Untersuchungen zum Sommerekzem sowie zum Einfluss des Immunmodulators Baypamun N auf die Typ I-Allergie der Pferde

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Untersuchungen zum Sommerekzem sowie zum Einfluss

des Immunmodulators Baypamun N

^®

auf die Typ I-Allergie der Pferde

I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Tanja Geiben aus Lampertheim

Hannover 2003

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr., Dr. h. c. Wolfgang Leibold

1. Gutachter : Univ.-Prof. Dr., Dr. h. c. Wolfgang Leibold

2. Gutachter : Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung : 2. Juni 2003

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„ So wie die Schere und der Wasserkrug des Gärtners den Baum in die Höhe treiben,

so lassen die Schmerzen und Tränen vom vergangenen Jahr des Menschen Seele reifen“

Für meine Eltern,

die mich gelehrt haben, dass man (fast) alles erreichen kann, wenn man es nur wirklich will

&

Für Kalle,

der mir geholfen hat, mich daran zu erinnern

(4)

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2 LITERATURÜBERSICHT 15

2.1 ALLERGIE...15

2.1.1 IMMUNMECHANISMEN UND DEREN PATHOLOGISCHE AUSWIRKUNGEN IM RAHMEN DER ALLERGIE...15

2.1.2 DAS SOMMEREKZEM, EINE TYP I-ALLERGIE DES PFERDES...18

2.2 IMMUNGLOBULIN-ISOTYPEN DES PFERDES UND IHRE BEDEUTUNG FÜR DIE TYP I-ALLERGIE...21

2.3 IMMUNMODULATION...23

2.3.1 DEFINITIONEN UND EINSATZMÖGLICHKEITEN...23

2.3.2 IMMUNMODULATOREN IN DER PFERDEMEDIZIN...23

2.3.3 IMMUNMODULATION DER TYP I-ALLERGIE...24

2.3.3.1 Modulation der TH1 / TH2-Balance ...24

2.3.3.2 Modulation von Effektorzellen...25

2.3.4 DER IMMUNMODULATOR BAYPAMUN^®...27

3 PROBANDEN, GERÄTE, MATERIAL UND METHODEN 29 3.1 PROBANDEN...29

3.1.1 PROBANDEN IM UNTERSUCHUNGSJAHR 2000 ...29

3.1.2 ZUSÄTZLICHE PROBANDEN IM UNTERSUCHUNGSJAHR 2001 ...30

3.1.3 HALTUNGS- UND FÜTTERUNGSBEDINGUNGEN...31

3.1.4 EINGANGSUNTERSUCHUNGEN,KENNZEICHNUNG UND VERSUCHSUNABHÄNGIGE MEDIKATIONEN...31

3.2 GERÄTE...32

3.3 MATERIAL...33

3.3.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN...33

3.3.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN...33

3.3.3 ANTIKÖRPER UND SEREN...34

3.3.4 ALLERGENE...35

3.3.5 MEDIKAMENTE...36

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3.3.6 PUFFER,GEBRAUCHSLÖSUNGEN UND NACHWEISREAGENZIEN...37

3.3.6.1 Für die Medikation ...37

3.3.6.2 Für die Hämatologie ...37

3.3.6.3 Für den funktionellen in vitro-Test (FIT) ...37

3.3.6.4 Für den ELISA ...40

3.4 METHODEN...42

3.4.1 VERSUCHAUFBAU...42

3.4.2 MEDIKAMENTENAPPLIKATION...42

3.4.3 KLINISCHE BEURTEILUNG...45

3.4.4 BLUTENTNAHME...46

3.4.5 HÄMATOLOGIE...46

3.4.6 FUNKTIONELLER IN VITRO-TEST (FIT) ZUR BESTIMMUNG DES SENSIBILISIERUNGSGRADES BASOPHILER GRANULOZYTEN...47

3.4.6.1 Histamin-Freisetzung ...47

3.4.6.2 Radio-immuno-Assay (RIA) ...49

3.4.6.3 Messung und Auswertung ...50

3.4.7 GEWINNUNG VON SERUM...50

3.4.8 ELISA...51

3.4.8.1 ELISA zur qualitativen Bestimmung des Baypamun N^® spezifischen Gesamtimmunglobulins...51

3.4.8.2 Elisa zur semiquantitativen Bestimmung der Baypamun N^® spezifischen equinen Immunglobulinisotypen IgG1, IgG3 und IgG4 ...53

3.4.8.3 Berechnung von Elisa-Einheiten (Referenz-Standard-Methode) ...54

3.4.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG...55

4 ERGEBNISSE 56 4.1 ZUR KLINISCHEN AUSPRÄGUNG DES SOMMEREKZEMS...56

4.1.1 ALLGEMEINE UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE...57

4.1.1.1 Typ der Hautveränderungen und deren Lokalisation ...57

4.1.1.2 Klinische Ausprägung im Jahresverlauf...65

4.1.2 EINFLUSS VON BAYPAMUN N® AUF DIE KLINISCHE AUSPRÄGUNG...70

4.2 ZU DEN HÄMATOLOGISCHEN PARAMETERN...72

4.2.1.1 Anzahl der Leukozyten...72

4.2.1.2 Erythrozytäre Parameter ...74

4.2.1.3 Anzahl der Thrombozyten...76

4.2.2 EINFLUSS VON BAYPAMUN N® AUF DIE HÄMATOLOGISCHEN PARAMETER...76

(7)

DER BASOPHILEN GRANULOZYTEN...77

4.3.1.1 Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus ...77

4.3.1.2 Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus im Jahresverlauf ...78

4.3.1.3 Sensibilisierung gegen andere ausgewählte Allergene...82

4.3.1.4 Untersuchung zur Korrelation zwischen Stärke der klinischen Ausprägung und Sensibilisierungsgrad...85

4.3.1.5 maximal freisetzbare Histaminmenge ...87

4.3.2 EINFLUSS VON BAYPAMUN N® AUF DIE SENSIBILISIERUNG UND DEN HISTAMINGEHALT BASOPHILER GRANULOZYTEN...88

4.4 UNTERSUCHUNG DER ANTIKÖRPERBILDUNG GEGEN BAYPAMUN N^®...94

4.4.1 BESTIMMUNG VON BAYPAMUN N^® SPEZIFISCHEM GESAMTIMMUNGLOBULIN IM SERUM VON PFERDEN...94

4.4.1.1 Methodenentwicklung ...95

4.4.1.2 Ergebnisse der Bestimmung von Baypamun N^® spezifischem Gesamtimmunglobulin ...101

4.4.2 BESTIMMUNG BAYPAMUN N^® SPEZIFISCHER EQUINER IMMUNGLOBULINISOTYPEN103 4.4.2.1 Methodenentwicklung ...104

4.4.2.2 Ergebnisse der Bestimmung der Baypamun N^® spezifischen Isotypen IgG1, IgG3 und IgG4...110

5 DISKUSSION 121 5.1 KLINISCHE UND IMMUNOLOGISCHE PARAMETER VON PFERDEN MIT SOMMEREKZEM IM VERGLEICH ZU GESUNDEN KONTROLLTIEREN. ...121

5.2 EINFLUSS DES IMMUNMODULATORS BAYPAMUN N® AUF KLINISCHE UND IMMUNOLOGISCHE PARAMETER...124

5.3 BAYPAMUN N® ALS ANTIGEN – DIE EQUINE ANTIKÖRPERANTWORT AUF EINE CHRONISCHE ANTIGENEXPOSITION...125

6 ZUSAMMENFASSUNG 128

7 SUMMARY 131

8 LITERATURVERZEICHNIS 134

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Glossar und Verzeichnis der Abkürzungen

+ Standardabweichung

α anti- (gerichtet gegen)

Abb. Abbildung

ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität

Ak Antikörper

Aliquots aliquote Teile, gleiche Anteile einer Probe a. med. ante medicationem (vor Medikation) Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)

B0 histaminfreie Probe im RIA; da es sich bei dem verwendeten System um einen kompetitiven RIA handelt, wird hier durch den spezifischen Antikörper die maximal erfassbare Menge an ¹²⁵J-markiertem Histamin bestimmt, ohne dass ein Probenhistamin konkurriert; dient als Bezugs- größe (100%) für die Probenwerte, in denen ggf. das zu bestimmende konkurrierende Histamin enthalten ist

BCG Bacillus Calmette-Guerin

BPNN Baypamun N^

Bq Becquerel, SI-Einheit für die Aktivität einer radioaktiven Substanz, 1 Bq = 1 Zerfall pro Sekunde ; alte Einheit Curie, 1 Ci = 3,7 x 10¹⁰Bq BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise ca. cirka

°C Grad Celsius

cm Zentimeter

Cn Culicoides nubeculosus

Coating Beschichtung, hier Beschichtung der Plastikoberfläche der Mikrotiterplatte, i.d.R. erster Schritt im ELISA

COB chronische obstruktive Bronchitis

cpm counts per minute (Zählimpulse pro Minute) Cup Reaktionsgefäß

D Dalton (1,66018 x 10^-24g)

dl Deziliter (100 ml)

DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure

Dualmodus Messung der Extinktion von Flüssigkeiten im Photometer (ELISA) bei zwei Wellenlängen (Testfilter und Referenzfilter). Ermöglicht die Elimination von Messfehlern durch Schmutz, Kratzer oder Feuchtigkeit auf der Mikrotiterplatte.

EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat

“Ekzemer” an Sommerekzem erkrankte Pferde (auch außerhalb der klinisch manifesten Periode)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Enzym-gekoppelter Immunadsorbtionstest)

(9)

ESA equines Serumalbumin

Fa. Firma

Fc fragment crystallizable; durch Disulfidbrücken verbundene C-terminale Domänen (C2+C3 bzw. C2 - C4) der konstanten Immunglobulinkette, ein Teilbereich dieses Ig-Fragmentes kann an Fc-Zellrezeptoren binden.

Fcε RI Fcε-Rezeptor I (hochaffiner Fcε-Rezeptor) FIT funktioneller in vitro-Test für Typ I-Allergien

FITCn funktioneller in vitro-Test auf Culicoides nubeculosus fl femtoliter (1 x 10^-15 l)

g Gramm

GαH goat anti horse (Ziege anti Pferd)

G-CSF Granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-koloniestimulierender Faktor)

GM-CSF Granulocyte monocyte colony stimulating factor (Granulozyten- Monozyten-koloniestimulierender Faktor)

ggf. gegebenenfalls ggr. geringgradig

GKID Gewebekultur infektiöse Dosis h hora (Stunde)

ha Hektar (10.000 m²)

HGB Hämoglobin

hgr. hochgradig

HKT Hämatokrit

H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulinketten

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IgE Immunglobulin E

IgG Immunglobulin G IL Interleukin

iPPOV inaktiviertes Parapox ovis-Virus i.d.R. in der Regel

Kat# Katalognummer kb Kilobasen (10³ Basen) kDa Kilodalton (10³ Dalton)

kg Kilogramm

l Liter

log dekadischer Logarithmus µ mikro (x 10^-6)

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

m milli (x 10^-3)

M mol/l

mAk monoklonaler Antikörper

MCH mean cell hemoglobin (mittlerer Hämoglobingehalt der Erythrozyten) MCHC mean cell hemoglobin concentration (mittlere Hämoglobin-

Konzentration der Erythrozyten)

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MCV mean cell volume (mittleres Erythrozytenvolumen)

mg Milligramm

mgr. mittelgradig

MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

mmol Millimol

mOD milli optische Dichte, Einheit für im ELISA-Photometer gemessene Extinktionen

MW Mittelwert

n Stichprobenumfang NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin

„Nicht-Ekzemer“ nicht an Sommerekzem erkrankte Pferde NK-Zellen natürliche Killerzellen

nm Nanometer (1x10^-9m)

Nr. Nummer

NSB nicht spezifische Bindung; messbare Radioaktivität im RIA, die nicht durch spezifische Bindung an Antiserum zustande kommt

pg picogramm (1x10^-12g)

PBMC peripheral blood mononuclear cells (mononukleäre Zellen im peripheren Blut)

PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PEG Polyethylenglykol

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration Pipes Piperazine-N,N´-bis[2-ethanesulfonic]acid (Piperazin-N,N’-bis[2-

ethansulfonsäure)

PLT platelet (Thrombozyten)

p. med. post medicationem (nach Medikation) RBC red blood cells (Erythrozyten)

Release Freisetzung, hier Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten RIA radioimmunoassay (Radioimmuntest)

rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur

s. siehe

score Maßzahl, Bewertungsziffer

SE Sommerekzem

sek. Sekunden

spp. species (Arten)

Tab. Tabelle

TH-Zelle T-Helferzellen

TH1-Zelle, TH2-Zelle Subpopulationen von T-Helfer-Zellen TMB Tetramethylbenzidin

TNF Tumornekrosefaktor

Tris Trishydroxymethylaminomethan

TSH Thyreotropin

U Unit (Einheit)

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u.U. unter Umständen

WBC white blood cells (Leukozyten)

well Mikrotiterplattenvertiefung einer ELISA-Platte

v.a. vor allem

vergl. vergleiche

x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/sek²) z. B. zum Beispiel

z. Zt zur Zeit

(12)

(13)

1 Einleitung und Zielsetzung

Von den unterschiedlichen Allergieformen beim Menschen und bei Haustieren ist die Typ I- Allergie die häufigste und wegen des starken Juckreizes die quälendste. Obwohl mehrere für die Ausprägung von Allergien verantwortliche Pathomechanismen bekannt sind, reicht der gegenwärtige Kenntnisstand nicht aus, um

- die entscheidenden Regulationsparameter zu verstehen, weshalb ein Antigen von den meisten Individuen mit einer „schützenden“ Immunreaktion beantwortet wird und warum einige andere Individuen das gleiche Antigen mit überschießenden Immun- reaktionen als „Allergen“ behandeln.

- mehr als nur eine symptomatische Therapie bei Allergikern durchzuführen, wenn sich eine Allergenkarenz nicht erreichen lässt.

- durch gezielte Immunmodulation Allergien wirkungsvoll und zuverlässig zu mildern, zu heilen oder zu verhindern.

Dass Typ I-Allergien schneller zunehmen, als wirkungsvolle Gegenmaßnahmen entwickelt werden können, liegt auch wesentlich daran, dass keine guten Modelle für diese zur Ver- fügung stehen. Als ein solches kann aber das Sommerekzem der Pferde dienen, denn durch ihre Äthiologie und charakteristischen klinischen Symptome erhält diese Erkrankung eine herausragende Stellung als repräsentatives Modell für Typ I-Allergien bei Mensch und Tier.

Das Sommerekzem ist als Dermatitis beim Pferd schon seit Mitte des 19. Jahrhunderts bekannt und inzwischen weltweit geläufig. Anhand der klinischen, histopathologischen und immunologischen Anzeichen und Befunde gilt es heute als gesichert, dass es sich hierbei um eine alleinige oder dominierende Typ I-Allergie handelt. Die hauptsächlich von Gnitzen stammenden Allergene gelangen durch die Stiche der blutsaugenden Weibchen in die Haut der Pferde. Die Allergiker entwickeln daraufhin, ausgelöst durch den starken Juckreiz, die für diese Erkrankung typische Symptomatik.

Da es zurzeit keine kausale Therapie für Typ I-Allergien gibt, beschränken sich Behandlungs- versuche bisher auf Allergenkarenz und palliative Maßnahmen. Praxisbeobachtungen berichten allerdings von einer positiven Beeinflussung der Sommerekzemsymptomatik durch den Immunmodulator Baypamun N^®.

Durch die vorliegende Untersuchung sollen zum einen, anhand klinischer und immuno- logischer Parameter, weitere Einblicke über Verlauf und Mechanismen dieser Allergie erworben werden. Zum zweiten soll im Rahmen einer Doppelblindstudie untersucht werden, inwiefern der Immunmodulator Baypamun N^® in der Lage ist, Symptomatik und Mechanismen der Typ I-Allergie zu beeinflussen.

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Daraus ergeben sich für diese Arbeit folgende konkreten Fragestellungen:

I. Welcher natürlichen Variation unterliegen klinische Parameter im Jahresverlauf?

Hierfür wird über einen Zeitraum von zwei Jahren eine Herde von Sommerekzemern und nicht allergischen Kontrolltieren unter gleichen Haltungs- und Fütterungsbedingungen beobachtet. Dies beinhaltet zum einen die regelmäßige Kontrolle der klinischen Aus- prägung der Hautsymptomatik. Zusätzlich erfolgt eine regelmäßige Messung leukozytärer, erythrozytärer und thrombozytärer Blutparameter aller Tiere.

II. Welcher natürlichen Variation unterliegen der Histamingehalt und die allergenspezifische Reaktionsbereitschaft basophiler Granulozyten im Jahresverlauf?

Bestehen Zusammenhänge zwischen dem Histamingehalt, bzw. der allergenspezifischen Reaktionsbereitschaft einerseits und der klinischen Ausprägung des Sommerekzems andererseits?

Dazu werden von den unter 1. beschriebenen Pferden in regelmäßigen Abständen Blut- proben anhand des von KAUL (1998) entwickelten funktionellen in vitro-Tests (FIT) untersucht. Die gewonnenen Ergebnisse werden im Weiteren mit der klinischen Aus- prägung des Ekzems verglichen.

III. Können, diese natürlichen Variationen berücksichtigend, die klinischen und immuno- logischen Parameter durch den Immunmodulator Baypamun N^® beeinflusst werden?

Zu diesem Zweck werden die unter 1. genannten Tiere mit unterschiedlichen Dosierungen von Baypamun N^® bzw. mit Placebo behandelt. Dies erfolgt im ersten Untersuchungsjahr in einem therapeutischen Ansatz bei bereits vollständig ausgeprägten klinischen

Symptomen des Sommerekzems, im zweiten Jahr wird die Medikation bereits prophylak- tisch vor Ausbruch des Ekzems begonnen. Im Folgenden werden die Behandlungsgruppen hinsichtlich der klinischen und immunologischen Parameter verglichen.

IV. Wie reagieren Pferde auf die Medikation, d.h. auf die chronische Konfrontation mit einem zunächst unbekannten Antigen?

Für diese Untersuchungen werden von den oben genannten Pferden (s.1.) in regelmäßigen Abständen Serumproben gewonnen und anschließend mit Hilfe von für diese Studie entwickelten ELISA-Systemen auf die Anwesenheit von Baypamun N^® -spezifischen Anti- körpern getestet. Zudem soll das Verhalten der an der Immunantwort beteiligten Immun- globulin-Isotypen im zeitlichen Verlauf der Antigenbelastung untersucht werden.

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2 Literaturübersicht

2.1 Allergie

2.1.1 Immunmechanismen und deren pathologische Auswirkungen im Rahmen der Allergie

Allergien sind Hypersensibilitäts- oder Überempfindlichkeitsreaktionen. Dies bedeutet, dass Immunmechanismen sich, entgegen ihrer eigentlichen Bestimmung, inadäquat, oft in überschießendem Maße gegen – meist exogene - Antigene richten und so zur Erkrankung des Individuums führen. Die vom Immunsystem mit einer solchen überschießenden Reaktion beantworteten Antigene werden als „Allergene“ bezeichnet.

GELL und COOMBS (1968) teilten die Allergien in vier Typen ein und unterschieden dabei grob Antikörper vermittelte Immunreaktionen (Typen I bis III) von antikörperunabhängigen, Zell vermittelten (Typ IV). Diese Formen von Immunmechanismen haben primär wichtige physiologische Bedeutungen. Aus weitgehend noch unbekannten Gründen können diese lebens- und funktionserhaltenden Mechanismen „überschießend“ ausgeführt und so zu Pathomechanismen werden.

Die Immunmechanismen vom Typ I basieren auf dem folgenden Schema: Auf den Primär- kontakt eines Individuums mit dem Antigen hin können B-Zellen, unter Einfluss von TH2- Zellen (s. auch 2.3.3.1) spezifisches IgE bilden. IgE wird, im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen, schon in unkomplexierter Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (FcεR I) auf der Oberfläche von v.a. Mastzellen und basophilen Granulozyten gebunden.

Freies Serum-IgE jedoch hat eine Halbwertszeit von nur etwa zwei bis zweieinhalb Tagen.

Ungebunden liegt IgE deshalb im Vergleich zu anderen Immunglobulin-Isotypen in nur sehr geringen Konzentrationen im Serum vor. Kommt es im weiteren zu einem erneuten Kontakt des Individuums mit dem selben Antigen, so führt dessen Bindung an die spezifischen zellständigen IgE-Moleküle zu einer Kreuzvernetzung dieser Immunglobuline, sofern sie auf der Zelloberfläche in ausreichender Dichte vorhanden sind. Die so herbeigeführte Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren aktiviert die Zelle, die zum einen innerhalb von Sekunden mit Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren (u.a. Histamin, Proteoglykane, Proteasen) aus zytoplasmatischen Granula reagiert (Sofortreaktion). Zudem werden Arachidonsäuremetaboliten, wie bestimmte Leukotriene (Lipoxygenasemetaboliten;

v.a. LTC4, LTD4, LTE4) und Prostaglandine (Cyclooxygenasemetaboliten; v.a. PGD2), die man früher auf Grund ihrer Fähigkeit allergoide Reaktionen auszulösen als „slow reacting substances of anaphylaxis“ (SRS) bezeichnete, aber auch Zytokine (u.a. IL4, TNFα) neu synthetisiert und ausgeschüttet. Diese erhalten die Entzündungsreaktion über Stunden aufrecht (Spätreaktion). Eine Aktivierung der Zellen zur Mediatorfreisetzung ist allerdings nicht alleine auf eine IgE-Vermittlung beschränkt. Auch andere Substanzen sind über spezifische Rezeptoren, z.B. IgG über Fcγ-RII und III, in der Lage, eine Degranulation sowie die Neusynthese der Mediatoren auszulösen.

Seine physiologische Bedeutung hat dieser Mechanismus v.a. im Zuge der Immunantwort auf parasitärer Infektionen (Helminthen), ist aber auch bei der Abwehr anderer Pathogene, inklusive bakterieller, beteiligt.

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Kommt es zur Ausprägung pathologischer Hypersensibilitätsreaktionen unter diesem Mechanismus können diese lokal beschränkt, aber auch systemisch ablaufen. Beispiele für Typ I Allergien des Menschen sind die allergische Rhinitis (Heuschnupfen), das Asthma, aber auch die systemische Anaphylaxie bis hin zum allergischen Schock.

Bei Typ II Mechanismen dagegen handelt es sich um durch Antikörper vom IgG- und IgM- Isotyp vermittelte Immunmechanismen. Auf der Oberfläche partikulärer Antigene gebundenes IgG (Antigen-Antikörper-Komplex) kann Phagozyten über deren Fcγ-Rezeptoren dazu aktivieren diese „opsonisierten“ Antigene per Phagozytose zu eliminieren. Auf Zelloberflächen gebundenes IgG kann von NK-Zellen, die den FcγRIII exprimieren, erkannt werden, woraufhin diese die antikörpermarkierten Zielzellen zytotoxisch zerstören (antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC)). Ein dritter IgG-vermittelter Mechanismus ist die Aktivierung des klassischen Weges der Komplementkaskade über die Bindung von antigengebundenem IgG, und effektiver noch IgM, an C1q, einem von drei Proteinen im C1-Komplex. Die Aktivierung von C1q durch IgG erfordert jedoch eine ausreichend hohe Epitop- und Immunglobulindichte auf dem Pathogen, da dieser Komplementfaktor hierzu an mindestens zwei aktivierten Fc-Teilen komplementbindender Immunglobulinmoleküle binden muss.

Im Rahmen dieser Allergie sind die Antikörper gegen zellassoziierte Antigene gerichtet und lösen entweder über Phagozyten und NK-Zellen oder über das Komplementsystem die charakteristischen Effektormechanismen aus. Ein Beispiel aus der Humanmedizin hierfür sind die Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Penicillin, Methyldopa oder Chinidin. Diese Medikamente binden auf der Zelloberfläche von Erythrozyten oder Thrombozyten. Existieren spezifische Antikörper, die diese Medikamente erkennen, binden diese und lösen eine Komplementaktivierung aus, die zur Entfernung der betroffenen Blutzellen und somit zur immunhämolytischen Anämie bzw. Thrombozytopenie führt.

Antikörper können ebenso gegen körpereigene Zell- oder Matrixantigene gebildet werden und sind unter dem Typ II-Mechanismus so die Ursache für Autoimmunerkrankungen, wie die autoimmune hämolytische Anämie, thrombozytopenische Purpura, Goodpasture-Syndrom, oder Pemphigus vulgaris.

Auch bei Immunmechanismen vom Typ III sind Antikörper beteiligt. Im Gegensatz zu Typ II-Mechanismen sind die Antikörper jedoch gegen lösliche Antigene gerichtet, mit denen sie primär lösliche Immunkomplexe bilden.

Die im Verlauf der physiologischen Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexe aktivieren – so komplementbindende Isotypen beteiligt sind - das Komplementsystem (klassischer Weg), werden mit dessen Hilfe über den Komplementfaktor C3b an Erythrozyten angelagert und zur Milz und Leber transportiert, wo sie von Makrophagen phagozytiert werden; die Erythrozyten werden dabei i.d.R. nicht beschädigt.

Bei der Typ III-Allergie entstehen durch Antigenüberschuss relativ kleine Aggregate von Antigen-Antikörper-Komplexen. Durch diese wird das Komplementsystem schlechter aktiviert (mangels komplementbindender Antikörperisotypen) und deshalb werden die Immunkomplexe schlechter oder gar nicht an Erythrozyten gebunden, da diese zwar den Komplementrezeptor CR1, jedoch keine Fc-Rezeptoren haben. Dies führt zu einem verminderten Abbau kleiner Immunkomplexe. Diese freien Komplexe neigen dazu, sich an den Basalmembranen kleiner Gefäße abzulagern. Mastzellen können solche Komplexe binden (über Fcγ-RIII) und dadurch aktiviert werden. Die TNFα-Freisetztung durch so aktivierte Mastzellen gilt als Hauptursache für die folgenden Entzündungsreaktionen (WATANABE et

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gelockt werden (s. auch 2.2.3.2) . Über eine Verknüpfung von Fc-Rezeptoren und Komple- mentrezeptoren auf Leukozyten werden diese aktiviert und lösen im Folgenden eine Schädigung des umliegenden Gewebes aus.

Ein klassisches Beispiel für die Typ III-Allergie ist die so genannte „Serumkrankheit“, die heute noch bei der Anti-Venin-Behandlung eine Rolle spielt. Serum von Pferden, die zuvor mit Schlangengift immunisiert wurden, dient dabei als Quelle für neutralisierende Antikörper bei der Behandlung von Schlangenbissen beim Menschen. Injizierte Bestandteile, insbesondere die Antikörper, aus dem Pferdeserum lösen jedoch auch eine Antikörperreaktion aus, die bei wiederholter Applikation eines solchen Serums zur Komplexbildung damit und mit den zirkulierenden Antigenen führt. Diese massive Bildung von Immunkomplexen führt zu deren Ablagerung in Gefäßen, Nieren und Gelenken und somit zu Vasculitis, Nephritis und Arthritis.

Auch Autoimmunerkrankungen können nach diesem Mechanismus ablaufen, z.B. bei der gemischten essentiellen Kryoglobulinämie (Antikörper gegen körpereigene Immunglobuline) oder dem systemischen Lupus erythematodes (Antikörper gegen u.a. körpereigene Zellkernbestandteile (DNS, Nukleoproteine)).

Letztlich besteht noch die Möglichkeit, dass Antikörper, ohne Beteiligung von Fc- vermittelten Sekundärreaktionen allein durch ihre spezifische Bindung zur Erkrankung führen (Typ V-Reaktionen). Unter physiologischen Umständen erfüllen Antikörper neben ihrer vermittelnden Rolle im Rahmen der Opsonisierung und Komplementaktivierung auch ohne Beteiligung weiterer Faktoren, bestimmte Funktionen. So sind sie wichtig zur Neutralisation z.B. von Toxinen, oder beeinflussen über ihre Bindung an zellständige Rezeptoren z.B. die Produktion von weiteren Antikörpern.

Untersuchungen haben gezeigt, dass Antikörper im Rahmen von Infektionen entstehen können, die mit körpereigenen Strukturen, z.B. Rezeptoren kreuzreagieren und diese z.B.

stimulieren (TSH-Rezeptoren bei Basedow-Krankheit) oder blockieren (Acetylcholin- rezeptoren bei Myasthenia gravis).

Auch in der Zell vermittelten Immunantwort kann es, ohne Beteiligung von Immun- globulinen, zu Störungen im Sinne von Allergie oder Autoaggression kommen.

Wird ein Antigen von den antigenpräsentierenden Zellen hierbei über MHC-Klasse II an der Zelloberfläche gezeigt, werden dadurch CD-4-T-Zellen (T-Helferzellen) angesprochen.

Pathogen- und milieuabhängig können sich die CD-4-Zellen daraufhin in zwei Richtungen, TH1 oder TH2, differenzieren und im Weiteren anhand der Sekretion charakteristischer Zytokine und Chemokine z.B. Makrophagen aktivieren und B-Zellen zur IgG-Produktion anregen (TH1) oder z.B. durch Einfluss auf die Differenzierung antigenaktivierter B-Zellen eine v.a. antikörpervermittelte Immunantwort auslösen (TH2) (s. auch 2.3.3.1).

Im Verlauf von Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV erfolgt die Differenzierung der T-Helferzellen zu TH1-Zellen, bei Typ I-Allergien zu TH2 (s. dort). Altbekanntes Beispiel einer T-Zell vermittelten Allergie ist die Tuberkulinreaktion, aber auch Kontaktallergien, z.B.

auf Pentadecacatechol, einer Substanz aus den Blättern des Gift-Sumach oder Metallionen, wie Nickel und Chrom fallen unter diese Kategorie. Eine Autoimmunerkrankung, die diesem Mechanismus folgt ist z.B. die gegen das basische Myelinprotein (MBP) gerichtete autoaggressive Reaktion, die zur multiplen Sklerose führt.

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Wird ein Antigen über MHC-Klasse I präsentiert, reagieren darauf CD-8-Zellen und differenzieren unter dem regulierenden Einfluss von T-Helferzellen zu zytotoxischen T-Zellen aus.

Diese töten zum einen diese antigenpräsentierenden Zellen ab, können aber auch Zytokine sezernieren, die u.a. Makrophagen anlocken und aktivieren (IFNγ, TNFα, TNFβ).

Lipidlösliche Allergene, wie Pentadecacatechol können über diesen Weg eine Gewebs- schädigung verursachen, da sie die Zellmembran durchqueren können und Proteine im Zellinneren verändern. Als Peptide gelangen diese dann über das endoplasmatische Reticulum und MHC-Klasse I-Moleküle an die Zelloberfläche, wo sie von CD-8-Zellen erkannt werden.

(JANEWAY und TRAVERS, 1997)

Diese hier beschriebene Klassifikation der Immunmechanismen (Typ I-V) wurde in die Veterinärmedizin übernommen, obwohl sie sich größtenteils auf Untersuchungen im humanen und murinen System stützt. In wie weit sich die zugrunde liegenden Immunmechanismen auf andere Spezies, insbesondere auf das Pferd, in allen Einzelaspekten transponieren lassen, ist heute in weiten Teilen noch ungeklärt.

2.1.2 Das Sommerekzem, eine Typ I-Allergie des Pferdes

Das Sommerekzem ist keineswegs eine „neue“ Erkrankung, vielmehr beschrieben schon französische Berichte 1840 diese saisonal auftretende Dermatitis (Lecoq 1842/43, Ref. in:

UNKEL, 1985). Zu dieser Zeit war das Sommerekzem in Indien ebenfalls bereits bekannt (DATTA, 1939, Ref. in: UNKEL, 1985). Mittlerweile ist das Sommerekzem weltweit geläufig, wenn auch mit den verschiedensten Bezeichnungen versehen (sweet itch, queensland itch, ardeurs, dermite estivale recidivante, Kasen). Dabei wird von erkrankten Pferden der verschiedensten Rassen berichtet. Araber scheinen ebenso betroffen zu sein, wie z.B. Quarter Horse, englische Vollblüter, deutsches Kaltblut, Haflinger oder Islandpferde.

Sogar bei Eseln und Maultieren wird das Sommerekzem beschrieben. Eine eindeutige Rassendisposition besteht dabei nicht. Islandpferde stellen jedoch in Deutschland eine der stärker betroffenen Rassen dar. Die Erkrankungshäufigkeit dieser Rasse wird in verschiedenen Untersuchungen zwischen 15% und 20%, für aus Island exportiere Tiere auf fast 25% geschätzt (UNKEL, 1985). Andere berichten von bis zu 60-70% Erkrankungsrate exportierter Tiere (RÜSBÜLDT, 2001 sowie persönliche Mitteilungen isländischer Pferdezüchter). Dies erklärt die enorme wirtschaftliche Bedeutung des Sommerekzems speziell für die isländische Landwirtschaft, deren Exportquoten seit Mitte der achtziger Jahre, nach Bekannt werden dieser Zusammenhänge, dramatisch sanken. (UNKEL, 1985, Heck, 1991)

Durch eine Studie an Islandpferden im Rheinland konnte gezeigt werden, dass das Sommer- ekzem multifaktoriell vererbt wird. Dabei wird allerdings eine Heritabilität von nur etwa 10%

angenommen, wobei der Einfluss der Stute hier unerklärlicherweise größer zu sein scheint, als der des Hengstes. Eine Disposition bezüglich Fellfarbe oder Geschlecht, wie von anderen Autoren vormals postuliert, konnte hier nicht nachgewiesen werden (UNKEL, 1985).

Dass es sich beim Sommerekzem um eine allergische Reaktion auf Stiche bestimmter blut- saugender Insekten handelt, wurde schon 1954 von RIECK aufgrund von Untersuchungen in Australien geschlossen. Heute gilt es als gesichert, dass insbesondere Culicoides spp.

(Gnitzen) weltweit als die bevorzugten Auslöser anzusehen sind. Aber auch anderen Insektenarten wird eine gewisse Bedeutung zugewiesen, z.B. Stomoxis calcitrans, Simuliden

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Applikation von Extrakten aus Culicoides, Stomoxis calcitrans bzw. Tabanidae alle sieben untersuchten Pferde bei Culicoides und drei der Tiere ebenfalls bei Stomoxis calcitrans mit einem subepidermalen Ödem und begrenzter Eosinophilie reagieren, ähnlich dem histopathologischen Bild des Sommerekzems. Der Versuch, die für das Sommerekzem verantwortlichen Allergene von Culicoides genauer zu identifizieren, indem aufgetrennte Fraktionen für intradermale Hauttests eingesetzt wurden, gelang nicht (MORROW et al., 1986). QUINN et al. (1983) konnten die Reaktionsbereitschaft der Haut auf Culicoides Extrakte über das Serum erkrankter Tiere auf gesunde Pferde übertragen. Dies bestärkte den Verdacht, dass es sich beim Sommerekzem um eine Typ I Allergie handelt. Dies folgerten auch STROTHMANN-LÜERSSEN et al. (1992), die, in Übereinstimmung zur Flohbissallergie des Hundes und der saisonalen allergischen Dermatitis des Schafes, bei histologischen und biochemischen Untersuchungen von an Sommerekzem erkrankten Pferden sowohl eine Infiltration von eosinophilen Granulozyten, als auch einen Anstieg von entzündungs- und allergiespezifischen Leukotrienen in den veränderten Hautbereichen fanden. Die Ansammlung eosinophiler und neutrophiler Granulozyten und die Ödembildung nach intradermaler Applikation von Culicoides Extrakt kann zudem durch die Histamin-1- Rezeptor Antagonisten Chlorphenamin und Mepyramin gehemmt werden (FOSTER et al., 1997).

Anhand des von ihr entwickelten funktionellen in-vitro Testes gelang es KAUL (1998), eine spezifische Histaminausschüttung basophiler Granulozyten auf eine Stimulation mit Culicoides nubeculosus in Blutproben vorberichtlich Sommerekzem-positiver Pferde nachweisen, während Blutproben von Pferden ohne Sommerekzem nicht reagierten. Diese Ergebnisse konnten von KOBELT (2001) bestätigt werden. KOBELT wies zudem nach, dass die spezifische Sensibilisierung basophiler Granulozyten gegen Culicoides auch im Winter, außerhalb der klinischen Periode, erhalten bleibt.

Untersuchungen von WILSON et al. (2001) zeigten, dass Pferde, die Culicoides-Bissen aus- gesetzt waren, im Gegensatz zu naiven Pferden (in Island; aufgrund der klimatischen Bedingungen kommen Culicoides dort nicht vor) Antikörper gegen Speicheldrüsenbestand- teile gebildet hatten. Dabei konnte bei allen exponierten Pferden Immunglobuline vom Isotyp IgG nachgewiesen werden, IgE jedoch nur bei Pferden mit klinischen Symptomen des Sommerekzems.

Zur klinischen Ausprägung des Ekzems kommt es nach UNKEL (1985) bei über 80% der untersuchten Islandpferde innerhalb der ersten drei Lebensjahre, 94% der späteren Sommer- ekzemer entwickeln bis zur Vollendung ihres vierten Lebensjahres erstmals Symptome.

Fohlen allerdings zeigen nahezu nie Anzeichen der Erkrankung, obwohl z.T. schon bei Fohlen und Jährlingen eine Sensibilisierung basophiler Granulozyten nachgewiesen werden konnte (KOBELT, 2001). Bei isländischen Importpferden kommt es nach Untersuchungen aus Norwegen frühestens im zweiten Sommer nach Import, im Durchschnitt nach etwa vier Jahren, zu ersten klinischen Ausprägungen (HALLDORSDOTTIR & LARSEN, 1991).

Im Laufe der Erkrankung werden fünf Stadien unterschieden: Das Prodromalstadium wird gefolgt vom papulösen Stadium, gekennzeichnet durch stecknadelkopf- bis maximal drei Zentimeter im Durchmesser große Papeln, die einen lokalen Juckreiz auslösen, auf den die Pferde mit Unruhe und mehr oder weniger starkem Scheuern reagieren. Das Langhaar von Mähne und Schweif wird dabei bis zur Alopezie abgescheuert. Folgend kommt es im Exkoriationsstadium zuerst zu oberflächlichen Hautabschürfungen und in folge weiterer

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Automutilation später zu tieferen, Cutis durchtrennenden Verletzungen. Es kann sich das sekundär infizierte oder ulcerierende Stadium anschließen. Letztendlich, mit Nachlassen der Allergenexposition, erfolgt im Regenerationsstadium eine Abheilung der Hautveränderungen.

Aufgrund des chronischen Verlaufs wird durch die permanente Reizung die Epidermis und Dermis jedoch stark zerstört. Es kommt, v.a. am Mähnenkamm und der Schweifrübe zur Pachydermie und andauernder Alopezie. Die vorgeschädigte Haut neigt auch außerhalb der Sommerekzemperiode, insbesondere in den luftabgeschlossenen Falten der pachydermen Bereiche, zu bakteriellen und mykotischen Infektionen. (RÜSBÜLDT, 2001).

Der jahreszeitliche Verlauf der Symptomausprägung ist dabei indirekt an die herrschenden Klima-, bzw. Wetterbedingungen gekoppelt, da diese das Insektenaufkommen maßgeblich steuern. Mit dem Auftreten der ersten Erkrankungsstadien muss im Allgemeinen ab April / Mai gerechnet werden. In der Zeit um Oktober und November klingen die Symptome ab und die Regeneration erfolgt. (HECK, 1991)

Der Grad der klinischen Ausprägung des Sommerekzems ist starken inter- und intraindividuellen Schwankungen unterworfen. Neben der Standort- und witterungs- abhängigen Insektenbelastung sollen Faktoren, wie verzögerter Haarwechsel, Vorschädigung der Haut (Borken, Schuppen aus der vorhergehenden Saison, Pyodermien, Dermatomykosen, parasitäre Infektionen), hormonelle Imbalancen und sogar die psychische Ausgeglichenheit bzw. Stressbelastung des Einzeltiers eine nicht unerhebliche Rolle spielen. (RÜSBÜLDT, 2001).

Eine kausale Therapie des Sommerekzems und damit der Typ I Allergie existiert bisher nicht.

Versuche zur Hyposensibilisierung Culicoides-allergischer Pferde scheinen Erfolg versprechend (ANDERSON et al., 1996). Da bisher das Allergen allerdings nicht näher determiniert werden konnte, wird hierzu ein grober Gesamtextrakt der Mücke verwendet.

Dieser birgt jedoch das Risiko, dass Immunreaktionen, insbesondere Allergien gegen andere als die spezifischen allergenen Bestandteile des Extraktes durch die Behandlung ausgelöst werden. Zieht man zudem in Betracht, dass ein großer Teil der Allergiker gegen mehr als nur ein Allergen sensibilisiert ist und somit prinzipiell gegen eine Reihe von Allergenen hyposensibilisiert werden müsste, werden die praktischen Grenzen dieser Therapieform deutlich.

Einen weiten Überblick über die von Tierärzten und Patientenbesitzern verwendeten (symptomatischen) Therapeutika gibt RÜSBÜLDT (2001): So werden neben der äußerlichen Anwendung verschiedenster Fette und Öle und Insektenrepellents, u. a. Cortikoide oder Anti- histamininka zur Immunsuppression eingesetzt, aber auch Homöopathika, Eigenblut- behandlungen und ihre Variationen, Bioresonanz oder biologisch aktive Peptide.

BRÜNNLEIN (2001) konnte in ihren Untersuchungen zum Sommerekzem keinen dauer- haften und zuverlässigen Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop^® I (Gegensensibilisierung nach Theurer) oder Insol^®Dermatophyton auf die generelle oder Culicoides-spezifische Sensibilisierung nachweisen.

Erfolgversprechend bleibt bisher alleine eine möglichst weitreichende Allergenkarenz (Ekzemerdecken, Verbringen der Tiere in mückenfreie, bzw. arme Umgebung). Allerdings bedeutet auch dies keine Heilung der Allergie, sondern nur ein Verhindern der klinischen Symptome. Selbst nach bis zu fünfzehn Jahren Symptomfreiheit, erreicht durch Verbringen von sommerekzemkranken Tiere auf die Nordseeinsel Spiekeroog, blieb die spezifische Sensibilisierung deutlich bestehen (KOBELT, 2001). Auch nach dieser langen Zeit hätte also ein erneuter Allergenkontakt den klinischen Ausbruch des Sommerekzems zur Folge.

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2.2 Immunglobulin-Isotypen des Pferdes und ihre Bedeutung für die Typ I-Allergie

Erste Untersuchungen zum Immunglobulinsystem des Pferdes wurden Mitte der sechziger bis Anfang der siebziger Jahre durchgeführt. Zu dieser Zeit galt das Interesse allerdings nicht dem Pferd an sich. In der Humanmedizin dienten Pferdeseren damals weit verbreitet als Antikörper-Quelle zur passiven Immunisierung (Hyperimmunseren), beinhalteten aber das Risiko der „Serumkrankheit“, einer Allergie vom Typ III (s. 2.1.1) gegen Proteinbestandteile des equinen Serums. Ziel war es daher, Antikörper möglichst von solchen Serumbestandteilen reinigen zu können. Anhand der Serumelektrophorese zeigte es sich, dass sich das „Gesamt- immunglobulin“ in verschiedene Fraktionen auftrennen ließ. So konnten bereits IgM (ROCKEY et al., 1964; HILL & CEBRA, 1965), IgA ( VAERMANN et al, 1971, MC GUIRE et al., 1973), sowie vier IgG-Isotypen (IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T)) (ROCKEY et al., 1964; MONTGOMERY, 1973; MC GUIRE et al., 1973) differenziert werden.

SUTER & FREY präparierten 1983 equines IgE aus Serum endoparasitisch stark infizierter Fohlen und gaben dessen Reinheitsgrad mit 83% an. Antiseren aus mit dieser IgE-haltigen Präparation immunisierten Kaninchen zeigten Kreuzreaktionen mit humanem, murinem und Ratten IgE.

Mitte der neunziger Jahre erwachte neues Interesse an den Immunglobulin-Isotypen des Pferdes. Die Analyse der Organisation der Gensegmente für die konstanten Regionen der schweren Ketten (cH-Gene) der equinen Immunglobuline (WAGNER et al. (1998) ergab, dass das Pferd neben je einem IgM, IgE und IgA die genetische Information für sechs IgG Subtypen besitzt. Damit hat das Pferd nach dem Schwein die größte Anzahl an cγ Genen aller bisher untersuchter Säugetierspezies. Für drei dieser Gene konnten die korrespondierenden IgG-Isotypen bereits identifiziert werden: IgG1 (IgGa) für cγ 1, IgG3 (IgG (T)) für cγ 3 und IgG4 (IgGb) für cγ 4. Die als „IgGc“ bezeichnete Immunglobulinfraktion ist zur Zeit noch keinem Gen zugeordnet. Dass auch die übrigen drei cγ Gene exprimiert werden, wurde jüngst von A. WEGE gezeigt (persönliche Mitteilung). Ein IgD konnte bisher beim Pferd weder auf genetischer Ebene, noch im Serum zuverlässig nachgewiesen werden.

Bei Mensch und Maus kommt dem Immunglobulin-Isotyp IgE eine zentrale Bedeutung in der Allergie vom Typ I zu: IgE bindet über einen hochaffinen Rezeptor (Fcγ-RI) bereits unkomplexiert an die dominierenden Typ I Effektorzellen (Mastzellen, basophile Granulozyten). Spezifische Antigenbindung an die zellständigen IgE-Moleküle führt, sofern diese in ausreichender Dichte vorhanden sind, zu einer Kreuzvernetzung der Immunglobuline und Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren. Hierdurch wird die Zelle aktiviert und es erfolgt die Degranulation präformierter Entzündungsmediatoren sowie die Neusynthese und Freisetzung weiterer Mediatoren. (s. 2.1.1)

Aus Untersuchungen in vornehmlich humanen und murinen Systemen ist bekannt, dass auch Immunglobuline des Isotyps IgG an Mastzellen binden können. Die IgG-bindenden Rezeptoren Fcγ-RI, Fcγ-RII und Fcγ-RIII konnten auf der Zelloberfläche humaner Mastzellen nachgewiesen werden (OKAYAMA et al., 2000). Über den hochaffinen Rezeptor Fcγ-RI, wie auch über den Rezeptor Fcγ-RIII kann eine Degranulation der Zelle herbeigeführt werden (OKAYAMA et al., 2001; MIYAJIMA et al, 1997), während der niederaffine Rezeptor Fcγ- RIIB in der Lage ist, die durch Fcε-RI vermittelte Aktivierung der Zellen zu hemmen, wenn

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beide Rezeptortypen durch den selben multivalenten Liganden gebunden werden (DAERON et al., 1995). (s. 2.3.3.2) Ob und mit welcher Funktion diese Rezeptortypen auch auf equinen Mastzellen exprimiert werden, ist bislang nicht untersucht. Zudem dürfte es von großem Interesse sein, welche (regulatorische) Rolle hier die sechs verschiedenen IgG-Isotypen spielen.

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2.3 Immunmodulation

2.3.1 Definitionen und Einsatzmöglichkeiten

Das Konzept der Immunstimulation erstellte Dr. William B. Coley 1907. Er bemerkte spontane Tumorregressionen bei einigen seiner Patienten nach Septikämie. Aus dieser Beobachtung heraus entwickelte er ein Gemisch von Bakterientoxinen (Coley´s Toxin), welches er zur Krebstherapie einsetzte. (RUSH, 2001)

A. MAYR (ROLLE & MAYER, 1993) führte den Begriff der „Paramunisierung“ ein. Damit bezeichnete er zunächst begleitende, antigenunspezifische Wirkungen von Schutzimpfungen, deren funktionelle Mechanismen er fast durchweg den unspezifische Immunmechanismen (Phagozytose, ADCC, Bildung von Interferon, Aktivierung des Komplementsystems, hormonelle Interaktionen) zurechnete. Die „Paramunisierung“ sei allerdings auf die „noch vorhandene Funktionsfähigkeit des Immunsystems und seiner Zellen angewiesen“. Es soll durch die Paramunität ein schnell einsetzender (wenige Stunden), aber nur kurz anhaltender (einige Tage) Schutz des Individuums erreicht werden; ein Boostereffekt komme nicht zustande.

TIZARD (1993) definiert Immunstimulantien durch ihre Fähigkeit, nicht-antigenspezifische humorale und auch zellvermittelte Abwehrmechanismen zu fördern. Dies wird seiner Ansicht nach durch Makrophagen vermittelt, die durch die Phagozytose der Immunstimulanspartikel aktiviert werden und daraufhin bestimmte Zytokine (Interferon, Interleukin 1, Tumornekrose- faktor und/oder Interleukin 6) freisetzten und so zu einer Steigerung der Phagozytoseaktivität, der Antikörperproduktion und der Zytotoxizität führen.

RUSH (2001) postuliert, dass immunstimulatorische Therapien v.a. bei chronischen oder rezidivierenden Infektionen wirken, da hier eine Immunsuppression oder –toleranz vorläge.

Für wenig sinnvoll hält er ihren Einsatz bei akuten Infektionen, da dort das Immunsystem schon maximal stimuliert sei.

2.3.2 Immunmodulatoren in der Pferdemedizin

Das Haupteinsatzgebiet der Immunmodulatoren beim Pferd liegt derzeit in der Behandlung chronischer Atemwegserkrankungen und des equinen Sarkoids. Heute steht der Pferde- medizin dafür eine Vielzahl immunmodulatorisch wirksamer Substanzen zur Verfügung. Die meisten dieser Immunmodulatoren stellen relativ grobe Präparationen bakteriellen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs dar. Beispiele hierfür sind Präparationen aus Propionibacterium acnes, Mycobacterium bovis (BCG), Parapox ovis oder Acemannan (Aloe vera). Auch einigen synthetischen Produkten werden immunmodulatorische Fähigkeiten zugeschrieben (z.B. Levamisol). Neben diesen exogenen Modulatoren werden auch endogene Substanzen eingesetzt, u.a. Interferon α und der Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF).

(RUSH, 2001)

Von Therapieerfolgen durch den Einsatz eines Immunmodulators beim Sommerekzem berichten GRAMMEL und MÜLLER (1989). Die von ihm verwendeten biologisch aktiven Peptide sind Stoffwechselprodukte von Kolibakterien (ColibiogeN®) und führen ihren Angaben nach zur Stimulation der nichterregerspezifischen Immunabwehr, zur Stoffwechel- steigerung von Zellen, zur Hemmung der Histaminfreisetzung und zur „Normalisierung“ der B-T-Lymphozytenrelation. In der von ihnen durchgeführten klinischen Studie konnte trotz

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hohem therapeutischen Aufwand (2x wöchentliche intramuskuläre Injektion, von März bis September) nur ein Teilerfolg beobachtet werden. Von den sieben behandelten Tieren zeigten sich zwei Tiere deutlich gebessert, zwei weitere leicht gebessert. Bei den übrigen drei Pferden wurde die Therapie mangels Erfolg abgebrochen. Zu dieser Studie muss allerdings kritisch angemerkt werden, dass zum einen nur eine sehr geringe Anzahl an Pferden behandelt wurde, die zudem verschiedenen Rassen angehörten und unter verschieden Bedingungen gehalten wurden, zum anderen wurde die Ausgangssituation sowie der Therapieerfolg ausschließlich subjektiv durch die Besitzer beurteilt. Der wissenschaftliche Wert solcher Untersuchungen ist fraglich.

2.3.3 Immunmodulation der Typ I-Allergie

2.3.3.1 Modulation der TH1 / TH2-Balance

Das Hautpangriffsziel der Immunmodulationsversuche im Rahmen der Therapie IgE vermittelter Typ I-Allergien (s. 1.1.1) ist die TH1 / TH2-Balance. Dies stützt sich auf die weithin anerkannte Hypothese, dass die Bildung von Antikörpern des Isotyps IgE durch B- Zellen eine Folge der Dominanz von TH2-Helferzellen und der von diesen Zellen aus- geschütteten Zytokine (IL-4, IL-13) zum Zeitpunkt der Antigenerkennung darstellt.

1986 beschreiben MOSMANN et al. bei der Maus zwei verschiedene T-Helferzell-Klone, die er anhand ihrer Zytokinsekretionsmuster unterscheidet: TH1-Zellen (IFN-γ, IL-2, TNF-β) und TH2-Zellen (IL-4, IL-5). Diese entwickeln sich aus naiven T-Helferzellen (TH0-Zellen). Entscheidend, ob sich die naiven T-Helferzellen zu TH1- oder TH2-Zellen differenzieren, ist das zum Zeitpunkt der Antigenpräsentation herrschende Zytokinmilieu. Dabei wird Inter- leukin-4 eine entscheidende Rolle für die Differenzierung hin zu TH2-Zellen zugeschrieben.

Aber auch andere Zytokine (IL-1, IL-6 und IL-13) favorisieren die TH2-Entwicklung.

Interleukin-4 ist zudem in der Lage, die Expression von Interleukin-12-Rezeptoren auf antigenaktivierten T-Helferzellen zu unterdrücken. Dies ist deshalb von Bedeutung, da Interleukin-12 die Entstehung des TH1-Phänotyps fördert. Eine weitere Rolle in der Regulation spielt Interferon-γ, das über einen auf TH2-Zellen, nicht aber auf TH1-Zellen, exprimierten Rezeptor binden kann, welcher antiproliferative Signale auf die TH2-Zelle überträgt und so die Differenzierung hin zu TH1-Zellen unterstützt. (HAAS et al., 1999) Eine Beeinflussung der TH1 / TH2-Balance ist zudem durch Chemokine, eine Unterfamilie der Zytokine, möglich (HAYGLASS et al., 2000). Als Chemokine wird eine Gruppe kleiner Proteine bezeichnet, die sich durch stark konservierte strukturelle Motive basierend auf einem Cystein-Gerüst auszeichnen. Diese Chemokine (chemotactic cytokines) und ihre Rezeptoren spielen zum einen eine Schlüsselrolle bei der Leukozytenmigration. Das Chemokin Eotaxin zu Beispiel, welches von Epithelzellen und Phagozyten gebildet wird, wirkt sehr selektiv auf basophile und eosinophile Granulozyten. Es besteht zudem der Verdacht, dass Chemokine eine differenzierte Rekrutierung von TH1- oder TH2-Zellen in ein Entzündungsgebiet be- wirken können. (Bei TH2-Zellen konnte z.B. die Expression des Eotaxin-Rezeptors nachgewiesen werden) (HAYGLASS et al., 2000).

Neben ihrer chemotaktischen Fähigkeit wird den Chemokinen aber noch eine Beteiligung bei weiteren immunologischen Funktionen zugeschrieben, z.B. bei der Hemmung der T-Zell- Proliferation, der Aktivität zytotoxischer T-Zellen und NK-Zellen und, insbesondere hier von

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exprimieren TH1- und TH2-Zellen z.T. verschiedene Chemokinrezeptoren auf ihren Oberflächen, oder aber bestimmte Rezeptoren in unterschiedlicher Dichte. Weitere Untersuchungen sprechen dafür, dass auch die initiale Differenzierung der naiven T-Zellen mit durch Chemokine gesteuert wird.

Die Effekte von Chemokinen scheinen außerdem nicht nur auf T-Zell-Funktionen beschränkt zu sein. Bei atopischen Patienten konnte z.B. eine direkte Stimulation von B-Zellen durch Chemokine zur IgE- und IgG4-Synthese nachgewiesen werden. (HAYGLASS et al., 2000;

SIEVEKE & HAMANN, 1998; CHENG et al. , 2001)

Das Zytokin-/ Chemokinmilieu unterliegt einer komplexen Regelung durch eine Vielzahl endogener und exogener Faktoren. Dabei sind u.a. auch die Art des Pathogens, die Antigen- menge, die physikalische Form und die Eintrittspforte des Antigens von Bedeutung.

Bakterien-, Protozoen- und Virenantigene scheinen über ein Triggering von Makrophagen und dendritischen Zellen bevorzugt zur Interleukin-12-Freisetzung und somit zur TH1- dominierenden Immunantwort zu führen, wohingegen Wurmparasiten und als Allergene fungierende Antigene über Interleukin-4 und Interleukin-13 aus basophilen Granulozyten eine TH2-Antwort favorisieren. (HAAS et al., 1999) Auch Speichelextrakt der Zecke Ixodes ricinus soll eine TH2-dominante Immunantwort auslösen (KOVAR et al., 2001). Es kann damit hier die Hypothese aufgestellt werden, dass auch Speichel von anderen blutsaugenden Insekten, insbesondere Culicoides, ebenfalls diese Reaktion auszulösen vermag, was für die Äthiologie des Sommerekzems von Bedeutung wäre.

Ein Ziel der Immunmodulation im Zuge der Allergie vom Typ I ist nun eine Umlenkung von einer TH2- zu einer TH1-gerichteten Immunantwort und somit weg von einer IgE vermittelten zu einer Zell-, bzw. IgG-vermittelten Reaktion. Die hierzu verwendeten Immunmodulatoren können in folgende Kategorien eingeteilt werden: TH1-fördernde Zytokine (z.B. IFN-γ), Immunsuppressoren oder Inhibitoren der Zytokintranscription (z.B. Cyclosporin A, Tacrolimus) und TH2-Zell-Inhibitoren (Suplatast). Weitere, nicht etablierte, Therapien basieren auf monoklonalen Antikörpern gegen T-Zellen oder gegen Zytokine oder auf Zytokinrezeptor-Antagonisten. (TOKURA et al, 2001)

Neuere Untersuchungen beschäftigen sich mit der Möglichkeit einer TH1-Induktion durch ab- getötete Bakterien oder deren Bestandteile, CpG Oligodesoxynucleotiden oder Plasmid-DNS.

(WOHLLEBEN & ERB, 2001) CpG-DNS soll über die Aktivierung von Monozyten, Makro- phagen und dendritischen Zellen die Bildung TH1-artiger Zytokine (z.B. IL-12) stimulieren und über die Aktivierung von NK-Zellen die Freisetzung des TH2-hemmenden IFN-γ fördern (KRIEG, 1999).

2.3.3.2 Modulation von Effektorzellen

Ist der Klassenwechsel unter Einfluss von TH2-Zellen erfolgt und produzieren B-Zellen nun IgE-Antikörper, werden diese über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (Fcε-RI) v.a. an der Ober- fläche von Mastzellen und basophile Granulozyten gebunden. Binden spezifische Antigene bzw. Allergene an zellständige IgE-Moleküle, können sie diese, wenn in ausreichender Menge vorhanden, kreuzvernetzen und die Fcε-Rezeptoren somit zusammenlagern, was zur Aktivierung der Zelle führt. Versuche, die Rezeptoren durch IgE-Analoga oder Anti-Fcε-RI–

Antikörper kompetitiv zu hemmen, führten i.d.R. zur Aktivierung und Degranulation der

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Zellen. Von einer erfolgreichen Blockade des Fcε-RI, ohne Stimulierung der Zellen, berichten HAAK-FRENDSCHO et al. (1993). Durch ein Fcε-RI-IgG-Immunoadhäsin gelang es ihnen, in vitro und in vivo im murinen System IgE-vermittelte anaphylaktische Reaktionen zu hemmen.

Die Expression von Fcε-RI auf der Zelloberfläche ist positiv an den Serum-IgE-Spiegel gekoppelt. Erhöhte IgE-Gehalte im Serum führten im murinen und humanen System zur Heraufregulierung der Rezeptorexpression von Mastzellen und basophilen Granulozyten, wohingegen eine Behandlung mit Antikörpern gegen IgE eine verminderte Expression auf Basophilen zur Folge hat (COSTA et al., 1997). Anti-Fcε-RI-Antikörper werden bereits erfolgreich als Therapeutikum bei allergischem Asthma eingesetzt (CHANG, 2000). Die Tatsache, dass physiologisch Autoantikörper gegen IgE vorkommen, führte zu Versuchen, eine im Rahmen der Allergiebehandlung nützliche anti-IgE-Autoimmunantwort durch Vakzinierung zu erhalten, was beim Affen bereits gelang (STADLER et al., 2001).

Neben dem Fcε-Rezeptor I werden auch andere Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten exprimiert, so IgG-bindende Rezeptoren (Fcγ-R I, Fcγ-RII und Fcγ-RIII) und, zumindest nach Vorbehandlung mit IL-3, IL-5 oder GM-CSF, ein Rezeptor, der sekretorisches IgA bindet (GALLI, 2000). Einer dieser Rezeptoren, der niederaffine Rezeptor Fcγ-RIIB, ist in der Lage, die durch Fcε-RI vermittelte Aktivierung der Zellen zu hemmen, wenn beide Rezeptortypen durch den selben multivalenten Liganden gebunden werden (DAERON et al., 1995). Eine solche Bindung kann zustande kommen, wenn ein Antigen/Allergen an zellständiges IgE bindet, das bereits an anderen Epitopen IgG gebunden hat. Das IgG seinerseits kann dann über den Fc-Teil den Fcγ-Rezeptor binden (OTT et al., 2002). ZHU et al. (2002) entwickelten aus diesem Ansatz heraus ein Protein, welches gleich- zeitig Fcε-RI und Fcγ-RII binden kann. In vitro konnte durch dieses Protein eine Hemmung der IgE vermittelten Histaminausschüttung bewirkt sowie im murinen Modell in vivo anaphylaktische Reaktionen verhindert werden. Das therapeutische Potential solcher Substanzen in der Behandlung von Typ I-Allergien ist noch unerforscht.

Sowohl Mastzellen, als auch basophile Granulozyten können durch eine Reihe von Substanzen unabhängig vom Fcε-RI aktiviert werden. Dazu gehören Bakterien- und Parasitenprodukte (z.B. Lipopolysaccharide, Adhäsine), Chemokine sowie Komplement- faktoren (C5a). Einige dieser Substanzen sind in der Lage die Mediatorfreisetzung zu modulieren, d.h. nur bestimmte Mediatoren freizusetzen oder diese nur in geringe Mengen oder aber sehr langsam auszuschütten. (GALLI, 2000; HAYGLASS et al., 2000). Inwiefern solche Substanzen allerdings für einen therapeutischen Einsatz geeignet sind, ist bisher noch unklar.

Im Zuge der Degranulierung von Mastzellen und basophilen Granulozyten werden prä- formierte Mediatoren ausgeschüttet sowie andere neu synthetisiert und freigesetzt (s. auch 2.1.1). Mastzellen können dabei TNF-α freisetzten (aus Granula oder neu gebildet), welches eine bedeutende Rolle in der Leukozytenrekrutierung im Entzündungsgebiet spielt. So konnte zum einen an mastzelldefizienten Mäusen gezeigt werden, das Mastzellen notwendig für die Leukozyteninfiltration sind, zum zweiten konnte fast 50% der IgE- und Mastzell-abhängigen Einwanderung von neutrophilen Granulozyten und mononukleären Zellen durch einen Antikörper gegen TNF-α gehemmt werden (GALLI, 2000). Die so rekrutierten Leukozyten scheinen in der Spätphase der allergischen Reaktion, nach ca. acht Stunden,

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al., 1997). In Untersuchungen an Mäusen konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide oder Cyclosporine in vitro in der Lage sind, die Zytokinproduktion von Mastzellen zu hemmen und in vivo Mastzell- und TNF-α abhängige allergische Entzündungen zu unterdrücken. Dies wird als Hautwirkungsmechanismus jener Medikamente bei allergischem Asthma angesehen (COSTA et al., 1997).

Die gezielte Immunmodulation im Rahmen der Therapie von Typ-I-Allergien gestaltet sich schwierig, da die Regelmechanismen des Immunsystems und ihre Interaktionen zur Zeit nur bruchstückhaft bekannt sind. Ein Eingreifen in diese fein abgestimmten Regekreise hat i.d.R.

schwer zu überschauende und manchmal überraschende Folgen. Zum anderen muss man sich hier vor Augen halten, dass es sich bei dem unter der Allergie ablaufenden Vorgängen um prinzipiell notwendige Mechanismen des Immunsystems handelt (s. auch 2.1.1). Der Versuch, die pathologische Situation zu beeinflussen, kann u.U. relevante Immunfunktionen beeinträchtigen und so zu unerwünschten Nebenwirkungen führen.

2.3.4 Der Immunmodulator Baypamun

^®

Der seit 1990 auf dem Markt befindliche Immunmodulator Baypamun® (Fa. Bayer AG) enthält als wirksame Komponente das inaktivierte Virus Parapox ovis (iPPOV), Stamm D1701.

Zur Produktion von Baypamun^® werden diese Viren in Rindernierenzellen angezüchtet und titriert, dann von Zelldebris gereinigt und mit binärem Ethylenimin chemisch inaktiviert.

Nach Konzentration durch Ultrafiltration wird das Virusmaterial in Medium rekonstituiert und dabei auf den gewünschten Produkttiter (10^6,75GKID50/ml) eingestellt. Als Stabilisator werden nun der Viruspräparation 25 mg Polygeline zugesetzt und die Präparation letztlich lyophilisiert (FACHINGER et al., 2000).

Die Mitglieder der Familie der Poxviridae stellen die größten bekannten Viren dar. Ihr Genom besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNS, die von Strukturproteinen, Enzymen und einer äußeren Hülle umgeben ist. Die Doppelmembran der Hülle enthält diverse virus- spezifische Oberflächenproteine (Oberflächenfilamente). Unter den Viren nehmen die Pox- viridae aufgrund ihres grundsätzlich verschiedenen komplexen Aufbaus und ihrer relativen Autonomie (sie reifen im Zytoplasma ohne Mitwirkung des Zellkerns zu kompletten infektionstüchtigen Viren) eine Sonderstellung ein.

Die Parapoxviren sind eine Gruppe immunologisch engverwandter Spezies. Sie sind 270 x 170 nm groß, von ovoider Form und zeigen eine regelmäßige Anordnung der Oberflächen- filamente. Ihr Genom ist mit einem Molekulargewicht von nur 85 x 10⁶ D auffallend klein;

bemerkenswert ist der im Vergleich zu anderen Pockenviren wesentlich höherer Gehalt an Cytosin und Guanin.

Parapox ovis selbst ist der Erreger des Ecthyma contagiosum der kleinen Wiederkäuer (Orf, Lippengrind). Es ist weltweit verbreitet und für Schafe und Ziegen hoch kontagiös. Parapox ovis gilt zudem als Zoonoseerreger, Pferde hingegen werden als resistent angesehen.

Nach überstandener Infektion wird eine Immunität erreicht, die aber nicht sehr stabil ist und schon nach relativ kurzer Zeit (maximal acht Monate) durchbrochen werden kann.

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Inaktivierte Viren sollen nur eine äußerst schwache, nicht protektive, Antikörper-Antwort auslösen. (ROLLE & MAYR, 1993)

Die immunmodulatorische Kapazität von inaktiviertem Parapox ovis wurde erstmals von MAYR et al. (1978) beschrieben. Im Mäusemodell stellten sie bei prophylaktischer Verabreichung inaktivierter Parapox ovis Viren eine deutlich reduzierte Mortalitätsrate nach Pseudomonas aeruginosa-Infektion fest. Anschließende in vitro Untersuchungen konnten u.a.

eine erhöhte Zytokinfreisetzung (IFNα, TNFα, IL-2, GM-CSF), eine erhöhte Phagozytose- aktivität und erhöhte Natürliche-Killerzellaktivität durch inaktiviertes Parapox ovis belegen (FACHINGER, 2000).

Untersuchungen über Wirkungsweise des Immunmodulators Baypamun® in vitro an PBMC von Schweinen (FACHINGER et al., 2000) machen T-Helferzellen als die hauptsächlich aktivierten und poliferierenden Zellen fest . Sie sollen die Quelle der erhöhten Spiegel an IL- 2, IFN-α und IFN-γ sein. Für einen Einfluss auf den unspezifischen Anteil des Immunsystems (Phagozytoseaktivität, Bildung radikaler Sauerstoffspezies, NK-Zellaktivität) wurden hier allerdings keine Belege gefunden. Anhand von Ergebnissen weiterer Untersuchungen im Schwein vermuten FACHINGER et al. (2000) eine Wirkungsweise als Superantigen, da die Aktivierung der T-Helferzellen MHC Klasse II abhängig, aber nicht darauf beschränkt ist. Es bestehen Hinweise auf eine rezeptorvermittelte Aktivierung.

Die immunmodulatorische Kapazität der Virus-DNS alleine wurde bisher nicht untersucht.

Denkbar wäre hier, aufgrund des beschriebenen hohen Cytosin- und Guaningehalt der DNS der Parapoxviridae, eine Wirkung über möglicherweise enthaltene CpG-Motive.

In Untersuchungen, die speziell im Pferdesystem durchgeführt wurden, konnten in vitro eine Parapox ovis induzierte Interferon-Bildung mononukleärer Zellen (STRUBE et al.,1989), eine Steigerung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten (FÖRSTER, 1991) sowie eine Hemmung des stressinduzierten Cortisolanstiegs (SIEBERT, 1988; MAYER & SIEBERT, 1990) gezeigt werden.

Das klinische Anwendungsgebiet von Baypamun N® umfasst zur Zeit die Prophylaxe, Metaphylaxe und Therapie von Infektionskrankheiten sowie die Verhinderung stress- induzierter Krankheiten (Fa. Bayer AG).

Praktizierende Tierärzte berichteten gleichwohl, dass diese bestimmungsgemäße Medikation von Pferden, die zudem an der Typ I-Allergie Sommerekzem litten, spontan zu einer Besserung der klinischen Symptome dieser Erkrankung geführt habe (persönliche Mitteilung B. BUSCH, 1999). Klinische Studien zur Wirksamkeit von Baypamun® oder vergleichbarer Immunmodulatoren im Rahmen der Allergiebehandlung liegen z.Zt. nicht vor und auch in- vitro Untersuchungen wurde bisher nicht unter dem Gesichtspunkt der Modulationsfähigkeit allergiebedeutsamer Immunmechanismen durchgeführt.

Die hier vorliegende Arbeit untersucht anhand des Sommerekzems der Pferde, als Modell der Allergie vom Typ I, zum einen den Einfluss des Immunmodulators Baypamun N® auf die klinische Symptomausprägung im Rahmen einer allergischen Erkrankung, zum anderen aber auch auf ausgewählte Blutparameter und immunologische Parameter, wie die allergenspezifische Histaminausschüttung basophiler Granulozyten (FIT) und die medikamenten- spezifische Antikörperbildung von allergischen und nicht allergischen Probanden.

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3 Probanden, Geräte, Material und Methoden

3.1 Probanden

Die in dieser Studie untersuchten Pferde stammten sämtlich aus Privatbesitz und wurden von ihren Besitzern der AG Immunologie für den Untersuchungszeitraum dankenswerterweise zur Verfügung gestellt. Alle Tiere gehören der Rasse der Islandpferde an. Untersucht wurden im Jahr 2000 nur Stuten (s. Tab. 1), im Jahr 2001 zusätzlich auch Hengste und Wallache (s. Tab.

2). Das Alter der Tiere lag zwischen einem und etwa 30 Jahren (im Durchschnitt 7 bis 8 Jahre). Es wurden sowohl in Island geborene, als auch kontinental gezogene Pferde in die Studie einbezogen. Pferde, die vorberichtlich bereits Symptome des Sommerekzems (SE) gezeigt hatten, bzw. während des Untersuchungszeitraum diese entwickelten, wurden als SE positiv eingestuft und diejenigen Tiere, die weder anamnestisch noch im Untersuchungs- zeitraum Symptome ausgeprägt hatten, als SE negativ.

3.1.1 Probanden im Untersuchungsjahr 2000

Nr. Geschlecht Geburtsjahr Geburtsland Export SE SE seit

1 Stute 1992 Island 1994 positiv 1997

2 Stute 1991 Island 1993 positiv 1996 3 Stute 1992 Island 1993 positiv 1996 4 Stute 1992 Island 1993 positiv 1996 5 Stute 1992 Island 1993 positiv 1996 6 Stute 1988 Island 1990 positiv 1992 7 Stute 1993 Island 1994 positiv 1997 8 Stute 1993 Island 1994 positiv 1997 9 Stute 1990 Island 1994 positiv 1997

13 Stute 1993 Island n.b. positiv n.b

14 Stute 1996 Deutschland - positiv n.b

15 Stute 1991 Island n.b positiv n.b

16 Stute 1997 Frankreich - negativ -

20 Stute 1992 Island 1993 negativ -

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Tabelle 1: Probanden im Untersuchungsjahr 2000

Aufgeführt sind hier die untersuchten Pferde des Jahres 2000. Die Spalten enthalten von links nach rechts die Versuchsnummer des Tieres (Nr.), dessen Geschlecht, das Geburtsjahr und Geburtsland, das Jahr des Exportes aus Island (wenn nicht kontinental gezogen) und den vorberichtlich erhobenen klinischen Allergiestatus (Sommerekzem (SE) positiv oder negativ) sowie das Jahr des ersten

Auftretens von klinischen Symptomen. Nicht bekannte Daten sind durch ″n.b″ gekennzeichnet, nicht existente Daten durch ″-″.

Pferd Nr. 3 schied am 18. August 2000 aus gesundheitlichen Gründen aus dem Versuch aus.

3.1.2 Zusätzliche Probanden im Untersuchungsjahr 2001

Zusätzlich zu den Probanden aus dem Jahr 2000 wurden folgende Pferde untersucht:

28 Hengst 2000 Deutschland - negativ -

30 Stute 2000 Deutschland - negativ -

31 Stute 2000 Deutschland - negativ -

33 Wallach ca. 1970 n.b. n.b positiv n.b

36 Wallach 1995 Deutschland - positiv n.b

37 Stute 1999 Deutschland - positiv 2000

38 Wallach ca. 1975 n.b ? positiv n.b

39 Stute 1999 Deutschland - positiv 2000

Tabelle 2: Zusätzliche Probanden im Untersuchungsjahr 2001

Aufgelistet sind hier die zusätzlich zu den in Tab.1 aufgeführten Pferden im Jahr 2001 untersuchten Pferde. Der Tabellenaufbau und die Kennzeichnung entsprechen denen von Tab. 1.