7 Material und Methoden
7.1 Immunchemische Verfahren
7.1.1 Überblick
Kommerzielle in der medizinischen Diagnostik eingesetzte Immunoassays unterliegen in Deutschland dem Medizinprodukte-Gesetz und erfordern eine CE-Kennzeichnung. Ihr Einsatz in der Drogenanalytik von Urinproben hat sich über viele Jahre bewährt. Da die Analytkonzentrationen jedoch im Urin sehr hoch sind und die Zielanalyten teilweise die Metaboliten der missbrauchten Substanzen sind, reicht die Sensitivität und Spezifität dieser Technologie häufig nicht aus um Blut- oder Speichelproben zu messen. Immunoassays funktionieren nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Dabei bindet der gesuchte Zielanalyt als Antigen an einen gezielt hergestellten Antikörper, was eine hohe Selektivität der Analyse erlaubt [54]. Bei Immunoassays, die Gruppen von Analyten ähnlicher Struktur und Wirkung erfassen, wie Benzodiazepine, Opiate und Amphetamine muss berücksichtigt werden, dass sie mit den einzelnen Substanzen und deren Metaboliten in unterschiedlichem Ausmaß und kumulativ reagieren. Für immunchemische Gruppenteste ist die sogenannte Kreuzreaktivität der einzelnen Analyten wichtig für die Befundbeurteilung. Die Kreuzreaktivität eines Analyten ist die relative Konzentration zu der für den Gruppentest ausgewählten
"Leitsubstanz". Die Leitsubstanz wird verwendet um den Test zu kalibrieren. Bei einer Kreuzreaktivität von 50% ergibt sich für einen Analyten der in einer Probe die Cutoffkonzentration aufweist ein negatives Ergebnis. Ist die Kreuzreaktivität größer 100%, so können auch Konzentrationen unterhalb des Cutoff noch positive Screeningergebnisse erzeugen. Darüber hinaus kann sich die Kreuzreaktivität einzelner Substanzen in Abhängigkeit von der Konzentration ändern [54] [55] [56].
Zur Gewährleistung der Probenintegrität wird die oben beschriebene Perianalytik an der Probe durchgeführt. Dies dient der Feststellung einer Probenmanipulation durch den Probanden durch:
In vivo:
1. Exzessives Trinken 2. Einnahme von Diuretika
In vitro:
3. Verdünnung der Probe 4. Vertauschen der Probe
5. Zufügen von Störsubstanzen [57]
Bei der Perianalytik wird die Probe visuell und olfaktorisch geprüft, sowie die Kreatininkonzentration bestimmt. Sollten hier Proben, durch ungewöhnlichen Geruch, durch urinuntypische Färbung oder durch einen verminderten Kreatinin-wert auffällig erscheinen, muss dies bei der Befundinterpretation berück-sichtigt werden.
7.1.2 Verwendete Tests für die Speichelproben
Die Speichelproben wurden auf einem Olympus AU680 der Firma Beckman Coulter mit folgenden Tests vermessen:
7.1.2.1 Greiner One Speichelquantifizierungskit (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Österreich)
Der Test wird verwendet um den Speichelanteil in Proben zu bestimmen die mit dem Greiner Bio-One Speichelsammelsystem gewonnen wurden. Der Speichel-anteil wird benötigt um die Analytkonzentrationen der LC-MS Screeningmethode und der Amylasekonzentration im Speichel zu bestimmen. Weiterhin kann eine Manipulation der Probe durch Verdünnen nachgewiesen werden.
Kalibratorkonzentrationen: 11, 27, 46, 66, 85 % Speichelanteil in der Probe Referenzbereich: 10-80 % Speichelanteil in der Probe
Der Normbereich wurde in unserem Labor bestimmt und liegt zwischen 26% und 74% Speichelanteil in der Probe[53].
7.1.2.2 Amylase (Beckmann Coulter, Krefeld)
Quantitativer Test zur Bestimmung der α-Amylasekonzentration im Urin. Der Test wurde in unserem Labor an die Gegebenheiten der Speichelmatrix angepasst. Die
zu vermessenden Speichelproben werden durch das Analysengerät 1:100 verdünnt, um in den linearen Bereich des Testes zu kommen.
Kalibrator: 1500 U/L
Referenzbereich: > 10000 U/L (entspricht 100 U/L in der verdünnten Probe)
Der Normbereich wurde in unserem Labor bestimmt und liegt zwischen 23000 U/L und 433000 U/L[53].
Bei der Bestimmung der α-Amylasekonzentration im Speichel muss der Speichelanteil (siehe Punkt 7.1.2.1) zusätzlich berücksichtigt werden. Das quantitative Ergebnis bezieht sich hier auf die Analytkonzentration im Speichel und nicht im Speichel/Puffer-gemisch.
Die α-Amylasekonzentration ist einer der sogenannten perianalytischen Marker für die Matrix Speichel. Als endogene Substanz im Speichel ist sie ein Beleg für die Authentizität des Probenmaterials Speichel.
7.1.3 Verwendete Tests für die Urinproben
Die Urinproben wurden auf einem Olympus AU680 der Firma Beckman Coulter mit folgenden Tests vermessen:
7.1.3.1 DRI Creatinine-Detect-Test (Thermo Scientific, Passau)
Der Test wird zur quantitativen Bestimmung der Kreatininkonzentration im Humanurin verwendet. Kreatinin ist ein sogenannter perianalytischer Marker, der es erlaubt eine Verdünnung beziehungsweise die Abgabe einer Ersatzflüssigkeit an Stelle von Urin nachzuweisen.
Kalibratorkonzentration: 20 mg/dL
Referenzbereiche [43]: > 20 mg/dL (unverdünnte Proben)
≤ 20 mg/dL und > 5mg/dL (intentionell verdünnte Probe)
≤ 5 mg/dL (Es handelt sich nicht oder vorwiegend nicht um eine Urinprobe)
7.1.3.2 CEDIA
Amphetamin/Ecstasy-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Amphetamin und Ecstasy im Humanurin. Der Test reagiert mit unterschiedlichen Kreuzreaktivitäten auf eine Vielzahl weiterer Designeramphetamine und strukturell dem Amphetamin verwandten Analyten aus z.B. der Phenylethylamingruppe.
Substanzen (Kreuzreaktivitäten bezogen auf d-Methamphetamin, Herstellerangabe):
d-Amphetamin (104%), l-Amphetamin (1.0%), Amphetamin (88%),
d/l-Methamphetamin (77%), MDA (116%), MDMA (196%), MDEA (172%), MBDB (121%), BDB (76%), PMA (24%), PMMA (100%)
Es ist davon auszugehen, dass auch andere strukturell dem Amphetamin ähnliche Substanzen aus der Phenylethylamingruppe relevante Kreuzreaktivitäten
aufweisen.)
Kalibration: 0, 150, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL d-Methamphetamin Cutoff: 500 ng/mL (Herstellerangabe: 500 bzw. 1000 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 150 ng/mL und 300 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.3 CEDIA
Benzodiazepin-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Benzodiazepinen im Humanurin. Der Test reagiert mit unterschiedlichen Kreuzreaktivitäten auf eine Vielzahl von Benzodiazepinen und deren Metaboliten. Da der Test jedoch nahezu nicht auf Benzodiazepin-Glucuronide reagiert wurde dieser in unserem Labor abgeändert. Entsprechend einer Empfehlung des Herstellers wird ein Hydrolyseschritt mit β-Glucuronidase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) durchgeführt. Dies dient dazu die zum Teil glucuronidierten Benzodiazepine [58]
besser nachweisen zu können.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Nitrazepam, Herstellerangabe):
7-Aminoflunitrazepam (99%), alpha-OH-Alprazolam (167%), Alprazolam (220%), Bromazepam (104%), Clonazepam (71%), Diazepam (154%), Flunitrazepam (109%), Flurazepam (195%), Lorazepam (115%), 7-Aminoclonazepam (96%), Nordiazepam (173%), Oxazepam (125%), Temazepam (93%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL Nitrazepam Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 200 bzw. 300 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.4 CEDIA
Cocaine Test (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Kokain und dessen Hauptmetaboliten Benzoylecgonin im Humanurin.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Benzoylekgonin, Herstellerangabe):
Benzoylecgonin (100%), Cocain (54%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2500 ng/mL Benzoylecgonin Cutoff: 50 ng/mL (Herstellerangabe: 300 bzw. 150 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.5 DRI
Opiat-Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung von Opiaten im Humanurin.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf Morphin, Herstellerangabe):
6-Monoacetylmorphin (107%), Codein (200%), Dihydrocodein (46%), Morphin (100%), Oxycodon (3%)
Kalibration: 0, 50, 100, 300, 500, 1000, 2000 ng/mL Morphin Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 300 bzw. 2000 ng/mL)
Die Kalibratoren bei 50 ng/mL und 100 ng/mL werden durch 1:10 bzw. 1:5 Verdünnung von kommerziellem Kalibratormaterial erzeugt.
7.1.3.6 CEDIA
Methadon-Metabolit (EDDP) Assay (Thermo Scientific, Passau)
Test zur qualitativen und semi-quantitativen Bestimmung des Methadon-hauptmetaboliten EDDP (2-Ethylidin-1,5-dimethyl-3,3-diphenyl-pyrrolidin) im Humanurin. Das EDDP wird als Zielanalyt gewählt, da damit eine manipulation eventuell erkannt werden kann. Eine Möglichkeit für eine Proben-manipulation ist die Zugabe einer kleinen Menge der erhaltenen Methadondosis zur eigenen Urinprobe durch den Patienten. Das Ziel des Patienten ist hier den Eindruck zu erwecken er hätte sein Substitut eingenommen. Eine andere Möglichkeit der Probenmanipulation ist die Zugabe einer kleinen Menge Methadon zu einer negativen Fremdprobe. Dies dient dazu einen Beigebrauch von Drogen zu verschleiern, und soll mit Ausnahme des Substituts, die Drogenfreiheit des Patienten belegen. Durch die Messung des EDDP kann so eine derartige Probenmanipulation aufgedeckt werden.
Substanzen (Kreuzreaktivität bezogen auf EDDP, Herstellerangabe):
Methadon (<0.1%)
Kalibration: 0, 100, 500, 1000, 2000 ng/mL EDDP Cutoff: 100 ng/mL (Herstellerangabe: 100 ng/mL)