7 Material und Methoden
7.2 Entnahmesystem für die Speichelanalyse
Bei dem in unserem Labor eingesetzten Speichelsammelsystem handelt es sich um das "SCS" (Saliva Collection System) der Firma Greiner Bio-One (Kremsmünster, Österreich) (Abb. 5). Die Wahl viel auf dieses System auf folgenden Gründen:
- definierte Sammelzeit von 2 Minuten unabhängig vom Speichelfluss des Patienten
- pH-Stabilisierung im Mundraum während der Probennahme - kein Zwischenschritt mit saugfähigem Material an dem Analyten
adsorbiert werden können
- keine zusätzlichen stabilisierenden Reagenzien die die Massenspektrometrie stören können
- Durch die eingesetzte Pufferlösung (4 mL) wird immer eine ausreichende Probenmenge für mehrere Analysen gewonnen - Es wird immer eine A- und eine B-Probe gewonnen. Das bietet die
Möglichkeit durch eine Reanalyse aus der B-Probe bei zweifelhaften Ergebnissen Fehler im Labor auszuschließen oder zu bestätigen.
Die Probe wird durch Spülen 2-minütiges Spülen des Mundraums mit einer Speichelsammellösung (4 mL) (Abb. 4) erhalten. Die Speichelsammellösung enthält den Lebensmittelfarbstoff Tartrazin der eine photometrische Bestimmung des Speichelanteils in der vom Probanden abgegebenen Probe erlaubt. Hierfür werden die Extinktionswerte bei 450nm und 520nm bestimmt und die Differenz dieser beiden Extinktionswerte als analytisches Signal dem jeweiligen prozentualen Speichelanteil zugeordnet (Abb. 7). Der pH-Wert der Speichelsammellösung ist bei pH 4.2 gepuffert, was zum Einen den pH-Wert während der Probennahme konstant hält und zum Anderen den Speichelfluss stimuliert. Nach der Probennahme wird das Gemisch aus Speichel und Sammellösung in einem Becher aufgenommen (Abb. 3). Mit Hilfe zweier evakuierter Probenröhrchen werden anschließend eine A- und eine B-Probe gewonnen (Abb. 6). Dies ermöglicht eine Reanalyse der Probe bei zweifelhaften Ergebnissen. Die meisten anderen kommerziell erhältlichen Entnahmesysteme setzen saugfähiges Material wie Baumwolle oder Zellulose ein, durch die teilweise eine definierte Menge an Speichel aufgenommen werden kann.
Ein Problem das bei Patienten in Substitutionstherapie häufig auftritt ist Xerostomie oder Mundtrockenheit. Xerostomie wird verursacht durch einen verminderten Speichelfluss bzw. eine verminderte Speichelsekretion der Mund-speicheldrüsen. Die verminderte Speichelsekretion kann verschiedenen Ursachen haben [59] [60] [61]. Die Ursachen die bei Patienten in Substitutionstherapie relevant sind, sind zum Einen die Einnahme von Medikamenten, unter anderem auch Opiate und Opioide wie Methadon und Heroin. Durch Erkrankungen wie HIV und Hepatitis, die bei Patienten mit einem vorhergehenden intravenösen Drogenkonsum von beispielsweise Heroin, relativ häufig sind [62] kann ebenfalls eine Xerostomie ausgelöst werden. Bei xerostomen Patienten kann aus den oben genannten Gründen die Probennahme aufgrund des verminderten Speichelflusses deutlich länger dauern als vom Hersteller des Entnahmesystems vorgegeben. Falls keine Endpunktsanzeige für das gesammelte Probenvolumen vorhanden ist, kann dies zu einer Probe führen die sich im Nachhinein im Labor nicht analysieren lässt, da das Probenvolumen zu klein ist [63] [64]. Die Richtlinien zur Speichelanalytik fordern daher dass das gesammelte Speichelvolumen vordefiniert, bzw. bekannt ist.
Abb. 3: Speichelsammelsysem SCS pH 4.2 der Firma Greiner Bio-One, 1 = Speichelsammellösung, 2 = Becher in den die Speichelprobe abgegeben wird, 3 = evakuierte Probenröhrchen zur
Gewinnung der A- und B-Probe und zur Stabilisierung der Probe
Abb. 4: Speichelsammellösung
Abb. 5: Gewonnene Speichelprobe
Abb. 6: Aufnehmen der Probe in das Speichelsammelröhrchen (A- und B-Probe)
Abb. 7: Kalibration des Speichelanteils, mit steigendem Speichelanteil verringert sich die Extinktion, da sich die Konzentration des Farbstoffes Tartrazin verringert.
7.3 LC/MS-MS
7.3.1 Analysensystem
Das Analysensystem besteht aus einer Acquity UPLC der Firma Waters, bestehend aus einem binären Pumpensystem, zur Förderung der mobilen Phasen, einem Probenaufgabesystem, zur seriellen Injektion der Proben, und einem Säulenofen, zur Temperierung der chromatographischen Trennsäule. Die verwendete Säule ist eine ACQUITY UPLCBEH Phenyl 1.7µm, 2.1mm x 100mm. Der Säulenofen weißt eine Temperatur von 50°C auf. Die mobile Phase A besteht aus Ammoniumformiat 5mmol/L in Wasser mit einem Zusatz von 0.1% Ameisensäure.
Die mobile Phase B besteht aus Methanol mit 0.1% Ameisensäure. Die Analysenzeit beträgt 5 Minuten und die Flussrate liegt bei 0.4mL/min. Der binäre Hochdruckgradient setzt sich wie folgt zusammen.
Tabelle 3: Binärer Hochdruckgradient
Zeit [min] [%] mobile Phase A [%] mobile Phase B
0.00 80 20
3.50 30 70
4.00 0 100
5.50 0 100
5.51 80 20
6.00 80 20
Der Gradientenanstieg oder -abfall erfolgt dabei immer linear.
Als Detektor dient ein Xevo TQ MS-Massenspektrometer, ebenfalls von der Firma Waters. In der Ionenquelle werden die Analyten zuerst ionisiert und anschließend durch einen ersten Quadrupol geschleust. Dabei wird das jeweils aktuell zu analysierende Analytion selektiv aussortiert und in eine Kollisionskammer durchgeleitet. Dort erfolgt mit Hilfe des Kollisionsgases Argon eine irreversible Fragmentierung zu kleineren „Tochterionen“. Diese werden anschließend in einem zweiten Quadrupol selektiert und schließlich mit einem Photoelektronen-vervielfacher detektiert. Die Peakflächenverhältnisse der einzelnen substanz-spezifischen Fragmente werden neben der Retenzionszeit zur Substanz-identifizierung herangezogen. In der folgenden Tabelle sind die gemessenen Analyten mit dem entsprechenden Mutterion und den zugehörigen Tochterionen in der Form [Analyt] [(m/z) Mutterion] > [m/z 1. Tochterion] > [m/z] 2. Tochterion]
in der Reihenfolge ihrer Retention aufgeführt.
Tabelle 4: Ionenübergänge für alle Analyten und internen Standards
Morphin-d6 292.2 > 128.0 > 152.2
Morphin 286.2 > 165.2 > 201.1
2-Amino-5-Chloropyridin 129.0 > 93.1 > 112.0
7-Aminoclonazepam 286.0 > 121.0 > 222.0
Alprazolam 314.1 > 205.0 > 281.0
Temazepam-d5 306.1 > 260.1 > 288.1
Temazepam 301.0 > 255.1 > 283.2
Nordiazepam-d5 276.2 > 140.1 > 165.1
Nordiazepam 271.0 > 140.0 > 165.2
Diazepam-d5 290.2 > 154.1 > 198.1
Diazepam 285.0 > 153.9 > 192.9
THC-d3 318.2 > 123.1 > 196.1
THC 315.2 > 122.9 > 193.1
7.3.2 Reagenzien und Standards
Die verwendeten Referenzlösungen für die Analyten und internen Standards wurden über die Firma LGC Standards GmbH (Wesel) bezogen. Die
Analytkonzentrationen betragen 0.1 mg/mL, 1.0 mg/mL, 5.0 mg/mL oder 10 mg/mL in Methanol, Acetonitril, Ethanol oder Dichlormethan.
Tabelle 5: Referenzstandards
Analyt Interner Standard
Cortisol Cortisol-d4
Methadon Methadon-d9
Buprenorphin Buprenorphin-d4
Amphetamin Amphetamin-d5
Methamphetamin Methamphetamin-d5
MDA MDA-d5
MDMA MDMA-d5
MDEA MDEA-d5
MBDB MBDB-d5
BDB
Mephedron Mephedron-d3
Methylon Methylon-d3
Butylon Butylon-d3
PMA PMMA
Diazepam Diazepam-d5
Nordiazepam Nordiazepam-d5
Oxazepam Oxazepam-d5
Temazepam Temazepam-d5
Flunitrazepam Flunitrazepam-d7
7-Aminoflunitrazepam 7-Aminoflunitrazepam-d7
Clonazepam Clonazepam-d4
7-Aminoclonazepam 7-Aminoclonazepam-d4
Midazolam Midazolam-d4 1-OH-Midazolam 1-OH-Midzaolam-d4 Flurazepam
2-OH-Ethylflurazepam 2-OH-Ethylflurazepam-d4
Alprazolam Alprazolam-d5
1-OH-Alprazolam 1-OH-Alprazolam-d5
Bromazepam Broamzeapm-d4
Lorazepam Lorazepam-d4
Kokain Kokain-d3
Benzoylecgonin Benzoylecgonin-d3
Morphin Morphin-d6
6-Acetylmorphin 6-Acetylmorphin-d3
Codein Codein-d6
Norcodein
6-Acetylcodein 6-Acetylcodein-d3
Dihydrocodein Dihydrocodein-d6
Tetrahydrocannabinol Tetrahydrocannabinol-d3
Naloxon Naloxon-d5
Tilidin Tilidin-d6
Tramadol Tramadol-13C-d3
Oxycodon Oxycodon-d3
Fentanyl Fentanyl-d5
Zolpidem Zolpidem-d6
Zopiclon
2-Amino-5-Chloropyridin
Zaleplon Zaleplon-d5
Ketamin Ketamin-d4
Methylphenidat Methylphenidat-d9
Die verwendeten Lösungsmittel für das chromatographische System und die Probenvorbereitung sind Wasser, Methanol, n-Heptan, Ethylacetat, Dichlormethan und Ethylenglykol (alle Biosolve Chimie, Dieuze, Frankreich). Die verwendete Ameisensäure (98%) und der Ammoniak (32%) wurden von der Merck KG (Darmstadt) bezogen.
7.3.3 Kalibration und Qualitätssicherung
Da zum Zeitpunkt der Analyse keine kommerzielle Qualitätskontrolle für die Matrix Speichel zur Verfügung stand, wird für jede Serie eine Matrixkalibration mit drei Kalibrationspunkten bei 0.5 ng/mL, 1.0 ng/mL und 5.0 ng/mL durchgeführt um die Cutoffkonzentration von 1 ng/mL abzusichern. Des Weiteren dient der Kalibrationspunkt bei 0.5 ng/mL dazu die Empfindlichkeit des
Analysensystems täglich zu prüfen. Kann ein Analyt bei dieser Konzentration nicht mehr nachgewiesen werden, muss das System entsprechend den Herstellervorgaben gewartet werden. Als Kalibratormatrix dient eine Mischung aus 50% SES-Puffer und 50% artifiziellem Speichel (beides Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich). Dafür wird eine Stammlösung mit den Analyten aus Tabelle 4 mit einer Konzentration von 1.0 µg/mL in Methanol hergestellt. Anschließend werden je 10 mL der negativen Kalibratormatrix mit der erforderlichen Menge, zum Erreichen der Kalibratorkonzentration, dieser Stammlösung versetzt und gemischt.
Die Kalibratoren werden zu je 550 µL in Eppendorfgefäßen aliquotiert und bei -20
°C gelagert. Die Stabilität der eingefrorenen Kalibratoren wird über die Steigung der Eichgeraden kontinuierlich überprüft.
7.3.4 Extraktionssäulen
Die Probenaufreinigung erfolgt mit einer sogenannten stationären Flüssig-Flüssig-Extraktion. Die hierfür verwendeten Extratkionssäulen wurden selbst hergestellt.
Dafür wurden 150 mm Pasteurpipetten (CS-Chromatographie Service, Langerwehe) zuerst mit einer kleinen Menge Glaswolle versehen. Diese dient dazu, zu verhindern, dass das Extraktionmaterial in die Kapillare der Pasteurpipette rieseln kann. Anschließend wird die Pasteurpipette mit ca. 500 mg CHEMTUBE-HYDROMATRIX (Agilent Technologies, Stuttgart) beladen (siehe Abb. 8). Die CHEM TUBE-HYDROMATRIX (Agilent Technologies, Stuttgart) ist ein natürliches Granulat aus Diatomeenerde, das hauptsächlich aus Kieselgur Cristobalit und Siliciumdioxid besteht. Zum befüllen der der Pasteurpipette wird eine Urin-Monovette (Sarstedt AG & Co KG, Nümbrecht) mit dem Extraktionsmaterial befüllt. Anschließend wird mit der zugehörigen Saugspitze der Monovette das Material lose in die Pasteurpipette eingebracht ohne es zu verdichten. Den Endpunkt beim Einfüllen markiert eine Verjüngung am oberen Ende der Pasteurpipette (Abb. 8).
7.3.5 Probenvorbereitung
Vor dem Beginn der Aufarbeitung werden die aliquotierten Proben (500 µL Speichel/SES) mit internem Standard (10 µL in Methanol] versetzt. Die Konzentration wurde so gewählt, dass der gewünschte Cutoff für alle Substanzen von 1 ng/mL abgesichert werden kann. Das heißt im Falle einer Probe mit einem Speichelanteil von 50% muss es möglich sein den Analyten und auch den internen Standard mit einer Konzentration von 1 ng/mL sicher nachzuweisen. Der interne Standard enthält 44 deuterierte Substanzen (vgl. Tabelle 4) mit einer Konzentration von je 25ng/mL. Dies entspricht einer absoluten Menge von 250pg je 500µL Probe oder 0.5ng/mL. Zur Deuterierung wurde vom Hersteller je Substanz eine verschiedene Anzahl von Wasserstoffatomen durch Deuterium, bzw. Fall des
Tramadols zusätzlich das Kohlenstoffisotop 12C durch 13C ersetzt. Dies ermöglicht bei nahezu identischen chemischen und physikalischen Eigenschaften eine massenspektrometrische Trennung der beiden Substanzen. Des Weiteren kann durch den Bezug der Analytkonzentration auf den korrespondierenden internen Standard eine Kalibrierung des Analysensystems erfolgen. Tagesabhängige Schwankungen in der Empfindlichkeit des Detektors und eine Matrixbedingte Signalverminderung können dadurch ausgeglichen werden.
Die Proben werden mit Hilfe einer stationären Flüssig-Flüssig-Extraktion aufgearbeitet. Dabei wird die wässrige Phase der Probe an der Oberfläche der Hydromatrixpartikel adsorbiert. Anschließend kann mit Hilfe eines nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches durch vorbeifließen eine Extraktion der lipophilen Substanzen aus der Probe erfolgen.
Um die notwendige Empfindlichkeit zu erreichen wird das gewonnene Eluat eingeengt. Hierfür wird Ethylenglykol dazugegeben. Ethylenklykol besitzt einen Siedepunkt von 197°C und dient dazu die Probe nicht bis zur Trockene einzuengen, da hierdurch die Wiederfindung leicht flüchtiger Substanzen, wie Amphetamine, stark vermindert wird.
- 500µL Speichel/SES in einem 1.5mL Polypropylengefäß vorlegen
- 10µL Interner Standard zugeben (25ng/mL für jede deuterierte Substanz (44) in Methanol entspricht 500pg/mL Probe)
- 50µL Ammoniak (32%) zugeben - Probe mischen (Vortexmischer)
- 4mL Glasgefäße mit 10µL Ethylenglykol versetzen - Probe auf Extraktionssäule geben
- Inkubation für 10min
- Extraktion in vorbereitete 4mL Glasgefäße mit:
4 x 0.5mL Extraktionslösung 1 (Ethylacetat/Heptan 80:20 (v/v)) 3 x 0.5mL Extratkionslösung 2 (Dichlormethan)
- Eindampfen des Extrakts bei 45°C unter leichtem Stickstoffstrom bis nur noch das Ethylenglykol im Glasgefäß als flüssige Phase vorliegt
- Aufnehmen der Probe in 100µL Methanol/Wasser/Ammoniak(32%) 50/48/2 (v/v/v)
- Injektion von 10uL in das UPCL-MS/MS-System
Abb. 8: Probenaufarbeitung mit der CHEMTUBE-HYDROMATRIX