, 7-Aminoclonazepam, Midazolam, 1-OH-Midazolam, Flurazepam, 2-OH-Ethylflurazepam, Alprazolam, 1-OH-Alprazolam, Bromazepam, Lorazepam Kokaingruppe: Kokain, Benzoylecgonin
Opiatgruppe: Morphin, 6-Acetylmorphin, Codein, Norcodein, 6-Acetylcodein, Dihydrocodein
Cannabinoidgruppe: Tetrahydrocannabinol
Opioide: Naloxon, Tilidin, Tramadol, Oxycodon, Fentanyl Sonstige: Zolpidem, 2-Amino-5-Chloropyridin (Abbauprodukt
des Zopiclon), Zaleplon, Ketamin, Methylphenidat Zopiclon und seine Metaboliten sind unter basischen Bedingungen nicht stabil [49].
Deshalb wird der Analyt Zopiclon über sein Abbauprodukt 2-Amino-5-Chloro- pyridin gemessen, da im Rahmen der Probenvorbereitung eine Alkalisierung der Probe vorgenommen wird. Die Kalibrierung des Systems wird mit Zopiclon und nicht mit 2-Amino-5-Chloropyridin vorgenommen, so dass die detektierte Menge des Abbauprodukts der equivalenten Konzentration an eingesetztem Zopiclon zugeordnet wird. Um sicher zu stellen, dass das Zopiclon vollständig umgesetzt wurde, wird Zopiclon zusätzlich beim Drogenscreening im Speichel gemessen.
6.2 Cutoffkonzentration
Die Cutoffkonzentration ist ein Grenzwert. Liegt die Analytkonzentration oberhalb der Cutoffkonzentration wird die Patientenprobe für diesen Analyten als positiv bewertet. Liegt die Analytkonzentration unterhalb der Cutoffkonzentration wird die Patientenprobe für diesen Analyten als negativ bewertet. Dies dient im Bereich der Drogen- und Medikamentenanalytik von Substitutionspatienten dazu einen Neukonsum von einem schon einmal nachgewiesenen Konsum zu unterscheiden.
Bei einem bereits nachgewiesenen Konsum sollte die Analytkonzentration in später abgenommenen Proben kontinuierlich fallen bis die Konzentration unterhalb des Cutoff liegt. Bei einem Neukonsum hingegen steigt die Konzentration in einer zu einem späteren Zeitpunkt abgenommenen Probe erneut an. Im Regelfall liegen zwischen den Probenentnahmen bei Substitutionspatienten ein bis mehrere Tage.
Ist die Analytkonzentration in der Probe eines Patienten unterhalb des Cutoff und die nachfolgend abgenommene Probe darüber, kann so ein Neukonsum angenommen werden. In der Literatur werden verschieden Cutoffkonzentrationen für Speichelanalysen vorgeschlagen [39] [10] [50] [51]. Diese hängen zum einen von der zu erwartenden Analytkonzentration ab. Abhängig von der Art und Menge der aufgenommenen Substanz bzw. vom Zeitpunkt der Probenabnahme können die verschiedenen Analytkonzentrationen im Blut von wenigen ng/mL bis zu mehreren µg/mL variieren. Weiterhin muss natürlich der Übertritt vom Blut in den Speichel als äußerst wichtiger Faktor berücksichtigt werden. Für die Vielzahl der in unserem Screening nachzuweisenden Substanzen werden Cutoffkonzentrationen von 1ng/mL bis 50ng/mL oder noch höher vorgeschlagen. Dies hängt auch von der jeweiligen Fragestellung ab. Beinhaltet die Fragestellung einen kürzlich zurückliegenden Konsum der den Patienten aktuell noch beeinflusst, so werden die Cutoffkonzentrationen hier etwas höher angesetzt. Dies dient dazu, einen zurückliegenden Konsum, ohne aktuelle Beeinflussung des Patienten, unberücksichtigt zu lassen. Ein Beispiel hierfür ist die aktuelle Fahrtüchtigkeit in einer Polizeikontrolle. Bei Patienten in Substitutionstherapie hingegen ist die Fragestellung ob der Patient grundsätzlich seit seiner letzten Probenabgabe Drogen oder Medikamente konsumiert hat. Aus diesem Grund muss hier der Cutoff deutlich niedriger liegen. Im Falle eines Drogenscreenings bei Arbeitnehmern ("workplace drug testing") z.B. liegen die Cutoffwerte häufig etwas höher, da diese zum Einen mit preiswerteren Immunoassays durchgeführt werden und deren Empfindlichkeit nicht ausreicht. So kann nur eine aktuelle Beeinflussung nachgewiesen werden und nicht eine länger zurückliegende Einnahme. Ein wichtiger Punkt zum Vergleich der Drogen- und Medikamentenanalytik im Urin mit der im Speichel ist das Nachweisfenster, das sich bei niedrigerem Cutoff vergrößert. Um vergleichbare Nachweisfenster zu erreichen muss eine Speichelanalyse ca. 100-mal empfindlicher sein als eine Urinanalyse. Die Matrix Urin die für ein Drogenscreening gewonnen wird ist der sogenannte Endharn.
Dieser wird in den Nieren aus dem Primärhan gebildet. Der Primärharn wiederum ist ein Ultrafiltrat des Blutplasmas. Im Laufe eines Tages werden aus ca. 1500 Liter Blut etwa 180 Liter Primärharn gewonnen, der wiederum durch Rückführung von Wasser auf ein hundertstel aufkonzentriert wird [52]. Aufgrund dieser Analytischen Möglichkeiten und um falsch negativen Ergebnissen möglichst vorzubeugen, haben wir vorerst eine Cutoffkonzentration von 1 ng/mL Speichel festgelegt. Dies deckt sich weitgehend mit den in der Literatur angegebenen kleinsten Cutoff- konzentrationen. Die Ausnahme bildet hier das Cortisol, da aus laborinternen Studien [53] bekannt ist, dass die entsprechenden Konzentrationen bei Patienten mit Opiatmissbrauch häufig niedriger sind. Deshalb wird für Cortisol ein Cutoff von 0.1 ng/mL festgelegt. Es ist geplant die Cutoffkonzentrationen in Zukunft abhängig von den erlangten Erfahrungswerten anzupassen.
7 Material und Methoden
7.1 Immunchemische Verfahren
7.1.1 Überblick
Kommerzielle in der medizinischen Diagnostik eingesetzte Immunoassays unterliegen in Deutschland dem Medizinprodukte-Gesetz und erfordern eine CE- Kennzeichnung. Ihr Einsatz in der Drogenanalytik von Urinproben hat sich über viele Jahre bewährt. Da die Analytkonzentrationen jedoch im Urin sehr hoch sind und die Zielanalyten teilweise die Metaboliten der missbrauchten Substanzen sind, reicht die Sensitivität und Spezifität dieser Technologie häufig nicht aus um Blut- oder Speichelproben zu messen. Immunoassays funktionieren nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei bindet der gesuchte Zielanalyt als Antigen an einen gezielt hergestellten Antikörper, was eine hohe Selektivität der Analyse erlaubt [54]. Bei Immunoassays, die Gruppen von Analyten ähnlicher Struktur und Wirkung erfassen, wie Benzodiazepine, Opiate und Amphetamine muss berücksichtigt werden, dass sie mit den einzelnen Substanzen und deren Metaboliten in unterschiedlichem Ausmaß und kumulativ reagieren. Für immunchemische Gruppenteste ist die sogenannte Kreuzreaktivität der einzelnen Analyten wichtig für die Befundbeurteilung. Die Kreuzreaktivität eines Analyten ist die relative Konzentration zu der für den Gruppentest ausgewählten
"Leitsubstanz". Die Leitsubstanz wird verwendet um den Test zu kalibrieren. Bei einer Kreuzreaktivität von 50% ergibt sich für einen Analyten der in einer Probe die Cutoffkonzentration aufweist ein negatives Ergebnis. Ist die Kreuzreaktivität größer 100%, so können auch Konzentrationen unterhalb des Cutoff noch positive Screeningergebnisse erzeugen. Darüber hinaus kann sich die Kreuzreaktivität einzelner Substanzen in Abhängigkeit von der Konzentration ändern [54] [55] [56].
Zur Gewährleistung der Probenintegrität wird die oben beschriebene Perianalytik an der Probe durchgeführt. Dies dient der Feststellung einer Probenmanipulation durch den Probanden durch:
In vivo:
1. Exzessives Trinken 2. Einnahme von Diuretika
In vitro:
3. Verdünnung der Probe 4. Vertauschen der Probe
5. Zufügen von Störsubstanzen [57]
Bei der Perianalytik wird die Probe visuell und olfaktorisch geprüft, sowie die Kreatininkonzentration bestimmt. Sollten hier Proben, durch ungewöhnlichen Geruch, durch urinuntypische Färbung oder durch einen verminderten Kreatinin- wert auffällig erscheinen, muss dies bei der Befundinterpretation berück-sichtigt werden.
7.1.2 Verwendete Tests für die Speichelproben
Die Speichelproben wurden auf einem Olympus AU680 der Firma Beckman Coulter mit folgenden Tests vermessen:
7.1.2.1 Greiner Bio-One Speichelquantifizierungskit (Greiner Bio- One GmbH, Kremsmünster, Österreich)
Der Test wird verwendet um den Speichelanteil in Proben zu bestimmen die mit dem Greiner Bio-One Speichelsammelsystem gewonnen wurden. Der Speichel- anteil wird benötigt um die Analytkonzentrationen der LC-MS Screeningmethode und der Amylasekonzentration im Speichel zu bestimmen. Weiterhin kann eine Manipulation der Probe durch Verdünnen nachgewiesen werden.
Kalibratorkonzentrationen: 11, 27, 46, 66, 85 % Speichelanteil in der Probe Referenzbereich: 10-80 % Speichelanteil in der Probe
Der Normbereich wurde in unserem Labor bestimmt und liegt zwischen 26% und 74% Speichelanteil in der Probe[53].
7.1.2.2 Amylase (Beckmann Coulter, Krefeld)
Quantitativer Test zur Bestimmung der α-Amylasekonzentration im Urin. Der Test wurde in unserem Labor an die Gegebenheiten der Speichelmatrix angepasst. Die
zu vermessenden Speichelproben werden durch das Analysengerät 1:100 verdünnt, um in den linearen Bereich des Testes zu kommen.
Kalibrator: 1500 U/L
Referenzbereich: > 10000 U/L (entspricht 100 U/L in der verdünnten Probe)
Der Normbereich wurde in unserem Labor bestimmt und liegt zwischen 23000 U/L und 433000 U/L[53].
Bei der Bestimmung der α-Amylasekonzentration im Speichel muss der Speichelanteil (siehe Punkt 7.1.2.1) zusätzlich berücksichtigt werden. Das quantitative Ergebnis bezieht sich hier auf die Analytkonzentration im Speichel und nicht im Speichel/Puffer-gemisch.
Die α-Amylasekonzentration ist einer der sogenannten perianalytischen Marker für die Matrix Speichel. Als endogene Substanz im Speichel ist sie ein Beleg für die Authentizität des Probenmaterials Speichel.
7.1.3 Verwendete Tests für die Urinproben
Die Urinproben wurden auf einem Olympus AU680 der Firma Beckman Coulter mit folgenden Tests vermessen:
7.1.3.1 DRI Creatinine-Detect-Test (Thermo Scientific, Passau)
Der Test wird zur quantitativen Bestimmung der Kreatininkonzentration im Humanurin verwendet. Kreatinin ist ein sogenannter perianalytischer Marker, der es erlaubt eine Verdünnung beziehungsweise die Abgabe einer Ersatzflüssigkeit an Stelle von Urin nachzuweisen.
Kalibratorkonzentration: 20 mg/dL
Referenzbereiche [43]: > 20 mg/dL (unverdünnte Proben)
≤ 20 mg/dL und > 5mg/dL (intentionell verdünnte Probe)
≤ 5 mg/dL (Es handelt sich nicht oder vorwiegend nicht um eine Urinprobe)
7.1.3.2 CEDIA
Amphetamin/Ecstasy-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Amphetamin und Ecstasy im Humanurin. Der Test reagiert mit unterschiedlichen Kreuzreaktivitäten auf eine Vielzahl weiterer Designeramphetamine und strukturell dem Amphetamin verwandten Analyten aus z.B. der Phenylethylamingruppe.
Substanzen (Kreuzreaktivitäten bezogen auf d-Methamphetamin, Herstellerangabe):
d-Amphetamin (104%), l-Amphetamin (1.0%), d/l-Amphetamin (88%), d/l-
Methamphetamin (77%), MDA (116%), MDMA (196%), MDEA (172%), MBDB (121%), BDB (76%), PMA (24%), PMMA (100%)
Es ist davon auszugehen, dass auch andere strukturell dem Amphetamin ähnliche Substanzen aus der Phenylethylamingruppe relevante Kreuzreaktivitäten
aufweisen.)
Kalibration: 0, 150, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL d-Methamphetamin Cutoff: 500 ng/mL (Herstellerangabe: 500 bzw. 1000 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 150 ng/mL und 300 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.3 CEDIA
Benzodiazepin-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Benzodiazepinen im Humanurin. Der Test reagiert mit unterschiedlichen Kreuzreaktivitäten auf eine Vielzahl von Benzodiazepinen und deren Metaboliten. Da der Test jedoch nahezu nicht auf Benzodiazepin-Glucuronide reagiert wurde dieser in unserem Labor abgeändert. Entsprechend einer Empfehlung des Herstellers wird ein Hydrolyseschritt mit β-Glucuronidase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Dies dient dazu die zum Teil glucuronidierten Benzodiazepine [58]
besser nachweisen zu können.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Nitrazepam, Herstellerangabe):
7-Aminoflunitrazepam (99%), alpha-OH-Alprazolam (167%), Alprazolam (220%), Bromazepam (104%), Clonazepam (71%), Diazepam (154%), Flunitrazepam (109%), Flurazepam (195%), Lorazepam (115%), 7-Aminoclonazepam (96%), Nordiazepam (173%), Oxazepam (125%), Temazepam (93%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL Nitrazepam Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 200 bzw. 300 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.4 CEDIA
Cocaine Test (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Kokain und dessen Hauptmetaboliten Benzoylecgonin im Humanurin.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Benzoylekgonin, Herstellerangabe):
Benzoylecgonin (100%), Cocain (54%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL Benzoylecgonin Cutoff: 50 ng/mL (Herstellerangabe: 300 bzw. 150 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.5 DRI
Opiat-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Opiaten im Humanurin.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Morphin, Herstellerangabe):
6-Monoacetylmorphin (107%), Codein (200%), Dihydrocodein (46%), Morphin (100%), Oxycodon (3%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2000 ng/mL Morphin Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 300 bzw. 2000 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.6 CEDIA
Methadon-Metabolit (EDDP) Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung des Methadon- hauptmetaboliten EDDP (2-Ethylidin-1,5-dimethyl-3,3-diphenyl-pyrrolidin) im Humanurin. Das EDDP wird als Zielanalyt gewählt, da damit eine Proben- manipulation eventuell erkannt werden kann. Eine Möglichkeit für eine Proben- manipulation ist die Zugabe einer kleinen Menge der erhaltenen Methadondosis zur eigenen Urinprobe durch den Patienten. Das Ziel des Patienten ist hier den Eindruck zu erwecken er hätte sein Substitut eingenommen. Eine andere Möglichkeit der Probenmanipulation ist die Zugabe einer kleinen Menge Methadon zu einer negativen Fremdprobe. Dies dient dazu einen Beigebrauch von Drogen zu verschleiern, und soll mit Ausnahme des Substituts, die Drogenfreiheit des Patienten belegen. Durch die Messung des EDDP kann so eine derartige Probenmanipulation aufgedeckt werden.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf EDDP, Herstellerangabe):
Methadon (<0.1%)
Kalibration: 0, 100, 500, 1000, 2000 ng/mL EDDP Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 100 ng/mL)
7.2 Entnahmesystem für die Speichelanalyse
Bei dem in unserem Labor eingesetzten Speichelsammelsystem handelt es sich um das "SCS" (Saliva Collection System) der Firma Greiner Bio-One (Kremsmünster, Österreich) (Abb. 5). Die Wahl viel auf dieses System auf folgenden Gründen:
- definierte Sammelzeit von 2 Minuten unabhängig vom Speichelfluss des Patienten
- pH-Stabilisierung im Mundraum während der Probennahme - kein Zwischenschritt mit saugfähigem Material an dem Analyten
adsorbiert werden können
- keine zusätzlichen stabilisierenden Reagenzien die die Massenspektrometrie stören können
- Durch die eingesetzte Pufferlösung (4 mL) wird immer eine ausreichende Probenmenge für mehrere Analysen gewonnen - Es wird immer eine A- und eine B-Probe gewonnen. Das bietet die
Möglichkeit durch eine Reanalyse aus der B-Probe bei zweifelhaften Ergebnissen Fehler im Labor auszuschließen oder zu bestätigen.
Die Probe wird durch Spülen 2-minütiges Spülen des Mundraums mit einer Speichelsammellösung (4 mL) (Abb. 4) erhalten. Die Speichelsammellösung enthält den Lebensmittelfarbstoff Tartrazin der eine photometrische Bestimmung des Speichelanteils in der vom Probanden abgegebenen Probe erlaubt. Hierfür werden die Extinktionswerte bei 450nm und 520nm bestimmt und die Differenz dieser beiden Extinktionswerte als analytisches Signal dem jeweiligen prozentualen Speichelanteil zugeordnet (Abb. 7). Der pH-Wert der Speichelsammellösung ist bei pH 4.2 gepuffert, was zum Einen den pH-Wert während der Probennahme konstant hält und zum Anderen den Speichelfluss stimuliert. Nach der Probennahme wird das Gemisch aus Speichel und Sammellösung in einem Becher aufgenommen (Abb. 3). Mit Hilfe zweier evakuierter Probenröhrchen werden anschließend eine A- und eine B-Probe gewonnen (Abb. 6). Dies ermöglicht eine Reanalyse der Probe bei zweifelhaften Ergebnissen. Die meisten anderen kommerziell erhältlichen Entnahmesysteme setzen saugfähiges Material wie Baumwolle oder Zellulose ein, durch die teilweise eine definierte Menge an Speichel aufgenommen werden kann.
Ein Problem das bei Patienten in Substitutionstherapie häufig auftritt ist Xerostomie oder Mundtrockenheit. Xerostomie wird verursacht durch einen verminderten Speichelfluss bzw. eine verminderte Speichelsekretion der Mund- speicheldrüsen. Die verminderte Speichelsekretion kann verschiedenen Ursachen haben [59] [60] [61]. Die Ursachen die bei Patienten in Substitutionstherapie relevant sind, sind zum Einen die Einnahme von Medikamenten, unter anderem auch Opiate und Opioide wie Methadon und Heroin. Durch Erkrankungen wie HIV und Hepatitis, die bei Patienten mit einem vorhergehenden intravenösen Drogenkonsum von beispielsweise Heroin, relativ häufig sind [62] kann ebenfalls eine Xerostomie ausgelöst werden. Bei xerostomen Patienten kann aus den oben genannten Gründen die Probennahme aufgrund des verminderten Speichelflusses deutlich länger dauern als vom Hersteller des Entnahmesystems vorgegeben. Falls keine Endpunktsanzeige für das gesammelte Probenvolumen vorhanden ist, kann dies zu einer Probe führen die sich im Nachhinein im Labor nicht analysieren lässt, da das Probenvolumen zu klein ist [63] [64]. Die Richtlinien zur Speichelanalytik fordern daher dass das gesammelte Speichelvolumen vordefiniert, bzw. bekannt ist.
Abb. 3: Speichelsammelsysem SCS pH 4.2 der Firma Greiner Bio-One, 1 = Speichelsammellösung, 2 = Becher in den die Speichelprobe abgegeben wird, 3 = evakuierte Probenröhrchen zur
Gewinnung der A- und B-Probe und zur Stabilisierung der Probe
Abb. 4: Speichelsammellösung
Abb. 5: Gewonnene Speichelprobe
Abb. 6: Aufnehmen der Probe in das Speichelsammelröhrchen (A- und B-Probe)
Abb. 7: Kalibration des Speichelanteils, mit steigendem Speichelanteil verringert sich die Extinktion, da sich die Konzentration des Farbstoffes Tartrazin verringert.
7.3 LC/MS-MS
7.3.1 Analysensystem
Das Analysensystem besteht aus einer Acquity UPLC der Firma Waters, bestehend aus einem binären Pumpensystem, zur Förderung der mobilen Phasen, einem Probenaufgabesystem, zur seriellen Injektion der Proben, und einem Säulenofen, zur Temperierung der chromatographischen Trennsäule. Die verwendete Säule ist eine ACQUITY UPLCBEH Phenyl 1.7µm, 2.1mm x 100mm. Der Säulenofen weißt eine Temperatur von 50°C auf. Die mobile Phase A besteht aus Ammoniumformiat 5mmol/L in Wasser mit einem Zusatz von 0.1% Ameisensäure.
Die mobile Phase B besteht aus Methanol mit 0.1% Ameisensäure. Die Analysenzeit beträgt 5 Minuten und die Flussrate liegt bei 0.4mL/min. Der binäre Hochdruckgradient setzt sich wie folgt zusammen.
Tabelle 3: Binärer Hochdruckgradient
Zeit [min] [%] mobile Phase A [%] mobile Phase B
0.00 80 20
3.50 30 70
4.00 0 100
5.50 0 100
5.51 80 20
6.00 80 20
Der Gradientenanstieg oder -abfall erfolgt dabei immer linear.
Als Detektor dient ein Xevo TQ MS-Massenspektrometer, ebenfalls von der Firma Waters. In der Ionenquelle werden die Analyten zuerst ionisiert und anschließend durch einen ersten Quadrupol geschleust. Dabei wird das jeweils aktuell zu analysierende Analytion selektiv aussortiert und in eine Kollisionskammer durchgeleitet. Dort erfolgt mit Hilfe des Kollisionsgases Argon eine irreversible Fragmentierung zu kleineren „Tochterionen“. Diese werden anschließend in einem zweiten Quadrupol selektiert und schließlich mit einem Photoelektronen- vervielfacher detektiert. Die Peakflächenverhältnisse der einzelnen substanz- spezifischen Fragmente werden neben der Retenzionszeit zur Substanz- identifizierung herangezogen. In der folgenden Tabelle sind die gemessenen Analyten mit dem entsprechenden Mutterion und den zugehörigen Tochterionen in der Form [Analyt] [(m/z) Mutterion] > [m/z 1. Tochterion] > [m/z] 2. Tochterion]
in der Reihenfolge ihrer Retention aufgeführt.
Tabelle 4: Ionenübergänge für alle Analyten und internen Standards
Morphin-d6 292.2 > 128.0 > 152.2
Morphin 286.2 > 165.2 > 201.1
2-Amino-5-Chloropyridin 129.0 > 93.1 > 112.0
Norcodein 286.1 > 165.0 > 225.0
Naloxon-d5 333.2 > 128.0 > 273.1
Naloxon 328.1 > 221.1 > 284.1
Codein-d6 306.2 > 165.0 > 218.2
Codein 300.1 > 165.4 > 215.1
Dihydrocodein-d6 308.2 > 174.1 > 202.1 Dihydrocodein 302.2 > 171.1 > 199.1
Methylon-d3 211.2 > 135.2 > 163.2
Methylon 208.0 > 117.1 > 132.1
6-Acetylmorphin-d3 331.2 > 165.1 > 211.1 6-Acetylmorphin 328.1 > 165.1 > 211.1 Amphetamin-d5 141.0 > 92.8 > 124.0
Amphetamin 136.1 > 65.0 > 91.1
Oxycodon-d3 319.1 > 244.1 > 259.1
Oxycodon 316.1 > 241.0 > 256.1
Methamphetamin-d5 156.1 > 91.7 > 120.9 Methamphetamin 150.0 > 90.9 > 118.9
PMA 166.1 > 77.2 > 91.0
MDA-d5 185.2 > 135.0 > 168.1
MDA 180.1 > 79.4 > 163.1
MDMA-d5 199.2 > 107.2 > 165.1
MDMA 194.2 > 105.1 > 163.1
Butylon-d3 225.0 > 149.1 > 172.2
Butylon 222.2 > 146.1 > 174.2
PMMA 180.1 > 121.1 > 149.1
MDEA-d5 213.2 > 105.1 > 163.1
MDEA 208.1 > 104.9 > 163.0
Mephedron-d3 181.2 > 145.1 > 148.1
Mephedron 178.1 > 119.1 > 144.9
BDB 194.0 > 135.0 > 176.7
MDBD-d5 213.2 > 136.1 > 179.1
MBDB 208.1 > 134.9 > 176.9
Ketamin-d4 242.1 > 128.9 > 183.1
Ketamin 238.1 > 125.0 > 179.1
Benzoylecgonin-d3 293.1 > 104.9 > 171.0 Benzoylecgonin 290.1 > 104.9 > 168.0 Methylphenidat-d9 243.2 > 61.1 > 93.1 Methylphenidat 234.2 > 56.1 > 84.1 Tramadol-13C-d3 268.2 > 58.1 > 125.1
Tramadol 264.2 > 58.1 > 91.1
7-Aminoclonazepam-d4 290.1 > 121.1 > 226.1
