Zum Sommerekzem, eine Typ I-Allergie beim Islandpferd

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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Zum Sommerekzem, eine Typ I-Allergie beim Islandpferd:

Verlauf der in vivo-Sensibilisierung von basophilen Granulozyten nachgewiesen mit einem funktionellen in vitro-Test (FIT)

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Christine Kobelt

aus Karlsruhe

Hannover 2001

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Leibold

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Leibold 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Eckehard Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 31. Mai 2001

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Meinen Eltern und Großeltern gewidmet

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Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung und Zielsetzung ... 9

2. Literaturübersicht ... 12

2.1 Allergien bei Mensch und Pferd... 12

2.1.1 Die verschiedenen Allergietypen... 12

2.1.2 Mechanismen der Typ I Allergien... 13

2.1.3 Überblick über Typ I Allergien beim Pferd... 14

2.1.4 Das Sommerekzem als Typ I Allergie... 15

2.1.5 Der anaphylaktische Schock... 16

2.1.6 Chronisch obstruktive Bronchitis (COB) ... 17

2.2 Allergiediagnostik beim Pferd... 17

2.2.1 Provokationsversuche... 17

2.2.2 In vitro Allergietests ... 20

3. Geräte, Material und Methoden... 22

3.1 Geräte ... 22

3.2 Material ... 22

3.2.1 Verbrauchsmaterialien... 22

3.2.2 Reagenzien ... 23

3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ... 26

3.2.4 Antigene für die Histaminfreisetzung ... 28

3.2.5 Tiere... 31

3.3 Methoden... 36

3.3.1 Blutentnahme... 36

3.3.2 Gewinnung von Serum... 36

3.3.3 Gewinnung von gewaschenen Blutzellen... 36

3.3.4 Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Vollblut... 37

3.3.5 Anfertigen von Blutausstrichen... 37

3.3.6 Aufreinigung von Allergenpräparationen... 37

3.3.7 Durchführung der Histamin-Freisetzung... 38

3.3.8 Bestimmung von Histamin im RIA... 40

3.3.9 Statistische Auswertungen ... 44

4. Ergebnisse ... 45

4.1 Untersuchung der Sensibilisierung von Pferden in Island... 45

4.1.1 Untersuchung der Pferde in Island auf eine Sensibilisierung gegenüber Culicoides nubeculosus ... 45

4.1.2 Untersuchung der Pferde in Island auf weitere Insektenallergene... 46

4.1.3 Antikörper bedingte Histaminfreisetzung der Tiere in Island ... 47

4.2 Altersabhängige Sensibilisierung basophiler Granulozyten bei Jungpferden in Süddeutschland... 48

4.2.1 Reaktionen bei Fohlen in ihrem ersten Herbst ... 49

4.2.2 Reaktionen einjähriger Pferde vor und nach dem Sommer... 52

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4.2.3 Reaktionen zweijähriger Pferde vor und nach dem Sommer im FIT ... 54

4.2.4 Reaktionen dreijähriger Pferde vor und nach dem Sommer im FIT ... 59

4.3 Sensibilisierungsverhalten bei Pferden mit und ohne anamnestischer Erkrankung an Sommerekzem unter Allergenkarenz auf Spiekeroog ... 63

4.4 Verlaufsuntersuchung von Sommerekzem kranken und symptomfreien Pferden 70 4.4.1 Übereinstimmung der im FIT (3.3) erfaßten Sensibilisierung der basophilen Granulozyten und der auftretenden Klinik ... 70

5. Diskussion... 81

5.1 Untersuchungen zur Sensibilisierung von Pferden in Island... 81

5.2 Jungpferde ... 82

5.3 Pferde in Spiekeroog ... 83

5.4 Verlaufsuntersuchung... 84

5.5 Spezifität... 85

5.6 Hyposensibilisierungsmechanismen... 85

6. Zusammenfassung ... 88

7. Summary ... 91

8. Literaturverzeichnis ... 94

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Verzeichnis der Abkürzungen

µ mikro (x10^-6)

Abb. Abbildung Ak Antikörper

Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)

B0 Messung der maximal gebundenen Menge an Jod-Histamin (als „Tracer“) Bq Becquerel; SI-Einheit für die Aktivität einer radioaktiven Substanz

(1 Bq = 1 Zerfall pro Sekunde) bzw. beziehungsweise

ca. circa

CD Cluster of differentiation

COB chronisch obstruktive Bronchitis des Pferdes cpm counts per minute (Zählimpulse pro Minute) Cul. nub. Culicoides nubeculosus

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraacetat

FceRI Fce-Rezeptor I; Rezeptor, der den Fc-Teil von IgE mit hoher Affinität bindet FIT Funktioneller in vitro Test für Typ I Allergien

g Gramm

Ig Immunglobulin

IgA Immunglobulin A, bestehend aus 2 schweren (heavy, hier a) und 2 leichten (light) Ketten

IgE Immunglobulin E, bestehend aus 2 schweren (heavy, hier e) und 2 leichten (light) Ketten

IgG Immunglobulin G, bestehend aus 2 schweren (heavy, hier g) und 2 leichten (light) Ketten

IgM Immunglobulin M, aus 5 x 2 schweren (heavy, hier µ) und 2 leichten (light) Ketten bestehend (als Pentamer)

IL Interleukin

k kilo (x 10³)

l Liter

m milli (x10^-3)

M mol/l min Minute(n)

n nano (x10^-9)

N Normalität; H⁺ -(bei Säuren) bzw. OH^- -(bei Basen) Ionenkonzentration in mol/l

Nr. Nummer

NSB nicht spezifische Bindung, messbare Aktivität im RIA, die nicht durch Bindung am Antiserum zustande kommt

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) Pipes Piperazine-N, N`-bis [2-ethanesulfonic] acid

PEG Polyethylenglykol

RIA radio immuno assay (Radioimmuntest)

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s. siehe sek Sekunde(n) Tab. Tabelle

Tris Trishydroxymethylaminomethan v.a. vor allem

vergl. vergleiche

x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m / s²) z.B. zum Beispiel

ZaHis Ziege anti N-Acyl-Histamin Serum für den RIA

ZaP polyklonale, affinitätschromatographisch gereinigte Ziegeantikörper anti Pferd IgG (H+L)

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1. Einleitung und Zielsetzung

Das Sommerekzem ist eine beim Islandpferd weitverbreitete Erkrankung, welche einen hohen Pflegeaufwand erfordert und für die keine kausale Therapie bekannt ist. Hierbei handelt es sich um eine Typ I Allergie. Zur Diagnose von Typ I Allergien beim Pferd stand bisher nur der in vivo Provokationstest zur Verfügung, der eine hohe Belastung für den Patienten darstellt. Seine Durchführung ist relativ aufwendig und beinhaltet zudem die Gefahren einer akuten, anaphylaktischen Reaktion oder Polyallergisierung.

Durch die Arbeit von KAUL (1998) und den von ihr entwickelten funktionellen in vitro Allergietest ist nun eine neue Diagnosemöglichkeit geschaffen: Dieser Test erfaßt die in vivo Sensibilisierung der basophilen Granulozyten im Blut des Spenders. Er weist damit die Spezifität und Dichte der auf Basophilen gebundenen Antikörper nach. Weiter erfaßt er nur diejenigen Immunglobulinisotypen, die in funktionell wirksamer Form an die basophilen Granulozyten binden können. Damit wird es erstmals möglich, eine Typ I Allergie beim Pferd zuverlässig nachzuweisen, ohne wissen zu müssen, welche Immunglobulinisotypen diese überhaupt vermitteln und ohne spezifische Reagenzien gegen die einzelnen Isotypen haben zu müssen. Dieser Test ist jeder Form von freiem Antikörpernachweis (RIST oder RAST) deshalb überlegen, weil damit qualitativ und quantitativ nur die Antikörper erfaßt werden, die tatsächlich an basophilen Granulozyten gebunden sind, durch Aktivierung deren Degranulation vermitteln und damit eine Typ I allergische Reaktion auslösen können. Durch die Quantifizierung des freigesetzten Histamins wird selektiv nur die Reaktion der basophilen Granulozyten erfaßt und nicht, wie beim Leukotriennachweis, auch die Aktivierung von eosinophilen und neutrophilen Granulozyten. Somit haben wir durch die hier geprüften membranständigen Antikörper auf den basophilen Granulozyten ein selektives Nachweisverfahren für Typ I Allergien.

In dieser Arbeit soll mit dem funktionellen in vitro Test (FIT) der Grad und Verlauf der Typ I allergischen Sensibilisierung bei Islandpferden in unterschiedlichen Haltungs- und Alterssituationen, sowie zu verschiedenen Jahreszeiten geprüft werden. Dabei stehen folgende Fragen und Zielsetzungen im Vordergrund:

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1. Wie steht es mit der Typ I Sensibilisierung bei Pferden, die in einem Culicoides freien Gebiet (Island) aufgezogen und gehalten werden ?

Zu diesem Zweck wird erwachsenen Pferden in Island Blut entnommen und in Hannover auf den allergenspezifischen und „generellen“ Sensibilisierungsgrad ihrer basophilen Granulozyten im FIT untersucht.

2. Wie lange bleiben Pferde mit Sommerekzem nachweislich sensibilisiert, wenn sie sich für längere Zeit in Culicoides freier Umgebung (Allergenkarenz) auf Spiekeroog aufhalten ?

Hierfür werden Pferde auf Spiekeroog zu 3 verschiedenen Jahreszeiten untersucht, da dort aufgrund der klimatischen Verhältnisse praktisch keine Culicoiden vorkommen sollen und alle Pferde symptomfrei sind. Wenn von diesen Pferden welche ans Festland gebracht wurden, entwickelten sie binnen weniger Tage wieder das klinische Bild des Sommerekzems. Die hier zu untersuchenden Tiere waren in unterschiedlichem Alter mit und ohne vorherige Ausprägung von Sommerekzemsymptomen nach Spiekeroog gekommen. Sie leben dort seit 1 bis 15 Jahren symptomfrei.

3. Wann entwickeln Jungpferde eine nachweisbare Typ I Sensibilisierung, wenn sie in einem Gebiet mit starkem Culicoidesflug geboren und gehalten werden ?

Dazu werden Fohlen, Jährlinge und zwei- bzw. dreijährige Islandpferde eines großen Gestütes in Süddeutschland im Bezug auf die Sensibilisierung ihrer basophilen Granulozyten im Zeitverlauf (Frühjahr und Herbst) untersucht. Dieser Untersuchungsaspekt hat den Hintergrund, daß in Deutschland geborene Islandpferde bereits in ihrem ersten Sommer Stichen der Culicoidesmücken ausgesetzt sind. An Sommerekzem erkranken sie aber frühestens im 2. Sommer, meist aber später, in ihrem 3. oder 4. Lebensjahr. Bisher ist unbekannt, ob sie erst spät, kurz vor der klinischen Ausprägung sensibilisiert werden und daraufhin die allergischen Symptome entwickeln, oder ob sie lange vor den klinischen Erscheinungen bereits sensibilisiert sind.

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4. Wie steht es mit der Typ I Sensibilisierung bei erwachsenen Islandpferden mit und ohne klinischer Ausprägung von Sommerekzem in Abhängigkeit von der Jahreszeit ?

Hierzu werden im selben Gestüt wie oben (3.) erwachsene Islandpferde mit und ohne Sommerekzem zu verschiedenen Jahreszeiten auf ihren Sensibilisierungsgrad gegenüber den saisonal auftretenden Culicoiden untersucht.

5. Wie bewährt sich der funktionelle in vitro Test (FIT) für Typ I Allergien zu verschiedenen Jahreszeiten und unter Feldbedingungen ?

Der von KAUL (1998) entwickelte FIT war an relativ gut definierten Tieren entwickelt und nur in begrenztem Masse unter Feldbedingungen überprüft worden. Dort hat er sich im Rahmen seiner Aussagefähigkeit als zuverlässig erwiesen. Die Untersuchungen von Pferden in sehr unterschiedlichen Haltungssituationen, in verschiedenen Altersstufen und zu verschiedenen Jahreszeiten sollen eine weitergehende Beurteilung des FIT für seine diagnostische Wertigkeit bieten.

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2. Literaturübersicht

2.1 Allergien bei Mensch und Pferd

2.1.1 Die verschiedenen Allergietypen

Im Laufe der Zeit ist man dazu übergegangen die humanmedizinische Einteilung in vier Allergietypen (GELL und COOMBS, 1968) auch in der Veterinärmedizin zu übernehmen.

Bei der Typ I Allergie, welche auch als die „klassische“ Allergie bezeichnet wird, handelt es sich um die Hypersensibilität vom Soforttyp. Hierbei kommt es schon sehr schnell nach Allergenkontakt (wenige Minuten oder nach 20-40 Minuten) zum Auftreten von Symptomen.

Eine Typ I Allergie wird besonders effizient durch die Bindung von IgE-Antikörpern an die Oberfläche von basophilen Granulozyten und Mastzellen ausgelöst. Führt ein passendes Allergen zur Kreuzvernetzung der gebundenen Antikörper, kommt es zur Degranulation der Zellen und damit zur Freisetzung der in der Granula gespeicherten Mediatoren (Histamin, Heparin, u.a.). Außerdem werden weitere Entzündungsmediatoren gebildet (z.B. Leukotrien), welche zur verzögerten Form der Typ I Allergie führen. Dieser Wirkmechanismus ist für den Menschen nachgewiesen und führt bei ihm zu Symptomen wie Heuschnupfen, Asthma, u.a..

Antikörperabhängige, zytotoxische Hypersensibilitätsreaktionen werden als Typ II Allergien bezeichnet. Hierbei binden IgM- oder IgG-Antikörper an Antigene auf Zellen und Gewebe. Ihr besonders reagibler Fc-Teil aktiviert dann die Komplementkaskade oder Fcg- bzw. C3b- Rezeptor tragende Zellen. Diese Mechanismen führen zur Zerstörung von Zielzellen und Geweben. Medikamentenallergien und autoimmunhämolytische Anämien sind typische Beispiele für Typ II Allergien.

Bei den Typ III Allergien handelt es sich um Immunkomplex-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen. Bei diesen Erkrankungen werden primär Immunkomplexe von löslichen Antigenen und Antikörpern gebildet, welche sich im Gewebe und in Gefäßwänden ablagern. Durch die Aktivierung von Granulozyten, Mastzellen und des Komplementsystems kommt es zu Entzündungsreaktionen. Je nach Entstehungsort der Immunkomplexe entstehen entweder lokale Entzündungen, welche als Arthus-Reaktionen bezeichnet werden, oder systemische Erkrankungen (Serum-Krankheit).

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Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen werden als Typ IV Allergien bezeichnet. Diese werden nicht wie Typ I-III durch Antikörper ausgelöst. Hierbei handelt es sich um eine alleinige Reaktion durch Zellen, insbesondere um T-Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die Tuberkulin-Reaktion, bei der antigenspezifische T-Gedächtniszellen gegen die in den Makrophagen eingeschlossenen Mykobakterien gebildet werden. Diese T-Zellen lösen bei erneutem Kontakt mit dem Antigen eine infiltrative Entzündung aus. Die Kontaktallergien werden ebenfalls zu den Typ IV Allergien gerechnet (KLEIN, 1991; JANEWAY und TRAVERS, 1997; ROITT et al., 1987).

Als weiteren Allergie Typ und damit als Typ V Allergien werden solche Überempfindlichkeitsreaktionen diskutiert, welche nur durch Bindung der Antikörper an das Antigen vermittelt werden, ohne daß sekundär weitere Immunmechanismen eingeschaltet werden. Hierbei sind körpereigene Strukturen (z.B. Rezeptoren von Transportproteinen) die Ziele der Antikörper. Die Krankheitssymptome entstehen hierbei nicht durch Antikörper vermittelte Effektorfunktionen des Immunsystems (z.B. Zytotoxizität), sondern durch Beeinflussung der Funktionen der durch die Antikörper gebundenen Strukturen (z.B.

Rezeptorblokade). Beispiele für solche Erkrankungen sind Myasthenia gravis, perniziöse Anämie und die Hashimoto Thyreoiditis (LEIBOLD, 1994).

2.1.2 Mechanismen der Typ I Allergien

Der Mechanismus der Typ I Allergie ist bisher bei Mensch und Maus am besten untersucht.

Es kommt dann zur Ausprägung einer Typ I Allergie, wenn ein Organismus Antikörper gegen normalerweise harmlose Antigene, auch Allergene genannt, bildet. Es handelt sich um Antikörper des IgE- oder IgG4-Isotyps. Der sogenannte Isotypenswitch von IgM- bzw. IgG- Antikörpern zu IgE-Antikörpern wird durch CD4⁺T-Helferzellen (TH2-Zellen) unter Einwirkung von Interleukin-4 (IL-4) bewirkt (DEL PRETE et al., 1988; FINKELMANN et al., 1988; PLAUT, 1990). IL-4 begünstigt beim Menschen ebenfalls die Bildung von IgG4- Isotypen (JANEWAY und TRAVERS, 1997). IgE-Antikörper können im Gegensatz zu anderen Antikörpern an den hochaffinen Fce-Rezeptor I (FceRI) binden, ohne zuvor ein Antigen gebunden zu haben. Dieser Rezeptor wird vor allem von den basophilen Granulozyten und den Mastzellen auf der Oberfläche exprimiert. Sie sind die Haupteffektorzellen der Typ I Allergie. Das vom Organismus gebildete IgE liegt überwiegend in gebundener Form vor und ist nur in sehr geringen Konzentrationen frei im Blutplasma zu finden.

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Bei einem erneuten Allergenkontakt bindet dies nun direkt an den gebundenen IgE- Antikörper, wodurch es zu einer Kreuzvernetzung dem sogenannten bridging der IgE- Moleküle kommt. Dies führt zu einer Zusammenlagerung der FceI-Rezeptoren und damit zu einer Aktivierung der basophilen Granulozyten bzw. der Mastzellen. Die Aktivierung äußert sich zum einen in einer Degranulation und somit einer Ausschüttung präformierter Mediatoren und zum anderen in einer Neubildung von Mediatoren. Zu den präformierten Mediatoren gehören z.B. Histamin, Heparin, verschiedene Enzyme und Zytokine. Alle diese Mediatoren werden in der Granula gespeichert.

Zu den neugebildeten Mediatoren zählen die Leukotriene, Prostaglandine und Thromboxane.

Am besten untersucht ist der vasoaktive Mediator Histamin: Er führt u.a. zur Vasodilatation, erhöhter Kapillarpermeabilität und Bronchokonstriktion. Zusammen mit den übrigen präformierten Mediatoren löst das Histamin eine sofortige Entzündungsreaktion aus, welche dann durch Enzyme und die neugebildeten Leukotriene aufrechterhalten wird. Die spätere Phase der Entzündung wird durch chemotaktische Zytokine und Mediatoren eingeleitet, welche die zelluläre Infiltration durch neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten sowie mononukleäre Zellen induzieren.

Die drastischste Verlaufsform der Typ I Allergie ist der anaphylaktische Schock, der meist dann ausgelöst wird, wenn das passende Allergen z.B. durch Injektion direkt in die Blutbahn gelangt und dort eine systemische Reaktion der basophilen Granulozyten und vieler Mastzellen des vaskulären Bindegewebes auslöst. Die systemische Aktivierung dieser Zellen verursacht Gefäßerweiterungen, die zu einem starken Blutdruckabfall und so zu einem Kreislaufkollaps führen können. Eine starke Bronchokonstriktion und das Anschwellen der Schleimhäute der Atemwege können zum Erstickungstod führen.

Von der Typ I Allergie abzugrenzen sind anaphylaktoide Reaktionen. Sie führen ebenfalls zur Aktivierung und nachfolgenden Degranulation von basophilen Granulozyten und Mastzellen.

Im Gegensatz zu den anaphylaktischen Reaktionen der Typ I Allergie ist die Aktivierung der Zellen aber nicht durch Antikörper vermittelt. Anaphylaktoide Reaktionen treten schon beim ersten Kontakt mit der auslösenden Substanz auf. Diese Reaktionen können die Komplementfaktoren C3a und C5a (auch als Anaphylatoxine bezeichnet), Calcium- Ionophore, verschiedene Peptide (wie z.B. Mellitin und ACTH) und Medikamente (HAPKE, 1981) auslösen.

2.1.3 Überblick über Typ I Allergien beim Pferd

Aufgrund der bisher schwer zu interpretierenden Diagnoseverfahren (2.2) wird die Einordnung der verschiedenen Erkrankungen des Pferdes als Typ I Allergie hauptsächlich aufgrund der klinischen Erscheinungen sowie aufgrund der Reaktion der Patienten auf

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diagnostische Injektionen mit Glukokortikoiden vorgenommen. Die Mechanismen der Typ I Allergie, welche für den Menschen untersucht sind, werden bisher für das Pferd übernommen, obwohl sie noch nicht nachgewiesen sind.

Als Erkrankungen, welche zu den Typ I Allergien zählen, werden bisher der anaphylaktische Schock, das Sommerekzem und die chronisch obstruktive Bronchitis (COB) angesehen. Bei verschiedenen Formen der Urticaria, Durchfallerkrankungen u.a. wird eine allergische Genese als mögliche Ursache diskutiert.

2.1.4 Das Sommerekzem als Typ I Allergie

Schon in sehr früher Zeit wurden von verschiedenen Autoren in zahlreichen Ländern Symptome einer saisonal auftretenden Hauterkrankung bei Equiden beschrieben. Es wird auch schon sehr früh die maßgebliche Beteiligung von Insekten an der Entstehung der Ursache diskutiert. HENRY und BORY veröffentlichten 1937 den Inhalt des Berichtes von LECOQ (1840), indem von einer 6 jährigen Stute berichtet wird, die an einer stark juckenden Hauterkrankung litt. In dem Bericht wurden die Bindung der Symptome an die Sommermonate, die Hautwunden an den typischen Lokalisationen und das jährliche Wiederkehren der Symptome beschrieben.

Auch heute ist das Sommerekzem des Pferdes als eine saisonale Dermatitis, die insbesondere an Mähne, Schweifansatz und Bauchnaht lokalisiert ist, anzusehen. Zu Beginn der Erkrankung treten gerötete Papeln und Pusteln auf, die stark jucken und damit die Pferde veranlassen sich zu scheuern. Dies führt erst zu Haarverlust, dann zu Hautläsionen und zu bakteriellen Infektionen (ANDERSON et al., 1996).

Nachdem lange über die Ursache diskutiert wurde, stellten MELLOR und MC CAIG bereits 1974 Untersuchungen dazu an und zeigten, daß aufgrund der Lokalisationen der Erkrankung und der Verbreitung von verschiedenen Culicoidesarten und Microfilarien (Onchocercen) an den verschiedenen Körperregionen, Culicoides pulicaris der wahrscheinliche Auslöser des Sommerekzems in England ist.

BAKER und QUINN zeigten 1978, daß alle 7 an Sommerekzem erkrankten Pferde auf intradermal applizierte Culicoides-Extrakte reagierten, während auf Stomoxys calcitrans nur 3 und auf Tabaniden keines der Pferde reagierte. Beim Sommerekzem sind im histologischen Präparat typischerweise ein subepidermales Ödem, eine begrenzte Eosinophilie und dilatierte Blutgefäße zu finden. Die intradermalen Injektionen mit Culicoiden-Extrakten führten ebenfalls zu ähnlichen Bildern.

Weitere in den darauffolgenden Jahren durchgeführte Untersuchungen bestätigten, daß Mücken der Gattung Culicoides für die Ausprägung des Sommerekzems hauptverantwortlich

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sind (QUINN et al., 1983; FADOK und GREINER, 1990). Weiter zeigten QUINN et al.

(1983) sogar, daß die Fähigkeit der Haut auf Culicoides-Extrakte zu reagieren von erkrankten auf gesunde Tiere zu übertragen ist. Diese Tatsache bestärkt den Verdacht, daß es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt.

Daß es sich in den verschiedenen Regionen der Erde um unterschiedliche Culicoides Arten handelt, belegen zahlreiche Untersuchungen. So zeigten z.B. MELLOR und MC CAIG 1974, daß Culicoides pulicaris in England verantwortlich für das Auftreten von Sommerekzem ist, während in Kanada Culicoides variipennis (ANDERSON et al., 1988; ANDERSON et al., 1993) eine Hauptursache für die Erkrankung ist.

Über das Vorkommen von Culicoiden in Island, wo das Sommerekzem nicht auftritt, sind keine sicheren Angaben zu machen.

Eine Umfrage, die ANDERSON et al. 1988 bei Tierärzten und Pferdebesitzern durchführten, ergab keinen Einfluß von Geschlecht, Farbe, Rasse oder Größe der Pferde auf die Ausprägung eines Sommerekzemes. Es wurde aber deutlich, daß einige Zuchtlinien stärker betroffen waren, so daß sie eine erbliche Komponente in der Ätiologie diskutierten. Auch STROTHMANN konnte 1982 in einer genetischen Studie das gehäufte Auftreten in der Nachkommenschaft bestimmter Stuten und Hengste demonstrieren. MARTI et al. beschreiben 1992 auch bei schweizerischen Warmblütern eine eindeutige Häufung des Auftretens von Sommerekzem in bestimmten Hengstlinien. Sie gehen davon aus, daß das Sommerekzem eine multifaktorielle Erkrankung ist, die sowohl heriditäre als auch Umweltfaktoren beinhaltet.

2.1.5 Der anaphylaktische Schock

Der anaphylaktische Schock ist die vom praktischen Tierarzt gefürchtete Reaktion, welche in der Regel auf die Behandlung mit Injektionen eintreten kann. Sie wird ausgelöst, wenn dem Pferd eine Substanz injiziert wird, gegen die das Pferd bereits sensibilisiert ist. Meist handelt es sich vor allem um Seren, Impfstoffe und Antibiotika (ERYE und HANNA, 1980), aber auch Antiphlogistika und „Stoffwechsel“-Präparate lösen häufig anaphylaktische Reaktionen aus (DEEGEN und BRANDT, 1997). Die klinischen Symptome kommen durch starken Blutdruckabfall zustande (ERYE und HANNA, 1980). Sie äußern sich vor allem in Schwanken, Zittern, Schwitzen, Niederstürzen, Dyspnoe und Exzitationen (DEEGEN und BRANDT, 1997). Pferde, die das akute Schockgeschehen überleben, können eine hypermotile Kolik, ein Lungenemphysem und/oder –ödem, Urticaria, Hufrehe oder Haut- und Schleimhautblutungen ausprägen (ERYE und HANNA, 1980).

DEEGEN und BRANDT haben 1997 durch eine Umfrage bei Tierärzten festgestellt, daß tödliche anaphylaktische Reaktionen besonders häufig bei Trimethoprim-Sulfonamid-

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Präparaten, aber auch bei anderen Antibiotika und antiinfektiven Chemotherapeutika auftreten.

2.1.6 Chronisch obstruktive Bronchitis (COB)

COB ist eine Erkrankung, die vor allem durch chronischen Husten, Leistungsminderung, Nasenausfluß und expiratorische Dyspnoe charakterisiert ist (DERKSEN, 1993). Die Stärke der Symptome hängt dabei stark von der Erkrankungsdauer und der aktuellen Umweltbelastung ab. Entzündung und Konstriktion der Bronchien führen zu den Symptomen und können bis zur Obstruktion der Atemwege bis hin zum alveolären Emphysem führen (ROBINSON und SORENSEN, 1978; DERKSEN, 1991). Nach EVANS et al. (1992) erkranken wesentlich mehr Pferde, die in staubigen, schlecht belüfteten Ställen gehalten werden, als solche, die in Weidehaltung gehalten werden.

Nach zahlreichen durchgeführten Intrakutan- (SCHATZMANN und GERBER, 1972;

HALLIWELL et al., 1979; EVANS et al., 1992; MC GORUM et al., 1993a) und Inhalationsprovokationstests (MC GORUM et al., 1993b; MC GORUM et al., 1993c; KLEIN und DEEGEN, 1986) wird heute bei den meisten Pferden eine allergische Genese der COB vermutet.

2.2 Allergiediagnostik beim Pferd

Bei Allergietests muß zunächst zwischen den in vivo Tests und den in vitro Tests unterschieden werden. Beide haben das Ziel, bei klinisch verdächtigen Pferden eine Allergie auf ein oder mehrere Antigene nachzuweisen.

2.2.1 Provokationsversuche

Unter Provokationsversuchen versteht man die Belastung des Individuums in vivo mit einem oder mehreren Substanzen (z.B. Histamin oder Antigen). Die Verabreichung erfolgt dabei entweder inhalativ oder intrakutan. Provokationsversuche stellen für den Patienten immer eine hohe Belastung und die Gefahr der Polyallergisierung dar.

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2.2.1.1 Intrakutantests

Intrakutantests wurden bisher vor allem bei Pferden mit COB oder Sommerekzem eingesetzt.

Da die Untersuchungen zu sehr kontroversen Ergebnissen führten, ist ihre Bedeutung in der Allergiediagnostik sehr umstritten.

a) Intrakutantests bei COB

SCHATZMANN und GERBER (1972) führten Intrakutantests mit verschiedenen Antigenen bei gesunden, als auch bei allergieverdächtigen und allergieunverdächtigen lungenkranken Pferden durch. Sie konnten auch wie MC GORUM et al. (1993a) und HOCKENJOS et al.

(1981) keine signifikante Übereinstimmung zwischen Klinik und Test feststellen.

EVANS et al. führten 1992 Intrakutantests an 3 verschiedenen Gruppen von Pferden durch:

1. an gesunden Kontrolltieren, 2. an COB erkrankten Tieren und 3. an Tieren mit rezidivierender Urticaria. Sie untersuchten dabei deren Hautreaktionen auf 58 verschiedene Antigene und stellten dabei fest, daß alle Pferde auf ein oder mehrere Antigene positiv reagierten. Obwohl die Pferde mit COB oder Urticaria auf einen größeren prozentualen Anteil der Antigene reagierten, gab es nur bei 3% aller Antigene bei COB-Pferden und bei 4,5% aller Antigene bei Urticaria-Pferden einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe. EVANS et al. (1992) schließen daraus, daß man aufgrund der Hautreaktionen auf einzelne Antigene nicht zwischen gesunden und kranken Tieren unterscheiden kann.

Im Gegensatz dazu wiesen HALLIWELL et al. (1979) hoch signifikante Unterschiede zwischen gesunden Pferden und solchen, welche unter COB litten, nach. Sie untersuchten dabei zahlreiche kommerziell erhältliche Präparationen von Schimmelpilzen und Actinomyceten, die in Pferdeställen vorkommen.

b) Intrakutantests bei Pferden mit Sommerekzem

Bei den Pferden mit Sommerekzem ergaben die durchgeführten Intrakutan-Tests ein ähnliches Bild. BAKER und QUINN beobachteten 1978 Unterschiede bei kranken und gesunden

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Tieren, welche sie mit Präparationen von Culicoides und Stomoxys calcitrans getestet haben.

Im Gegensatz dazu konnten QUINN et al. (1993), STROTHMANN (1982) und HALLDORSDOTTIR et al. (1989) keine signifikanten Unterschiede zwischen kranken und gesunden Pferden im Test feststellen.

c) Beurteilung von Intrakutantests

Insgesamt ist der Intrakutantest als eine Testmethode mit einem hohen Risiko an falsch- negativen und falsch-positiven Ergebnissen anzusehen. Ihr Wert wird deshalb mittlerweile von den meisten Autoren als sehr gering zur Allergiediagnostik angesehen. Außerdem kommt hinzu, daß die Pferde bei dieser Testmethode einer starken Belastung durch das Antigen und einer damit verbundenen Gefahr der Sensibilisierung auf ein Antigen, auf welches sie vorher nicht allergisch reagierten, ausgesetzt sind (MAGRO et al. 1987).

2.2.1.2 Inhalationstests

Der Inhalationstest wurde bisher im wesentlichen bei Pferden mit COB untersucht. Die Tiere wurden hier entweder mit möglichen Antigenen oder mit Histamin provoziert.

a) Inhalationstest mit Antigenen

Inhalations-Provokationstests mit ultraschallvernebelten Antigenextrakten dienten vor allem der Erforschung von den an der COB-Auslösung beteiligten Antigenen. MC GORUM et al.

(1993b) ließen gesunde und COB-kranke Pferde verschiedene Antigene inhalieren. Zur Kontrolle dienten die Inhalationen von PBS und die natürliche Exposition von Heu und Stroh.

Die natürliche Exposition führte bei allen COB-kranken Pferden ebenso wie verschiedene Antigene zu Krankheitssymptomen. Im Gegensatz dazu reagierten die gesunden Tiere nicht.

Ähnliche Ergebnisse erhielten auch FAIRBAIRN et al. (1993).

MC PHERSON und THOMSON (1983) und MC GORUM (1994) empfehlen bei Pferden mit COB-Verdacht, aber wenig ausgeprägter Symptomatik, die Patienten unter ständiger

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Beobachtung in einen Stall mit schimmeligem Heu und Stroh zu stellen. Bei einer 24 Stunden später durchgeführten bronchoalveolären Lavage zeigten die COB-Pferde eine deutliche Sekretneutrophilie.

Insbesondere der natürliche Inhalationsprovokationsversuch scheint zur Diagnostik von COB- Pferden herangezogen werden zu können, aber er ist mit einer sehr hohen Belastung für das Tier verbunden. Nach SPECTOR (1989) wird der Inhalations-Provokationstest in der Humanmedizin nur dann eingesetzt, wenn Intrakutantest, Vorbericht und in vitro Testverfahren widersprüchliche Ergebnisse liefern. Dieser Test ist also auch in der Humanmedizin als allerletzte Diagnosemöglichkeit anzusehen.

b) Inhalationstest mit Histamin

Bei dem sogenannten Histamin-Inhalations-Provokationstest inhalieren die Patienten über eine Atemmaske Aerosole mit ansteigenden Histaminkonzentrationen. Die Reaktion auf die Histamininhalation wird anhand der Änderung der Lungenfunktionsparameter dynamische Compliance, Lungenwiderstand, Atemfrequenz und maximale intrathorakale Druckdifferenz beurteilt (KLEIN und DEEGEN, 1986). Sie fanden dabei keine unspezifische Hyperreagibilität bei den gesunden Pferden, aber bei 25% aller geringgradig und bei 100%

aller schwer COB-erkrankten-Pferden. Dieser Test prüft nur die Empfindlichkeit (Reagibilität) auf einen Hauptmediator der Typ I Allergie, das Histamin. Da dabei Allergene nicht berücksichtigt werden, kann jedoch nichts über die Ursache der Reagibilität ausgesagt werden.

2.2.2 In vitro Allergietests

Der große Vorteil bei in vitro Tests ist, daß den Patienten nur das benötigte Untersuchungsmaterial, in der Regel Blut, entnommen wird und ihnen damit die Belastung durch Kontakt mit den vermuteten Allergenen erspart bleibt.

2.2.2.1 Nachweis von IgE

In der Humanmedizin ist bekannt, daß IgE-Antikörper in der Lage sind, eine Typ I Allergie zu vermitteln.

(21)

Ein zuverlässiger, kommerziell erhältlicher Test zum Nachweis von IgE beim Pferd existiert bisher nicht. Die meisten bisher verwendeten IgE-Tests arbeiten mit polyklonalen Antikörpern (die überwiegend aus der Humanmedizin stammen), deren Aussage auf die Kreuzreaktivität zwischen humanen und equinen Antikörpern beruht. Über die Proteinstruktur des equinen IgE besteht weiterhin einige Unklarheit (VON BAEHR et al., 1999). Untersuchungen am Institut für Tierzucht an der Universität Bern zeigten jedoch, daß mit Hilfe von rekombinanten Allergenen sensitivere Möglichkeiten zum Nachweis von IgE zur Verfügung stehen könnten (EDER et al., 2000).

Arbeiten von WAGNER et al. (1997) und (1998) aus der hiesigen Arbeitsgruppe zeigten, daß das Pferd einen Genort (c_e) besitzt, der für die schwere Kette des IgE-Moleküls codiert. Bisher ist es aber noch nicht gelungen, das komplette Pferde IgE-Molekül in rekombinanter Form herzustellen. Mangels reinem vollständigem IgE gibt es auch noch keine Antikörper die ausschließlich mit Pferde IgE reagieren. Ohne reines IgE und spezifische Nachweisantikörper dagegen, kann weder die funktionelle Bedeutung von IgE bei der Typ I Allergie der Pferde untersucht werden, noch ein zuverlässiger serologischer IgE-Nachweis geführt werden.

2.2.2.2 Funktioneller in vitro Allergietest (FIT)

Nach zahlreichen Untersuchungen zu dem Thema der Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten (MAGRO et al., 1987; ABDEL-SALAM, 1989 und DIRSCHEL et al., 1993) ist es KAUL 1998 gelungen, einen Allergietest zu schaffen, welcher diese Freisetzung zuverlässig mißt und quantifiziert. Dieser Test, welcher in Kapitel 3 (3.3) näher beschrieben ist, beruht auf dem Prinzip, daß die basophilen Granulozyten mit den vermuteten Allergenen in verschiedenen Konzentrationen in Kontakt gebracht werden. Diese reagieren aber nur dann mit einer Histaminfreisetzung, wenn sie auf ihrer Oberfläche mit ausreichender Menge an Antikörpern sensibilisiert sind, die das Allergen spezifisch binden können. Das freigesetzte Histamin wird in einem RIA (radio immuno assay) quantifiziert und so als Maß für den Grad der Sensibilisierung der basophilen Granulozyten gewertet: Die durch Allergen freigesetzte Histaminmenge wird mit der ins Verhältnis gesetzt, welche durch die physikalische Freisetzung (Zellen werden durch kochen zerstört) oder durch die eines geeigneten Antikörpers freigesetzt wird (maximale Freisetzung). Die Höhe dieses Verhältnisses entscheidet darüber, ob ein Pferd in Bezug auf das getestete Allergen als sensibilisiert anzusehen ist.

(22)

3. Geräte, Material und Methoden

3.1 Geräte

Absaugpipette 10 ml

Analysenwaage, Typ B6 (Mettler-Toledo, Zürich) Brutschrank (Heraeus, Hanau) Brutschrank incubat Typ 80 (Melag) Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) LKB Wallac 1272 Clinigamma (Gamma-Counter) (Wallac Oy, Turku, Finnland) Kochtopf (Einzelhandel) Laborwaage L310 (Sartorius, Göttingen) Magnetrührer mit Heizplatte, Modell IKAMAG RH (Janke und Kunkel, Staufen) Mikrotiterplattenschüttler IKAMAG MTS 4 (Janke und Kunkel, Staufen) Mikroskop (Zeiss, Oberkochen) PH-Meter Typ 27 (Knick, Berlin) Pipetten, einstellbar 100-1000µl, 20-200µl, 1-20µl (Abimed, Langenfeld) Pipettierball

Röhrchen-Schüttler Typ Reamix (ASID, Unterschleißheim) SG Reinstwassersystem RS90-4UF (SG, Barsbüttel) Umkehrosmoseanlage Typ RO 50/14 SMB (SG, Barsbüttel) Zellzählkammer nach Bürker (Glaswarenfabrik K.Hecht, Sontheim/Röhn) Zentrifuge Labofuge Typ 3360 (Heraeus, Hanau)

3.2 Material

3.2.1 Verbrauchsmaterialien

Combitips biopur, 1,25 ml und 12,5 ml (Renner, Darmstadt, Nr. 13017) Einmalkanülen, 0,9x40 mm, steril (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 301300450) Kryoröhrchen, 2 ml mit Schraubverschluß (Roth, Karlsruhe, Nr. 81891) Objektträger (Jürgens, Omnilab, Hannover, Nr. 9161145)

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Pasteurpipetten, 150 mm (Brand, Nr. 747715) PD10-Säulen, Sephadex TM G-25M mersham Pharmacia, Uppsala, Schweden, Nr. 278512) Pipettenspitzen, blau und gelb (Sarstedt, Nürnbrecht, Nr. 70/762002undNr. 70/760002) Reaktionsgefäße, 1,5 ml (Greiner, Frickenhausen, Nr. 616201) Polystyrol-Röhrchen, 5 ml (Greiner, Frickenhausen, Nr. 115101) Spritzen steril, 1 ml (Roth, Karlsruhe, Nr. H9991) Vakutainerröhrchen, 10 ml, K3-EDTA Zusatz (15% 0,12 ml)

(Medicalis, Garbsen, Nr. 368457) Vakutainerröhrchen, 10 ml, silikonisiert (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 606530) Adapter für Vakutainerröhrchen (Becton Dickinson, Heidelberg, Nr. 607290) Zentrifugenröhrchen, 15 ml aus Polypropylen (Sarstedt, Nürnbrecht, Nr. 62.554.502) Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen (Geiner, Frickenhausen, Nr. 227270)

3.2.2 Reagenzien

Accustain (Färbelösung nach Wright, modifiziert) (Sigma, Deisenhofen, WS16) Acylierungsreagenz (LDN, Nordhorn) Calciumchlorid (CaCl2*2 H2O) (Sigma, Deisenhofen, Nr. C3881) Dimethylsulfoxid (DMSO) p.a. (J.T. Baker, Groß Gerau, Nr. 7033)

125 Jod-markiertes Histamin (LDN, Nordhorn) Magnesiumchlorid (MgCl2*6H2O), p.a. (Sigma, Deisenhofen, Nr. M0250) Natriumacid (Sigma, Deisenhofen, Nr. S2002) Natriumchlorid (NaCl) (Roth, Karlsruhe, Nr. 9265) PEG 8000

Pipes (Piperazine-N,N’-bis [2-ethanesulfonic] acid) (Sigma, Deisenhofen, Nr. P6757) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ohne Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ (Biochrom, Berlin, Nr. L182-10) Salzsäure, konzentriert (37%) (J.T. Baker, Großgerau, Nr. 6081) Triton X 100

Türks Lösung (Merck, Darmstadt, 9277) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (Sigma, Deisenhofen, Nr. P1379)

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3.2.2.1 Puffer und Lösungen

Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua dest. oder Aqua tridest. angesetzt. Das Aqua dest. wurde aus einer Umkehrosmoseanlage (3.1) gewonnen. Die Anlage verfügt über einen vorgeschalteten Aktivkohlefilter, eine Umkehrosmoseeinheit und eine nachfolgende Aufbereitung über ein Ionenaustauscherharz. Das Aqua tridest. wurde in einem nachgeschalteten Reinstwassersystem (3.1) hergestellt. Hierbei erfolgt die weitere Aufbereitung des Wassers über Aktivkohlefilter, einen Flachbettionenaustauscher und eine Ultrafiltration über eine Polysulfonhohlfasermembran, wobei insbesondere organische Substanzen entfernt wurden.

3.2.2.2 Puffer und Lösungen für den RIA

Die Reagenzien für den Histamin-RIA sind als Testkit der Firma DLD, Hamburg, Nr.

RA601/100 erhältlich. Im folgenden werden die Puffer, Lösungen und Antikörper beschrieben, wie sie im Testkit vorhanden sind, es sei denn, es wurden Veränderungen an den Reagenzien vorgenommen oder sie wurden komplett in der hiesigen Arbeitsgruppe hergestellt.

a) Release- Puffer

Statt des im Testkit vorhandenen Pipes-Puffer wurde zur Verdünnung der Histamin-Standards der unter (3.2.2.3) beschriebene Freisetzungspuffer verwendet.

b) Histamin-Standards

Für diese Arbeit wurden die Histamin-Standards selbst hergestellt. Sie dienten zur Erstellung einer Histamin-Standard-Reihe und enthielten Histamin in 0,1 N HCl in den folgenden Konzentrationen: 100, 30, 10, 3, 1 und 0,3 ng/ml

0,1 N HCl: Aqua tridest 996,2 ml

+ Konz. HCl (ca. 37%) 3,8 ml

Von jedem Standard wurden 10 ml hergestellt. Dazu wurde Histamin als freie Base in kristalliner Form auf der Analysenwaage abgewogen und in 0,1 N HCl gelöst. Die fertigen Standards wurden in 1 ml Portionen bei –20°C gelagert, die jeweils im Gebrauch befindlichen Portionen wurden bei 4°C aufbewahrt.

(25)

c) Tris-Puffer

Der im Testkit mitgelieferte Tris-Puffer mit einem pH von 8,5 wurde hier anders als im Testkit ohne Phenolrot eingesetzt. Er diente zur Pufferung der Acylierungsreaktion.

d) Acylierungsreagenz

Zur Umwandlung des nativen Histamins in N-Acyl-Histamin, welches vom Antikörper erkannt wird, ist ein Acylierungsreagenz notwendig. Dieses war im Testkit vorhanden und wurde direkt vor Gebrauch 1:25 mit Tris-Puffer verdünnt.

e) ¹²⁵ Jod Histamin-Tracer

Der radioaktive Tracer (Aktivität pro Lyophilisat für 2,5 ml < 55 kBq) wird als Lyophilisat, welches mit der angegebenen Menge Aqua dest. rekonstituiert wird, geliefert. Wurden für einen Versuch mehrere Flaschen gebraucht, wurden diese vor Gebrauch gemischt.

3.2.2.3 Puffer und Lösungen für die Histamin Freisetzung a) Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Die PBS Trockensubstanz wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Konzentrationen der Bestandteile betrugen:

NaCl 137,0 mmol/l

KCl 2,7 mmol/l

Na2HPO4 8,1 mmol/l KH2PO4 1,12 mmol/l

Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4.

b) Freisetzungspuffer

Der Freisetzungspuffer (Pipes B) ist eine Pipes gepufferte Lösung. Das Grundrezept stammt von MAASCH et al. (1984) und wurde geringgradig modifiziert. Er wurde als Stammlösung (Pipes A) bei –20°C eingefroren.

(26)

Pipes A (1-fach konzentriert):

NaCl 110 mmol/l

KCl 5 mmol/l

Pipes 25 mmol/l

NaOH 40 mmol/l

Der Pipes A Puffer wurde als 10-fach Konzentrat angesetzt, in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert und bei Bedarf 1:10 mit Aqua dest. verdünnt.

Für die Freisetzungsreaktion wurde dem Puffer Ca ²⁺ und Mg ²⁺ zugesetzt, da die Blutzellen vor der Freisetzung in Ca ²⁺/Mg ²⁺ freiem PBS vorliegen und diese Ionen für die Histaminfreisetzung benötigt werden (MAASCH et al., 1984; MAGRO et al., 1987). Für die Freisetzung sollen die Zellen eine Endkonzentration von 1 mmol/l Ca ²⁺ und 1 mmol/l Mg ²⁺

zur Verfügung haben. Der Puffer wurde jeweils nur in der Menge angesetzt, die in ca. 4 Wochen zu verbrauchen ist und solange bei 4°C gelagert.

Pipes B:

Pipes A mit 2 mmol/l CaCl2 und 2 mmol/l MgCl2, pH 7,4

3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien

3.2.3.1 Antikörper für den RIA a) Ziege anti Histamin Serum

Zum Nachweis von N-Acyl-Histamin diente ein Ziege anti N-Acyl-Histamin Serum (kurz Ziege a His), das von der Firma LDN als Reinserum zur Verfügung gestellt wurde.

Eingesetzt wurde es in einer Verdünnung 1:10000.

(27)

Ziege a Histamin (100 ml):

PBS (3.2.2.3) 98 ml

NaN310% 200 µl

Ziegennormalserum 1 ml Ziege a Histamin Reinserum 10 µl

b) Präzipitationsserum

Zur Präzipitation der im RIA gebildeten Immunkomplexe zwischen N-Acyl-Histamin bzw.

dem ¹²⁵Jod markierten Histamin-Tracer und den Ziege a His Antikörpern wurde ein Esel anti Ziege IgG Antiserum mit der Lot. Nr.: D09A 110389 eingesetzt, welches von der Firma Scantibodies Laboratory, Santee, California, USA erworben wurde.

Präzipitationsserum (Esel a Ziege):

PBS (3.2.2.3) 500 ml

PEG 8000 25 g

Triton X 100 25%ig 1 ml NaN3 10%ig 1 ml

Esel anti Ziege 2,5 ml

3.2.3.2 Antikörper für die Histaminfreisetzung a) Ziege anti Pferd IgG (H+L)

Die Ziege anti Pferd IgG (H+L) (kurz ZaP) affinitätschromatographisch gereinigten, polyklonalen Antikörper (Dianova, Hamburg, Nr. 108-005-003) wurden eingesetzt zur Kreuzvernetzung von Immunglobulinen auf der Oberfläche von basophilen Granulozyten.

Diese Antiköper erkennen sowohl die schweren Ketten von Pferde IgG, als auch die leichten Ketten von Pferdeimmunglobulin. Die gelieferte Stammlösung hatte je nach Charge eine Antikörperkonzentration von 2,4 mg/ml oder 2,3 mg/ml. Für die Histaminfreisetzung wurden die ZaP-Antikörper mit Pipes B (3.2.2.3) verdünnt. Jede neue Charge wurde zunächst mit den Konzentrationen 90, 60, 30, 20, 10, 3,3, 1,1 und 0,37 µg/ml auf ihre Fähigkeit, Histamin aus den Zellen freizusetzen, austitriert.

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3.2.4 Antigene für die Histaminfreisetzung

a) Culicoides nubeculosus

Die Culicoiden sind eine Gattung der Gnitzen und gehören zur Familie der Ceratopogonidae.

Es sind kleine (0,5-3 mm) Mücken, die sehr schmerzhafte Stiche mit Juckreiz und Quaddelbildung verursachen. Die Gnitzen werden als eine der wesentlich an der Entstehung des Sommerekzems beteiligten Insektenarten angesehen.

Culicoides nubeculosus ist eine in Deutschland weit verbreitete Gnitzenart. Die Präparation wurde von Greer-Laboratories aus den USA bezogen (Lot.Nr. XPB 68-R1). Die Präparation lag als Lyophilisat vor und wurde mit sterilem Aqua tridest. gelöst. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 1 mg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 50, 25, 15, 5, 0,5 und 0,05 µg/ml eingestellt.

b) Dermatophagoides farinae (Hausstaubmilbe)

Hausstaubmilben gehören zur Gattung der Glycyphagus (Staubmilben) und sind ubiquitär verbreitet. Ihre Inhalation kann beim Menschen eine Typ I Allergie auslösen. Die Symptome beschränken sich auf den Atmungstrakt.

Die Präparation wurde von Greer-Laboratories aus den USA bezogen (Lot.Nr. DP 01- 100396). Die Präparation lag als gebrauchsfertige Lösung vor. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 200 µg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 50 und 5 µg/ml eingestellt.

c) Ephemeroptera (Eintagsfliege)

Die Präparation wurde von Greer-Laboratories aus den USA bezogen (Lot.Nr. XPB 12-R2).

Die Präparation lag als Lyophilisat vor und wurde mit sterilem Aqua tridest. gelöst. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 2 mg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 50 und 5 µg/ml eingestellt.

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d) Heterocera (Motte)

Die Präparation lag als Lyophilisat vor und wurde mit sterilem Aqua tridest. gelöst. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 3,5 mg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 50 und 5µg/ml eingestellt.

e) Mosquitos (Stechmücken)

Mosquitos gehören zur Familie der Culicidae und sind ubiquitär verbreitet. Sie sind am aktivsten bei hoher Luftfeuchtigkeit, Wärme und Dämmerung.

Die Präparation lag als Lyophilisat vor und wurde mit sterilem Aqua tridest. gelöst. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 3,3 mg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 50 und 5 µg/ml eingestellt.

f) Musca domestica (Hausfliege)

g) Solenopsis invicta (Feuerameise)

(30)

h) Stomoxys calcitrans (Wadenstecher)

Stomoxys calcitrans gehört zur Familie der Muscidae und hier zu den endogenen Stall- und Hausfliegen. Sie werden vorwiegend an Kühen und Pferden an der Bauchunterseite und den Beinen gefunden. Gehäuft kommen sie im Früh- und Spätsommer vor.

Die Präparation lag als Lyophilisat vor und wurde mit sterilem Aqua tridest. gelöst. Die Proteinkonzentration der Lösung betrug 0,21 mg/ml. Die Stammlösung wurde über Sephadex PD10 Säulen aufgereinigt (3.3.6) und in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert. Zur Histaminfreisetzung wurde sie mit Pipes B (3.2.2.3) auf die Konzentrationen von 5 und 0,5 µg/ml eingestellt.

(31)

3.2.5 Tiere

Um den Grad und Verlauf der Typ I allergischen Sensibilisierung bei Islandpferden in unterschiedlichen Haltungs- und Alterssituationen, sowie zu verschiedenen Jahreszeiten mit dem funktionellen in vitro Test (FIT) zu prüfen, wurden Pferde aus verschiedenen Populationen untersucht.

a) Pferde des Gestütes Herridarholl, Hella, Island im Besitz von Renate Hannemann und Arnar Jónson

Nummer Geburtsjahr Geschlecht 1 1989 weiblich 2 1990 weiblich

3 1991 männlich, kastr.

4 1991 weiblich

7 1993 weiblich

10 1989 weiblich

Tab.1: Übersicht über die in Island untersuchten Tiere

Alle Pferde sind frei von Sommerekzem und gehören zu den Islandpferden.

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b) Pferde des Islandhofes in Spiekeroog von Frauke Füth

Tab.2: Übersicht über die in Spiekeroog untersuchten Pferde

Es handelt sich um Pferde mit und ohne Ausprägung von Sommerekzem am Festland, welche in Spiekeroog alle symptomfrei sind.

Nr. Geburtsjahr Geschlecht auf der Insel Alter bei "Umzug" Aufenthaltsdauer Sommerekzem seit nach Spiekeroog auf Spiekeroog (anamnestisch)

1 1983 männlich, kastr. 93 10 Jahre 6 Jahren nein

2 1984 weiblich 98 14 Jahre 1 Jahr ja

3 1992 weiblich 97 5 Jahre 2 Jahren nein

4 1979 männlich, kastr. 89 10 Jahre 10 Jahren ja

8 1979 weiblich 92 13 Jahre 7 Jahren ja

9 1977 männlich, kastr. 98 21 Jahre 1 Jahr nein

10 1987 weiblich 98 12 Jahre 1 Jahr ja

11 1977 weiblich 84 7 Jahre 15 Jahren ja

13 1979 männlich, kastr. 98 19 Jahre 1 Jahr nein

16 1990 männlich, kastr. 98 8 Jahre 1 Jahr ja

18 1986 männlich, kastr. 90 4 Jahre 9 Jahren nein

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c) Jungpferde des Gestütes Wiesenhof der Familie Podlech

Nummer Geburtsjahr Geschlecht

F33 99 weiblich

F34 99 weiblich

F35 99 männlich

F36 99 weiblich

F37 99 weiblich

F38 99 weiblich

F39 99 weiblich

F40 99 männlich

F41 99 männlich

F42 99 weiblich

Fohlen:

F1 98 weiblich

F2 98 weiblich

F3 98 weiblich

F4 98 weiblich

F5 98 weiblich

F6 98 weiblich

F7 98 männlich

F8 98 männlich

F9 98 männlich

F10 98 männlich

Jährlinge:

F11 97 männlich

F12 97 männlich

F13 97 männlich

F14 97 weiblich

F15 97 weiblich

F16 97 weiblich

F17 97 weiblich

F18 97 weiblich

F19 97 weiblich

F20 97 weiblich

F31 97 weiblich

F32 97 männlich

Zweijährige:

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Tabelle 3: Übersicht über die untersuchten Jungpferde

Bei allen Jungpferden handelt es sich um Islandpferde, welche auf dem Gestüt Wiesenhof ganzjährig in Weidehaltung in Herden gehalten werden.

Während des Untersuchungszeitraumes (Februar 99 bis Oktober 99), zeigte keines der Tiere klinische Symptome des Sommerekzems.

F21 96 männlich

F22 96 männlich

F23 96 männlich

F24 96 weiblich

F25 96 weiblich

F26 96 weiblich

F27 96 weiblich

F28 96 weiblich

F29 96 weiblich

F30 96 weiblich

Dreijährige:

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d) Erwachsene Pferde des Gestütes Wiesenhof:

Tab.4: Übersicht über die Tiere der Verlaufsuntersuchung

Die Pferde werden ganzjährig in Herdenhaltung in einer Auslaufhaltung mit Stall gehalten. Es handelt sich auch hier ausschließlich um importierte und kontinental gezogene Islandpferde.

Nummer Geburtsjahr Geschlecht Ekzem

1 1987 männlich, kastr. ja

7 1988 männlich, kastr. nein

17 1990 weiblich nein

29 1990 weiblich ja

30 1986 weiblich ja

31 1988 weiblich ja

32 1973 weiblich ja

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3.3 Methoden

3.3.1 Blutentnahme

Die Blutproben wurden mit einem sterilen Vakutainersystem (3.2.1) nach einer durchgeführten Desinfektion mit 70% Ethanol aus der gestauten Vena jugularis entnommen.

Je Tier wurde ein K-EDTA Röhrchen (15%, 0,12 ml) für die Versuchsdurchführung und ein silikonisiertes Röhrchen ohne gerinnungshemmenden Zusatz für die Serumgewinnung gefüllt (3.2.1).

3.3.2 Gewinnung von Serum

Nach der Blutentnahme wurden die Röhrchen bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Retraktion des Blutkuchens gelagert. Anschließend wurde das Koagulum mit einer Pasteurpipette vom Rand gelöst und die Probe 10 min bei 2500 x g bei Raumtempertatur zentrifugiert. Das Serum wurde abpipettiert und für spätere Untersuchungen bei –80°C gelagert.

3.3.3 Gewinnung von gewaschenen Blutzellen

Hierfür wurde das EDTA-Blut verwendet, nachdem die Gesamtleukozytenzahl (3.3.4) bestimmt und ein Blutausstrich (3.3.5) gefertigt wurde. Das Blut wurde in einem Zentrifugenröhrchen (3.2.1) 1:5 mit PBS (3.2.2.3) verdünnt und bei Raumtemperatur für 10 min mit 400 x g ohne Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer weitlumigen Pipette entfernt und verworfen. Das erntfernte Volumen wurde wieder mit PBS aufgefüllt, die Probe resuspendiert und erneut unter den selben Bedingungen zentrifugiert. Danach wurde wieder der Überstand abgenommen und verworfen, wobei darauf geachtet wurde, daß genau das ursprüngliche Probenausgangsvolumen erreicht wurde. Danach wurde die Probe erneut resuspendiert.

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3.3.4 Bestimmung der Gesamtleukozytenzahl im Vollblut

10 µl des gut gemischten EDTA-Blutes wurden in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (3.2.1) pipettiert, in welchem schon 90 µl Türkschelösung (3.2.2) vorgelegt waren. Die Probe wurde auf einem Röhrchenschüttler (Vortexer) gut gemischt und anschließend 2 min stehen gelassen.

Danach wurde die Anzahl der Leukozyten mit Hilfe einer Bürker Zählkammer lichtmikroskopisch ermittelt.

3.3.5 Anfertigen von Blutausstrichen

Zur Differenzierung der Leukozyten wurden Blutausstriche angefertigt. Dazu wurde auf einem entfetteten und gesäuberten Objektträger ein Tropfen EDTA-Blut aufgetragen, mit einem zweiten Objektträger ausgestrichen und an der Luft getrocknet.

Die anschließende Färbung erfolgte als modifizierte Wright-Färbung mit Accustain® (3.2.2).

Dazu wurde der Objektträger für 60 Sekunden mit 1 ml Accustain® bedeckt. Danach wurde vorsichtig 1 ml Aqua dest. hinzugegeben und 1,5 min inkubiert. Anschließend wurde der Objektträger mit reichlich Aqua dest. gespült und an der Luft getrocknet. Die Ausstriche wurden zur späteren lichtmikroskopischen Auswertung mit Ölimmersion aufbewahrt.

3.3.6 Aufreinigung von Allergenpräparationen

Da die eingesetzten Allergenpräparationen störendes Histamin enthielten, wurden sie vor Gebrauch an Sephadex PD 10 Säulen (3.2.1) aufgereinigt.

Hierzu wurden handelsübliche Sephadex PD 10 Säulen in einem Ständer eingeklemmt. Unter die Säulen wurde ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gestellt. Als erstes wurde die Säule mit 25 ml Pipes B (3.2.2.3) gespült. Anschließend wurden 2,5 ml der Allergensuspension auf die Säule gegeben, und die Säule wurde unten, nach dem vollständigen Eindringen des Allergens in die Säule, verschlossen. Danach wurde das Auffanggefäß durch ein steriles Polystyrolauffanggefäß ersetzt, 3,5 ml Pipes B auf die Säule pipettiert und der Verschluß geöffnet. In dem aufgefangenen 3,5 ml Allergen-Pipes B-Gemisch lag das Allergen 1:1,4 verdünnt vor. Die gewonnene, aufgereinigte Allergenlösung wurde nun in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt und bis zur Verwendung in aliquoten Teilen bei –20°C gelagert.

(38)

3.3.7 Durchführung der Histamin-Freisetzung

Alle Histaminfreisetzungen aus basophilen Granulozyten erfolgten aus gewaschenem EDTA- Blut (3.3.3). Nach dem Waschen des Blutes, was im weiteren auch als Vorbehandlung bezeichnet wird, wurden folgende Freisetzungsbehandlungen durchgeführt.

3.3.7.1 Spontane Freisetzung von Histamin

Bei der spontanen Freisetzung, welche als Kontrolle dafür dient, wieviel Histamin die Zellen allein durch die mechanische Behandlung ohne Stimulanz freisetzen, wird den Zellen nur Freisetzungspuffer zugesetzt. Dieser ersetzt das zuvor durch das EDTA gebundene Calcium und Magnesium und schafft damit für die basophilen Granulozyten Reaktionsbedingungen, die es ihnen ermöglichen, Histamin freizusetzen.

250 µl des vorbehandelten Blutes wurden in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 250 µl Pipes B (3.2.2.3) vorsichtig gemischt und anschließend bei 37°C im Brutschrank für 60 min inkubiert.

Danach wurde die Freisetzungsreaktion gestoppt, indem die Probe für 20 min auf Eis verbracht wurde. Die gekühlten Proben wurden nun bei 700 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die spätere Verwendung im RIA bei –20°C eingefroren.

3.3.7.2 Physikalische Freisetzung von Histamin

Um die Menge des Histamins zu erfahren, welches in den Zellen enthalten ist, wurde diese durch Hitze zerstört. Hierzu wurden 200 µl gewaschene Blutzellsuspension mit 800 µl Pipes B (3.2.2.3) in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß gemischt. Nachdem in den Deckel des Gefäßes mit einer Kanüle ein Loch gebohrt wurde, wurde die Probe 10 min bei 100°C im Wasserbad gekocht. Die nachfolgende Zentrifugation wurde mit 8300 x g für 3 min durchgeführt. Der partikelfreie Überstand wurde abgenommen und für die Weiterverwendung im RIA bei –20°C eingefroren.

3.3.7.3 Antikörper induzierte Freisetzung von Histamin

Hierzu wurde der Antikörper Ziege anti Pferd IgG (H+L) verwendet. Den vorbehandelten Blutzellen wurde der Antikörper in Freisetzungspuffer zugeführt, um zu prüfen, ob dieser in

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der Lage ist, die basophilen Granulozyten durch Kreuzvernetzung der Immunglobuline auf der Zelloberfläche zu aktivieren und so Histamin freizusetzen.

Der ZaP Antikörper (3.2.3.2) wurde zunächst in Pipes B (3.2.2.3) so verdünnt, daß die Konzentrationen 120 und 40 µg/ml entstanden. Durch die 1:2 Verdünnung beim Einsatz wurden so Endkonzentrationen von 60 und 20 µg/ml erreicht.

250 µl vorbehandeltes Blut wurden mit 250 µl vorbereiteter Antikörperlösung in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorsichtig gemischt und danach für 60 min bei 37 °C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde mit den Proben analog den Proben der spontanen Freisetzung (3.3.7.1) weiterverfahren.

3.3.7.4 Allergen induzierte Freisetzung von Histamin

Bei der Allergen induzierten Freisetzung wurden den vorbehandelten Blutzellen vorverdünnte potentielle Allergene in Freisetzungspuffer zugeführt, um zu prüfen, ob diese in der Lage sind, die basophilen Granulozyten durch Kreuzvernetzung der Immunglobuline auf der Zelloberfläche zu aktivieren und so Histamin freizusetzen.

Auch hierfür wurden die Allergene doppelt konzentriert eingesetzt, um nach der folgenden 1:2 Verdünnung die gewünschten Konzentrationen zu bekommen.

Die Durchführung der Freisetzung wurde analog der antikörpervermittelten Freisetzung durchgeführt (3.2.3.2).

Als Allergene wurden eingesetzt:

Allergen: Konzentrationen im Reaktionsansatz:

Culicoides nubeculosus 15, 5, 0,5 und 0,05 µg/ml

(anfangs wurden statt 15 µg/ml 50 bzw. 25 µg/ml eingesetzt; Februar bis Mai)

Dermatophagoides farine 50 und 5 µg/ml

Ephemeroptera 50 und 5 µg/ml

Heterocera 50 und 5 µg/ml

Mosquito 50 und 5 µg/ml

Musca domestica 50 und 5 µg/ml Solenopsis invicta 50 und 5 µg/ml Stomoxys calcitrans 5 und 0,5 µg/ml

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3.3.8 Bestimmung von Histamin im RIA

Der Histamin Testkit der Firma DLD wurde in der von KAUL (1998) modifizierten Form eingesetzt. Diese modifizierte Form von KAUL ermöglicht einen funktionellen in vitro Test (FIT) zur Quantifizierung des aus basophilen Granulozyten freigesetzten Histamins im Blut von Pferden.

3.3.8.1 Prinzip

Bestimmung von Histamin im RIA (radioimmunoassay):

Der hier verwendete RIA ist ein kompetetiver Radioimmuntest zur Bestimmung von acyliertem Histamin. Die Acylierung des Histamins (zu N-Acyl-Histamin) ist notwendig für die Histaminerkennung durch Antikörper. Das verwendete Antiserum erkennt nur acyliertes Histamin. In einzelnen Röhrchen (Doppelansätze) wurden acylierte Proben bzw. Standards mit radioaktiv markiertem Histamin und einem Ziegen anti N-Acyl-Histamin Serum inkubiert.

Während der Inkubation konkurrieren das unmarkierte Histamin aus den Proben und das radioaktiv markierte Histamin des Tracers (Jod 125) um eine limitierende Anzahl von Antikörperbindungsstellen. Diese Reaktion unterliegt dem Massenwirkungsgesetz und führt zu einem dynamischen Gleichgewicht der Antikörperbindung am Histamin. Die entstandenen Histamin-Antikörperkomplexe werden anschließend mit gegen Ziegen IgG gerichteten Antikörpern (Esel anti Ziege) (3.2.3.1) in Anwesenheit von Polyethylenglykol (PEG) (3.2.2) gefällt. Der Überstand wurden entfernt und die Aktivität des Präzipitates in einem Gammacounter bestimmt. Aufgrund der Kompetition verhält sich die Menge an radioaktiv gebundenem Histamin im Präzipitat umgekehrt proportional zur Histaminkonzentration der Proben. Die unbekannten Histaminkonzentrationen der Proben wurden anhand einer Histamin-Standardkurve bestimmt.

Die freigesetzte Histaminmenge bei einer definierten Allergenkonzentration im Verhältnis zur physikalisch freigesetzten Histaminmenge entscheidet, ob ein Pferd für ein bestimmtes Allergen als sensibilisiert anzusehen ist (vgl. 3.3.8.3).