Klonierung und Charakterisierung von Seminalplasmaproteinen der Huftiere

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem

Institut für Hormon- und Fortpflanzungsforschung an der Universität Hamburg

Klonierung und Charakterisierung von Seminalplasmaproteinen der Huftiere

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med.vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Alexandra Schupp aus Teheran

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. C. Kirchhoff

1. Gutachter: Prof. Dr. C. Kirchhoff

2. Gutachter: Prof. Dr. Hassan Y. Naim

Tag der mündlichen Prüfung: 04.06.2004

„Auch die weiteste Reise beginnt mit dem ersten Schritt“

Konfuzius

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 7

2. Literaturübersicht 10

2.1. Allgemeiner anatomischer Aufbau der inneren männlichen Geschlechtsorgane 10 2.2. Embryologie der inneren männlichen Geschlechtsorgane 10

2.3. Der Hoden 11

2.4. Die Akzessorischen Geschlechtsdrüsen 12

2.4.1. Der Nebenhoden 13

2.4.1.1. Anatomie und Histologie des Nebenhodens 13

2.4.1.2. Funktionelle Bedeutung des Nebenhodens und der übrigen akzessorischen Geschlechtsdrüsen für die posttestikuläre Spermienreifung 16

2.4.1.3. Sekretion und Absorption im Nebenhoden 19

2.4.1.4. Beitrag der akzessorischen Geschlechtsdrüsen zum Seminalplasma 21

2.4.2. Seminalplasmaproteine 22

2.4.2.1. Zusammensetzung des Seminalplasmas 22

2.4.2.2. CRISP-Proteine 23

2.4.2.3. Spermadhesine 23

2.4.2.4. Fibronektin-TypII(Fn2)-Domänen-Proteine 25

2.5. Abläufe im weiblichen Genitale 28

2.5.1. Kapazitation 28

2.5.2. Akrosomenreaktion 29

3.

4.

4.1. Material 32

4.1.1 Gewebe und RNA-Extrakte 32

4.2. Methoden 32

4.2.1. RNA-Extraktion aus Geweben 32

4.2.2. Herstellung von cDNA durch Reverse Transkription 33

4.2.3. RT-PCR, Polymerase-Kettenreaktion 34

4.2.4. Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden für Northern-Blot-Analysen 35

4.2.5. Inverse 5´PCR zur Klonierung von 5´Enden 37

4.2.6. Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren 39

4.2.7. Herstellung kompetenter E.coli Bakterien für die Transformation 40

4.2.8. Ligation 41

4.2.9. Transformation von E.coli 43

4.2.10. Plasmid-DNA Präparation aus Bakterienzellen 45

4.2.11. DNA-Restriktionsverdau 46

4.2.12. Agarose-Gelelektrophorese 47

4.2.13. DNA-Elution aus Agarose-Gelen 49

4.2.14. Kommerzielle Sequenzierung 50

4.2.15. Northern-Blot-Analyse 51

4.2.15.1. 1,3 %iges denaturierendes Formaldehyd-Gel zur elektrophoretischen Auftrennung

von RNA 51

4.2.15.2. Northern-Blot, Kapillartransfer von RNA 52

4.2.15.3. Nichtradioaktive Hybridisierung von Northern-Blots 53

5. Ergebnisse 56

5.1. Molekulare Klonierung der Seminalplasmaproteine des Pferdes (HSPs) 56 5.1.1. Klonierung einer vollständigen HSP-1-kodierenden cDNA 56 5.1.2. Charakterisierung von HSP-1 als einheitliches Genprodukt 60 5.1.3. cDNA Klonierung von HSP-2 ähnlichen Genprodukten 63 5.1.4. Northern-Blot-Analyse der gewebespezifischen Genexpression HSP-ähnlicher

mRNAs 72

5.1.5. Vergleichende Analyse der vorhergesagten Proteinstruktur mit der anderer Spezies 73

5.2. PDC-109 79

5.2.1. cDNA-Klonierung von PDC-109 79

5.2.2. Subklonierung von PDC-109 80

5.2.3. Herstellung eines PDC-109-Konstruktes zur rekombinanten Expression und Sekretion

in Insektenzellen 81

5.2.4. Analyse der Gewebeverteilung und Größenbestimmung der PDC-109 mRNA mittels

Northern-Blot-Analyse 85

6. Diskussion 88

6.1. Sequenzanalyse der HSP-Transkripte 88

6.1.1. HSP-1 88

6.1.2. HSP-neu Varianten 89

6.2. Northern-Blot-Analyse 91

6.2.1. HSP-Varianten 91

6.2.2. PDC-109 92

6.3. Strukturvergleich der Fibronektin-TypII(Fn2)-Domänen-Proteine 94 6.4. Herstellung eines PDC-109 Konstruktes als Vorbereitung zur rekombinanten

Expression in Insektenzellen 99

7. Zusammenfassung 101

8. Summary 103

9. Literaturverzeichnis 105

10. Anhang 134

10.1. Symbole für Aminosäuren 134

10.2. Abkürzungsverzeichnis 135

1. Einleitung

Die Spermien der meisten Säuger sind beim Verlassen des Hodens noch nicht zur Befruchtung einer Eizelle in der Lage. Sie müssen spezifische Modifikationen durchlaufen, die sie zur Befruchtung befähigen. Diesen Modifikationen sind sie während ihrer Passage entlang des männlichen und weiblichen Genitaltraktes ausgesetzt. Man fasst sie auch unter dem Begriff der posttestikulären Spermienreifung und der Kapazitation zusammen.

Modifikationen, die vorwiegend die Spermienmembran betreffen, werden durch den direkten Kontakt mit Faktoren des umgebenden Milieus vermittelt und beruhen auf einer Umstrukturierung und dem Verlust von Membranproteinen bzw. der Integration neuer Proteine. Diese, besonders die Zellmembran betreffenden, Veränderungen haben in ihrer Gesamtheit einen wesentlichen Einfluss auf die Befruchtungsfähigkeit.

Von entscheidender Bedeutung sind hier die vom Nebenhoden und den übrigen akzessorischen Geschlechtsdrüsen sezernierten Proteine, welche durch den Kontakt mit der Spermienmembran die Fähigkeit der Spermien, eine Eizelle zu befruchten, beeinflussen.

Bedingt durch den unterschiedlichen Ort der Sekretion der einzelnen spezifischen Proteine treten diese zu den verschiedensten Zeitpunkten mit der Spermienoberfläche in Kontakt, die einen während der Spermienreifung im Nebenhoden, die anderen erst bei der Ejakulation und entlang des weiblichen Genitales.

Die Bedeutung der Heparin-bindenden Proteine und deren Bindung an die Spermienoberfläche im Hinblick auf die posttestikuläre Spermienreifung, die Kapazitation, die Akrosomenreaktion und die anschließende Spermien-Eizell-Interaktion ist an den bovinen Seminalplasmaproteinen bereits nachgewiesen und gut untersucht.

Auf Nukleinsäure- und Proteinebene konnten schon zahlreiche epididymale Genprodukte bei verschiedenen Spezies (Mensch, Ratte, Hund, Eber, Bulle und Hengst) identifiziert und charakterisiert werden (Chandonnet et al., 1990; Shivaji et al., 1990; Wempe et al., 1992). Bei den Untersuchungen equiner Seminalplasmaproteine konnten strukturelle Gemeinsamkeiten zu denen von Ratte, Eber und Bulle gezeigt werden (Calvete et al., 1994a, 1995c; Reinert et al., 1996).

Gegenstand dieser Arbeit sind die Fibronektin-TypII-Domänen-Proteine (Fn2-Domänen- Proteine) der Huftiere, die ihren Namen der großen Übereinstimmung mit den TypII Strukturen der Gelatin- und Heparin-bindenden Domäne des Fibronektins verdanken (Seidah et al., 1987; Constantine et al., 1992). Die Fn2-Domänen-Proteine des Seminalplasmas zeichnen sich durch zwei im Tandem angeordnete, konservierte Fn2-Domänen aus, die sich

durch unterschiedlich lange N-Termini und durch den Grad ihrer Glykosylierung unterscheiden (Calvete et al., 1996). Aufgrund ihrer Eigenschaft, an Heparin zu binden, werden sie auch als Heparin-bindende Proteine bezeichnet. Wegen ihrer geringen molekularen Masse von 15-30 Kilodalton zählen sie zu den niedermolekularen Proteinen, die sich jedoch zu höhermolekularen Multimeren zusammen lagern können (Calvete et al., 1994;

Töpfer-Petersen et al., 1998b).

Die bovinen Seminalplasmaproteine gehören seit den achtziger Jahren zu den am besten untersuchten Proteinen des männlichen Genitaltraktes und werden zusammen als BSPs (bovine seminal plasma proteins) bezeichnet. Zu ihnen gehören die BSP-A1/2, BSP-A3 und BSP-30K, die jeweils zwei tandemartig verknüpfte Fibronektin-TypII-Domänen (Fn2- Domänen) aufweisen und sich nur durch unterschiedlich lange N-terminale Bereiche unterscheiden. Da sich BSP-A1 und BSP-A2 nur in ihrer Glykosylierung unterscheiden, werden sie auch als PDC-109 (Protein with N-terminus aspartic acid, D, and carboxy terminus Cystein, having 109 amino acids) zusammengefaßt.

Die vielen anhand von PDC-109 gewonnenen Erkenntnisse lassen sich jedoch nicht uneingeschränkt auf andere Spezies übertragen (Therien et al., 1995; Gasset et al., 1997, 2000; Moreau et al., 1999; Müller et al., 1998; etc.). Denn obwohl die Fn2-Domänen-Proteine innerhalb der verschiedenen untersuchten Säuger weit verbreitet sind, gibt es doch erhebliche Unterschiede hinsichtlich ihres Ursprungs, ihrer Menge und nicht zuletzt ihrer Primärstruktur.

Welchen Einfluss diese Unterschiede hinsichtlich der Proteinfunktion haben ist Gegenstand aktueller Forschungsarbeiten, besonders im Hinblick auf die Erforschung vieler bislang ungeklärter Störungen männlicher und weiblicher Fertilität.

Die Erforschung der Mechanismen, die in vivo bei der Spermienreifung, Kapazitation und anschließender Befruchtung ablaufen, ist für das Verständnis solcher Fertilitätsstörungen unerlässlich, besonders im Hinblick auf ideopathische Störungen mit unbekannter Ursache.

Eine detaillierte Kenntnis dieser Abläufe würde zum einen die Diagnose dieser Funktionsstörungen, zum anderen deren Behandlung ermöglichen. Nicht zuletzt könnten Fortschritte auf diesem Gebiet die Entwicklung neuer, geeigneter Konservierungsmedien für Sperma in greifbare Nähe rücken. Die Erfolgsrate von künstlicher Befruchtung, sei es im human- oder veterinärmedizinischen Bereich könnte verbessert werden, würde es gelingen die Integrität der Spermien hinsichtlich ihrer Befruchtungsfähigkeit über einen langfristigen Zeitraum zu sichern. Dies ist zwar zurzeit eingeschränkt mit Glycerol und dem Eigelb von Hühnereiern möglich, jedoch sinkt die Anzahl von intakten, befruchtungsfähigen Spermien je länger der Aufbewahrungszeitraum ist. Besonders Sperma von Hengsten nimmt in der

Qualität mit der Länge der Lagerung deutlich ab, was eine erfolgreiche Belegung der Stuten stark reduziert und den Zuchterfolg beeinträchtigt. Auch speziesspezifische Ansprüche des Spermas an Konservierungsmedien könnte berücksichtigt werden. Für Sperma von vom aussterben bedrohter Tierarten für das bislang noch kein langfristig geeignetes Aufbewahrungsmedium bekannt ist, würden sich Möglichkeiten für die Spermienkonservierung und somit auch für den Erhalt der Arten eröffnen.

2. Literaturübersicht

2.1. Allgemeiner anatomischer Aufbau der inneren männlichen Geschlechtsorgane

Zu den inneren männlichen Geschlechtsorganen gehören die paarig angelegten Hoden (Testes), die ebenfalls paarig angelegten Nebenhoden (Epididymis) und Samenleiter (Ductus deferens) sowie die Harnröhre (Urethra), die akzessorischen Geschlechtsdrüsen und der Penis mit seinen Schwellkörpern (Corpora cavernosae).

Betrachtet man die männlichen Geschlechtsorgane im Hinblick auf Bildung, Speicherung und Transportweg der Spermien, so übernehmen die Keimdrüsen, die Hoden, die Bildung der Spermien. Sie sind von mehreren Hüllen umgeben und liegen im Hodensack. Der Nebenhoden (Epididymis) liegt dem Hoden der Länge nach an und wird in die Bereiche Nebenhodenkopf (Caput epididymidis), -körper (Corpus epididymidis) und -schwanz (Cauda epididymidis) eingeteilt. Vom Nebenhoden aus gelangen die Spermien über den Samenleiter (Ductus deferens) in die Harnröhre (Urethra), die hier zum Harn- Samenleiter (Canalis urogenitalis) wird. Entlang des Beckenabschnittes der Harnröhre befinden sich die akzessorischen Geschlechtsdrüsen. Das Sekret dieser Drüsen macht den größten Teil des Seminalplasmas aus und bildet zusammen mit dem Sekret des Nebenhodens und den Spermien die Samenflüssigkeit. Das Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen bildet den größten Volumenanteil des Seminalplasmas (Setchel et al., 1994).

2.2. Embryologie der inneren männlichen Geschlechtsorgane

Bereits bei der Befruchtung wird das Geschlecht chromosomal festgelegt, trotzdem entwickeln sich die Geschlechtsorgane embryonal zuerst als indifferente Gonadenanlagen. So sind bei beiden Geschlechtern beidseitig zwei Genitalwege angelegt: der Urnieren- oder Wolffsche Gang und der Müllersche Gang. Durch das von den ersten Leydigschen Zwischenzellen des fetalen Hodens gebildete Testosteron entwickelt sich der Nebenhodenkanal aus dem geschlängelten Anfangsabschnitt des Wolffschen Ganges. Aus dem geraden, kaudalen Teil entwickeln sich der Samenleiter und die Samenblasendrüse. Die Harnröhre geht aus dem Sinus urogenitalis hervor. Die Ductuli efferentes stellen die Verbindung des Rete testis zum Nebenhodenkanal her und entwickeln sich aus

Urnierenkanälchen. Die akzessorischen Geschlechtsdrüsen differenzieren sich aus dem distalen Wolffschen Gang und aus Epithelknospen des Sinus urogenitalis. Auch die Prostata und die Bulbourethraldrüse entstehen aus dem Sinus urogenitalis. Die Samenblasendrüse entwickelt sich aus dem Epithel des Wolffschen Ganges, ebenso die Samenleiterampulle, letztere jedoch meistens erst nach der Geburt (Schnorr, 1996). Die fetalen Sertolizellen bilden den Müllerian Inhibiting Factor (MIF), durch dessen Einfluß sich der Müllersche Gang und seine Derivate (Eileiter, Uterus, Vagina) zurückbilden (Behringer et al., 1994).

2.3. Der Hoden

Die paarig angelegten Hoden (Testes) sind je nach Tierart ei- bis kugelförmig. Ihre Größe variiert bei den verschiedenen Haussäugetieren. Da die Hoden zu den Organen der Bauchhöhle gehören sind sie mit Bauchfell überzogen, welches mit der Organkapsel (Tunica albuginea testis) verwachsen ist. Die Organkapsel bildet Bindegewebssepten (Septula testis), die in das Hodengewebe (Parenchym) einstrahlen und so eine große Anzahl kleiner Läppchen (Lobuli testis) bilden. Diese Läppchen bestehen ihrerseits aus gewundenen Samenkanälchen (Tubuli seminiferi contorti). Diese gehen in gerade Endabschnitte (Tubuli recti) über, die im Bindegewebskörper (Mediastinum testis) des Hoden das Hodennetz (Rete testis) bilden.

Einzige Ausnahme ist hier der Hengst, bei dem sich das Mediastinum und das Rete testis auf die Extremitas capitata beschränkt (Nickel et al., 1987). Von hier aus gelangen die Spermien über die Ductuli efferentes in den Nebenhoden. Das Hodenparenchym besteht aus den gewundenen Samenkanälchen und aus dem Hodenzwischengewebe (Interstitium). In der Wand der Samenkanälchen findet die Samenbildung (Spermatogenese) statt. Dort liegen auch die Sertoli-Zellen, die für die sich entwickelnden Samenzellen stützende und ernährende Funktion haben (Amman, 1981; Setchel et al., 1994). Das Interstitium enthält neben den versorgenden Gefäßen, Nerven und Fibroblasten auch Leydigsche Zwischenzellen, deren wichtigste Aufgabe die Synthese von Testosteron ist (Setchel et al., 1994).

2.4. Die Akzessorischen Geschlechtsdrüsen

Zu den akzessorischen Geschlechtsdrüsen gehören die Samenleiterampulle (Ampulla ductus deferens), die paarig angelegte Samenblasendrüse (Glandula vesicularis), die unpaare Vorsteherdrüse (Glandula prostatica oder Prostata), die ebenfalls paarig vorkommende Harnröhrenzwiebeldrüse (Glandula bulbourethralis), sowie die Urethraldrüsen (Glandulae urethrales).

Die akzessorischen Geschlechtsdrüsen findet man entlang des Beckenstückes der Harnröhre (Abb.: 1).

Abb. 1: Schema der männlichen Geschlechtsorgane zur Darstellung der arttypischen Merkmale der akzessorischen Geschlechtsdrüsen von Pferd und Rind. a rechter Hoden und Nebenhoden; b Samenleiter; c Harnblase; d Harnleiter; e Beckenstück der Harnröhre mit Mündungen der akzessorischen Geschlechtsdrüsen (beachte die tierartlich unterschiedliche Mündungsart des Ductus deferens und des Ductus excretorius); f Penis mit Penisstück der Harnröhre; g Beckenboden; Strichliert: Samenleiterampulle bzw. Bereich der Gll. ampullae;

Schwarz: Corpus bzw., Pars disseminata (exkl. Pfd.) der Prostata; Punktiert: Gl. vesicularis (Wdk.) bzw. Vesicula seminalis (Pfd.); Hellgrau: Gl. bulbourethralis (R. Nickel, A.

Schummer, E. Seiferle, Lehrbuch der Anatomie der Haustiere: Nebenhoden, Epididymis, und Samenleiter, Ductus deferens, S.331, Abb. 451-452)

Die Samenleiterampulle ist beim Hengst und Bullen besonders gut ausgebildet und als spindelförmige Anschwellung im Endabschnitt des Samenleiters zu finden. Beim Eber und Kater existiert eine Samenleiterampulle in dieser Form nicht, jedoch weist der Samenleiter auch bei diesen Spezies drüsenhaltiges Gewebe auf (Nickel et al., 1987). Die beim Hengst und Bullen gut untersuchten Sekrete der Samenleiterampulle bestehen unter anderem aus Ergothionin, Glycerylphosphorylcholin, Citrat, Fruktose und verschiedenen Proteinen (Beyler u. Zaneveld, 1982).

Die Samenblasendrüse kommt bei allen Huftieren vor und ist beim Hengst, Bullen und Eber stark ausgeprägt. Sie liegt seitlich am Harnblasenhals und lateral der Samenleiterampullen.

Da es sich beim Hengst um ein blasenförmiges Hohlorgan handelt, wird die Samenblasendrüse auch als Samenblase bezeichnet (Vesicula seminalis). Es handelt sich hier um eine verästelte tubuloalveoläre Drüse, die weitlumige Sammelräume aufweist. Das Sekret hat einen alkalischen pH-Wert, der die Motilität der Spermien anregt und sie gegen das saure Milieu im weiblichen Genitaltrakt schützt. 25 bis 30 % des Ejakulate-Volumens werden von der Samenblasendrüse gebildet. Es enthält unter anderem Prostaglandine, Ergothionin, Citrat, Fruktose und spezifische Proteine, die als Dekapazitationsfaktoren dienen (White, 1979;

Beyler u. Zaneveld, 1982). Der Ausführungsgang der Samenblase vereint sich für ein kurzes Stück mit dem Samenleiter und mündet in die Harnröhre.

Die Vorsteherdrüse oder Prostata ist bei allen Haussäugetieren vorhanden und besteht aus zwei Anteilen. Der kompakte Teil liegt dem Beckenstück der Harnröhre außen auf und wird als Corpus prostatae (Pars externa) bezeichnet. Die in der Wand der Harnröhre vorkommenden Drüsenläppchen werden als Pars disseminata (Pars interna) bezeichnet.

Dieser Teil fehlt dem Hengst. Bulle und Eber besitzen beide Anteile. Obwohl der Hund die größte Prostata hat, verfügt diese nur über einen geringen, versprengten Anteil der Pars disseminata. Die Prostata besitzt eine derbe Kapsel, von der aus Trabekel das Gewebe in Drüsenläppchen teilen. Diese Drüsenläppchen bestehen aus zusammengesetzten tubulösen Einzeldrüsen, über deren Ausführungsgänge das Prostatasekret in das Beckenstück der Harnröhre gelangt. Dieses Sekret wird auch als Vorsekret bezeichnet, da es zeitlich vor der Ejakulation abgegeben wird und zur Neutralisation des Urethrainhaltes dient (White, 1979;

Beyler u. Zaneveld, 1982). Sein Anteil variiert von 4-6 % beim Bullen, über 25-30 % beim Hengst bis hin zu 35-60 % beim Eber.

Die Harnröhrenzwiebeldrüse ist außer beim Rüden bei allen anderen Haussäugetieren vorhanden und beim Eber besonders stark ausgeprägt. Sie liegt dorso-lateral der Harnröhre auf, kurz bevor diese die Beckenhöhle verlässt. Auch sie besitzt eine derbe Kapsel, die jedoch beim Kater fehlt. Durch Trabekel wird das Parenchym in Läppchen unterteilt, die große Sekretsammelräume aufweisen. Die intraglandulären Gänge vereinigen sich zu nur einem Ausführungsgang. Nur das Pferd stellt mit bis zu 8 dieser Ausführungsgänge eine Ausnahme dar.

Zu den akzessorischen Geschlechtsdrüsen gehören auch die Urethraldrüsen, bei denen es sich um vereinzelte Drüsenkomplexe in der Wand der Urethra handelt. Diese sind jedoch nur beim Hengst, Rüden und einigen Wiederkäuern ausgebildet.

2.4.1. Der Nebenhoden

2.4.1.1. Anatomie und Histologie des Nebenhodens

Der Nebenhoden liegt bei den meisten Säugerspezies gemeinsam mit dem Hoden im Hodensack (Skrotum), wo sie vom Processus vaginalis umhüllt sind. Der Nebenhoden liegt dem Hoden der Länge nach an und ist über das Gekröse (Mesepididymis) mit diesem verbunden. Der Nebenhodenschwanz ist durch das Ligamentum testis proprium mit dem caudalen Ende des Hodens verankert. Weiterhin wird der Nebenhodenschwanz durch das Ligamentum caudae epididymidis am Boden des Processus vaginalis befestigt. Die genaue Lage des Nebenhodens zum Hoden weist tierartliche Unterschiede auf. Im Bereich des Nebenhodenkopfes befinden sich die Ductuli efferentes, die ihren Ursprung im Rete testis haben und hier in den Anfangsabschnitt des Nebenhodenkanals (Ductus epididymidis) münden (Budras et al., 1994). Die Anzahl der Ductuli efferentes variiert und liegt bei den kleinen Haussäugetieren zwischen 15-18, beim Bullen zwischen 13-15 und beim Hengst zwischen 12-23 (Nickel et al., 1987). Die Ductuli efferentes sind stark gewunden und werden durch bindegewebige Septen in keilförmige Läppchen unterteilt. Sie vereinigen sich zum Nebenhodenkanal (Ductus epididymidis). Dieser erstreckt sich vom Nebenhodenkopf bis zum Beginn des Ductus deferens, der aus dem Nebenhodenschwanz hervorgeht. Die Länge des Ductus epididymidis erreicht bei der Ratte eine Länge von 6 Metern (Jiang et al., 1994), beim Bullen eine Länge von 40-50 Metern und beim Hengst eine Länge von bis zu 81 Metern (Mosimann et al., 1990).

Histologisch lässt sich der Nebenhoden ebenfalls in Kopf, Körper und Schwanz einteilen.

Diese klassische Einteilung wurde 1926 durch Benoit um den Begriff des Initialsegmentes erweitert. Dieses liegt zwischen den Ductuli efferentes und dem Nebenhodenkopf und unterscheidet sich von den anderen Segmenten durch seinen charakteristischen histologischen Aufbau, findet sich jedoch nicht bei allen Haussäugetieren. Eine funktionsmorphologische Unterteilung wird von anderen Autoren (Glover u. Nicander, 1971; Orsi, 1983) vorgenommen, die von einem Initialsegment, Mittelsegment und Terminalsegment ausgehen.

Bei dieser Betrachtung liegt der Schwerpunk auf den gemeinsamen, evolutiv konservierten funktionellen und strukturellen Eigenschaften der Abschnitte. Diese Einteilung ist zum größten Teil mit der Einteilung in Nebenhodenkopf, -körper und -schwanz identisch (Chandler et al., 1979). Die Epithelien, die den Nebenhodengang auskleiden, sind in den einzelnen Bereichen morphologisch unterschiedlich (Hamilton, 1990). Unabhängig von den regionalen Unterschieden, die das Epithel des Nebenhodens aufweist, sind die Hauptzellen in allen Regionen zu finden und werden daher als Prinzipalzellen bezeichnet (Setchel, 1994).

Der laut Glover und Nicander als Initialsegment bezeichnete Bereich ist vor allem durch sein hochprismatisches Epithel gekennzeichnet, dessen Stereozilien im Bereich des Lumens eng gedrängt sind. Im Epithel liegen vereinzelt intraepitheliale Lymphozyten und Makrophagen.

Apikale multivesikuläre Strukturen und Mikropinocytosetätigkeit deuten auf aktive Absorbtionsvorgänge in diesem Bereich (Chandler et al., 1981). Im engen Lumen dieses Abschnittes finden sich nur wenige Spermien.

Das so genannte Mittelsegment dehnt sich über einen weiten Bereich aus. Das Epithel ist ebenfalls mit Stereozilien ausgestattet. Anfangs finden sich hochprismatische Zellen, die im Verlauf flacher werden. Das Lumen ist hier unterschiedlich weit und variiert im Verlauf. Hier werden besonders im distalen Bereich große Mengen an Spermien angetroffen. Die hochprismatischen Zellen zeichnen sich durch „dichte Körper“ aus, von denen angenommen wird, dass es sich um sekretorische Vesikel handelt (Hamilton, 1990).

Flaches Epithel leitet den Übergang zum Terminalsegment ein, das durch kurze Stereozilien gekennzeichnet ist. Das der Spermienspeicherung dienende Lumen ist weiträumig, wobei es zwischen den einzelnen Tierarten deutliche Unterschiede in Morphologie, Lage und Ausdehnung der einzelnen Abschnitte gibt. Allgemein nimmt die Epithelhöhe von Nebenhodenkopf zu Nebenhodenschwanz hin ab, während der Durchmesser zunimmt. Der gesamte Nebenhodenkanal ist eingebettet in ein Stroma aus Fibroblasten, Kollagen und einem Mantel aus glatten Muskelfasern, die distal zunehmen (Chandler et al., 1981; Holstein, 1980).

2.4.1.2. Funktionelle Bedeutung des Nebenhodens und der übrigen akzessorischen Geschlechtsdrüsen für die posttestikuläre Spermienreifung

Intensive Studien der vergangenen drei Jahrzehnte konnten die Bedeutung des Nebenhodens für die Spermienreifung, Speicherung und den Transport bestätigen (Orgebin-Crist, 1969;

Bedford, 1975; Robaire u. Hermo, 1988). Diese Funktionen wurden im Verlauf der Evolution notwendig, da die Entwicklung von spezialisierten Begattungsorganen eine Anpassung der Spermienfunktionen an die Verhältnisse im weiblichen Genitaltrakt erforderte (Bedford, 1992).

Spermien sind unter natürlichen Bedingungen beim Verlassen des Hodens noch nicht befruchtungsfähig (Kirchhoff u. Ivell, 1995; Piomboni, 1997). Neben der Fähigkeit zur gerichteten Fortbewegung fehlt ihnen auch die Fähigkeit, an die Zona-pelllucida der Eizelle zu binden und diese zu befruchten. Die für die Befruchtungsfähigkeit essentiellen Eigenschaften erwerben die Spermien im Verlauf einer mehrtägigen Passage durch den Nebenhoden und während dem als Kapazitation bezeichneten Reifungsprozess im weiblichen Genitale (zusammengefaßt in Yanagimachi, 1994a; Kirchhoff u. Ivell, 1995; Töpfer-Petersen et al., 1995 u. 1998). Die Dauer der Nebenhodenpassage variiert speziesspezifisch und liegt im Durchschnitt bei ein bis zwei Wochen (Bedford, 1992). Für viele Säuger wird das Erlangen dieser Befruchtungsfähigkeit hauptsächlich den Vorgängen während der Nebenhodenpassage zugeschrieben. So waren epididymale Spermien des Ebers, die aus dem Caput-Bereich entnommen wurden, nur zu 6 % in der Lage an die Zona pellucida der Eizelle zu binden, epididymale Spermien aus den Bereichen Corpus und Cauda dagegen zu 75 % bzw. 93 % (Burkin u. Miller, 2000).

Die einzige morphologische Veränderung während der Nebenhodenpassage ist der Verlust des Zytoplasmatröpfchens, welches sich am Anfangsteil der Spermiengeißel befindet.

Der Transport der Spermien im Nebenhoden erfolgt hauptsächlich durch Muskelkontraktionen. Die mehrmals in der Minute ablaufenden Kontraktionen der glatten Muskulatur gewährleisten eine gleichmäßige Durchmischung der Spermien mit der sie umgebenen epididymalen Flüssigkeit. Dieses epididymale Milieu, dem die Spermien während ihrer Nebenhodenpassage ausgesetzt sind, unterliegt ständigen Veränderungen. So wird die aus dem Rete testis stammende Seminalflüssigkeit während der Nebenhodenpassage unter Östrogeneinfluß auf weniger als 10 % des ursprünglichen Volumens reduziert (Hess et al., 1997). Aufgrund dessen ist die Spermienkonzentration im Nebenhodenschwanz um ca. 20 %

höher als im Rete testis (zusammengefasst in Robaire und Hermo, 1988). Die Rückresorption ist vermutlich auf eine Aktivität von Aquaporinen und Na+/K+-ATPase-Pumpen zurückzuführen (zusammengefasst in Hinton und Palladino, 1995a). Der Kontakt zu den sekretorischen Produkten des Nebenhodens, führt zu strukturellen Veränderungen auf der Spermienoberfläche. Diese stehen mit den funktionellen Veränderungen der Spermien im Verlauf des Reifungsprozesses im Nebenhoden in direktem Zusammenhang (zusammengefasst in Kirchhoff u. Ivell, 1995). Zu den funktionellen Veränderungen der Spermien gehören laut Orgebin-Crist (1987) die gerichtete Vorwärtsbewegung, der Erwerb eines immunsupressiven Schutzwalles, der ein Überleben im weiblichen Genitaltrakt ermöglicht, die Fähigkeit zur Akrosomenreaktion, die eine Zona-pellucida-Bindung ermöglicht, sowie die Fusionierung mit der Vitellinmembran der Eizelle. So werden im Nebenhoden unter Anderem gewebsspezifische Proteine produziert und ins Lumen sezerniert, die mit der Spermienmembran in Kontakt treten und in diese integriert werden. Dies führt zu einer Veränderung der Protein-, Glykoprotein- und Lipidstruktur der Spermienoberfläche, wodurch es zu einer Ladungsverschiebung an der Membranoberfläche kommt (Eddy u.

O´Brien, 1994). Eine veränderte Membranpermeabilität, Membranspannung und neue Bindungsstellen auf der Membranoberfläche sind besonders interessant, da die meisten Spermienfunktionen über die Oberfläche vermittelt werden, insbesondere die Interaktion der Gameten (Töpfer-Petersen et al., 1998a).

Die Fähigkeit zur Eigenbewegung, zu der die Spermien im Anfangsabschnitt des Nebenhodens noch nicht in der Lage sind, erreichen sie während der Passage durch den Nebenhodenkanal. Die genauen Abläufe sind noch nicht ausreichend geklärt, diskutiert werden jedoch Veränderungen des intrazellulären pH-Wertes, Konzentrationsschwankungen von Kalzium-Ionen und zyklischem AMP, sowie die Stimulation einer Adenylatzyklase durch Bikarbonat (Cooper u. Yeung, 1996). Entlang des Nebenhodenkanals nimmt die Anzahl der zur Eigenmotilität befähigter Spermien zu, ebenso die Fortbewegungsgeschwindigkeit und die gerichtete, geradlinige Bewegung (Cooper u. Yeung, 1996). Die Fähigkeit zur Befruchtung erlangen die Spermien der meisten Säuger im distalen Corpus- bis proximalen Cauda-Bereich des Nebenhodens (Bedford u. Hoskins; 1990), wo sie gespeichert werden. Die Befruchtungsfähigkeit bleibt maximal bis zu einem Zeitpunkt von drei Wochen erhalten (Bedford, 1975) und nur die in diesem Bereich gespeicherten Spermien werden bei der Ejakulation freigesetzt (Bedford, 1992).

Um eine Speicherung der Spermien im Nebenhoden zu ermöglichen, ist es nötig, diese gerade erlangte Motilität wieder einzuschränken. Hierfür ist ein saures Milieu im Nebenhodenkanal

verantwortlich, vor allem im Cauda-Bereich (Carr et al., 1985), welches durch Carboanhydrase-Aktivität (Calfish u. DuBose, 1990) und durch spezifische Protonen-Pumpen (Breton et al., 1996) aufrechterhalten wird. Dieser Zustand wird auch als „Säurestarre“ der Spermien bezeichnet.

Die intraluminale Flüssigkeit enthält für die Spermien schützende Faktoren. Unter anderem eine Superoxid-Dismutase, die die Spermien gegen die Lipidperoxidation schützt, und speziesspezifische Proteinase-Inhibitoren, darunter das HE 4, durch welche die Zelloberfläche vor Proteasen geschützt wird (Kirchhoff et al., 1991; Hinton u. Palladino 1995a, Hinton et al., 1995b). Der positive Einfluss, einer ebenfalls nachgewiesenen neutralen α -Glukosidase auf die Spermienmotilität wird bislang noch kontrovers diskutiert. Während Viljoen et al. (1990) und Fourie et al. (1991) diesen bestätigen, konnten Guerin et al. (1990) sowie Krause und Bohring (1999) diesen nicht belegen.

Daneben produzieren auch die akzessorischen Geschlechtsdrüsen Sekrete, die einen großen Anteil am Ejakulat und vor allem an der Befruchtungsfähigkeit und Motilität der Spermien haben. Allerdings sind trotz vieler Studien die genauen Mechanismen, die während der posttestikulären Entwicklung auf die Spermien einwirken, weitgehend unbekannt. So erscheinen viele Ergebnisse widersprüchlich. So wird zum Beispiel Gel-formenden Proteinen, die überwiegend in den Seminalvesikeln synthetisiert werden, ein inhibitorischer Effekt auf die Spermienmotilität zugeschrieben (Robert u. Gagnon, 1996). Ein Produkt der Prostata, ein Prostata-spezifisches Antigen, bewirkt dagegen eine Degradation dieser Gel-bildenden Proteine und übt damit einen positiven Effekt auf die Spermienmotilität aus (Lilja et al., 1989;

Robert and Gagon, 1996). Studien von Ahlgren et al. 1995 stellten an infertilen Männern mit einer reduzierten Spermienmotilität einen geringen Anteil an diesem Prostata-spezifischen Antigen fest.

Eine große Rolle für die Spermienfunktionen scheint das hauptsächlich aus der Prostata stammende Zink zu spielen (Arver u. Eliasson, 1982; Lewis-Jones et al., 1996), da es eine positive Wirkung auf die Stabilität des Chromatingerüstes hat (Kvist et al., 1987). Der Einfluß von Zink auf die Motilität der Spermien bleibt jedoch noch ungewiss, weil auch diese Studien bislang widersprüchlich sind (Fuse et al., 1999; Sin-Eng et al., 2000; Carreras u. Mendoza, 1990; Behne et al., 1988; Lin et al., 2000).

Die von den Spermien benötigte Energie wird durch den glykolytischen Abbau von Fruktose bereitgestellt, welche hauptsächlich von den Seminalvesikeln und der Samenleiterampulle bereitgestellt wird (Mann, 1964). Eine Ausnahme ist der Hengst, dessen Seminalplasma nur

wenig Fruktose enthält. Man nimmt an, dass seine Spermien ihren Energiebedarf durch den Abbau von Glukose und Sorbitol decken (Mann, 1975).

Patel et al. (1988) konnte eine positive Korrelation von Fruktose und Spermienmotilität nachweisen. In anderen Studien bestätigte sich dies jedoch nicht (Lewis-Jones et al., 1996;

Andrade-Rocha, 1999; Zöpfgen et al., 2000).

2.4.1.3. Sekretion und Absorption im Nebenhoden

Sowohl die Spermienreifung als auch die Spermienspeicherung im Nebenhoden spezifische Ansprüche an das die Spermien umgebene Milieu, die durch selektive und nicht selektive Absorptions- und Sekretionsvorgänge des Nebenhodenepithels erfüllt werden (Chandler et al., 1981). So besitzt das Epithel der Ductuli efferentes und des Nebenhodens die Fähigkeit zur Absorption von Wasser, Ionen und kleineren organischen Molekülen. Vor allem im cranialen Bereich des Nebenhodens werden Natrium und Chlorid-Ionen aktiv durch das Nebenhodenepithel absorbiert, was zu einer passiven Diffusion von Wasser aus dem Lumen des Nebenhodenkanals führt (Wong et al., 1978). So wird der größte Teil der aus dem Rete testis stammenden Flüssigkeit resorbiert, wodurch die intraluminale Dichte der Spermien zunimmt (Glover u. Nicander, 1971; Moore, 1996). Die Rückresorption von Flüssigkeit variiert zwischen den einzelnen Tierarten. Beim Bullen und beim Eber werden über 90 % der testikulären Flüssigkeit im Bereich der Ductuli efferentes und im Caput resorbiert (Crabo u.

Gustafsson, 1964), bei der Ratte jedoch nur 50 % (Levine u. Marsh, 1971).

Das Epithel des Nebenhodens ist zur Aufnahme kleinerer partikulärer Bestandteile in der Lage. Dies konnte anhand eines unspezifischen Markers (Eisen, Meerettichperoxidase) gezeigt werden, der nach Injektion ins Lumen durch Endozytose vom Nebenhodenepithel aufgenommen wurde. Daneben ist das Epithel des Nebenhodens auch zur aktiven Sekretion von Ionen, kleineren organischen Molekülen, Proteinen sowie Glykoproteinen in der Lage (Robaire u. Hermo, 1988). Mit ß-adrenergen Agonisten konnte das Epithel zur Chlorid und Bicarbonat Sekretion sowie zur Peptid-Hormon-Bildung stimuliert werden (Wong et al., 1992). Von den Ductuli efferentes zum Caput epididymidis konnten Levine u. Marsh (1971) eine sinkende Chlorid-Ionen-Konzentration nachweisen. Gleiches gilt auch für die Natrium- Konzentration vom Caput zur Cauda. Die Kalium-Konzentration steigt in diesem Bereich hingegen an.

Zu den organischen Sekretionsprodukten des Nebenhodens gehören Glyzerophosphocholin, Carnitin und Inositol. Cooper u. Yeung (1996) konnten bei Ratten zeigen, dass die Hemmung einer im Nebenhoden sezernierten neutralen α -Glukosidase zu einer Unterdrückung der Fertilität führt.

Vom Nebenhoden wird auch eine Vielzahl von Proteinen sezerniert. Diese zeichnen sich durch ein geringes molekulares Gewicht sowie durch einen hohen Glykosylierungsgrad aus (Kirchhoff u. Ivell, 1995). Die Genexpression dieser Proteine ist auf bestimmte Nebenhodenabschnitte begrenzt (Krull et al., 1993; Cooper, 1998; Dacheux et al., 1998;

Kirchhoff, 1999). Sie können sowohl speziesspezifisch sein (Kirchhoff et al., 1998) als auch eine speziesübergreifende Verteilung zeigen (Syntin, 1996). Homologien zu Genprodukten anderer Gewebe und zu anderen Spezies lassen Rückschlüsse auf mögliche Funktionen zu (Holland u. Nixon, 1998).

Zwischen Proteinen und Spermien kommt es nach apikaler Freisetzung ins Lumen des Nebenhodenkanals zu Wechselwirkungen. So binden einige Proteine über ionische Wechselwirkung an Membranen (Jones, 1989), andere können in Membranen integriert sein oder über so genannte GPI-Anker (Glykosylphosphatidyl-Inositol-Anker) fest in diese verankert sein (Moore et al., 1989; Kirchhoff u. Hale, 1996). In jedem Fall lösen sie eine Umstrukturierung der Spermienoberfläche aus (Kirchhoff u. Ivell, 1995). Obwohl die Zusammenhänge noch nicht vollständig geklärt sind, geht man davon aus, dass diese Sekretproteine für die Reifung und Speicherung der Spermien unerlässlich sind. Dabei scheint es eine wichtige Rolle zu spielen, in welcher Reihenfolge diese mit den Spermien in Kontakt treten.

Die Regulation der Nebenhodenfunktionen erfolgt durch intrinsische und extrinsische Faktoren (Chan et al, 1997). Eine bedeutende Rolle spielen hier androgene Hormone, vor allem 5α -Dihydrotestosteron, die zum einen über das Blut zum anderen über das Rete testis in den Nebenhoden gelangen. Die Konzentration an Androgenen im Rete testis, in der luminalen Flüssigkeit des Nebenhodens und in der Vena testicularis ist im Vergleich zum peripheren Blutkreislauf deutlich höher (Brooks, 1990; Setchell et al., 1994).

Zu den durch Androgene regulierten Funktionen des Nebenhodens gehören Wachstums- und Differenzierungsvorgänge, Transportmechanismen durch das Nebenhodenepithel, sowie die Synthese und luminale Sekretion von nebenhodenspezifischen Proteinen (Cameo u. Blaquier, 1976; Brooks, 1983; Brooks et al., 1986a, 1986b). Auch metabolische Vorgänge innerhalb des Nebenhodens werden durch Androgene kontrolliert. So wird ein Milieu im Lumen des Nebenhodenkanals gewährleistet, das optimal für die Spermienreifung und Speicherung ist.

Fehlen Androgene, so ist eine Reifung der Spermien nicht möglich (Orgebin-Christ, 1996).

Auch die gewebespezifische Genexpression im Nebenhoden wird durch Androgene kontrolliert. Dabei ist die Androgenabhängigkeit regionenspezifisch unterschiedlich (zusammengefasst in Kirchhoff, 1999). Neben Androgenen konnten auch Östrogene in hoher Konzentration im Rete testis und im proximalen Bereich des Nebenhodens nachgewiesen werden (Ganjam u. Amann, 1976; Free u. Jaffe, 1979). Östrogene sind für die Rückresorption testikulärer Flüssigkeit im Nebenhodenkopf verantwortlich und regulieren die Spermienkonzentration im Nebenhoden (Hess et al., 1997).

Die Absorptions- und Sekretionsprozesse werden negativ durch Temperaturerhöhungen beeinträchtigt. So kommt es dabei zu einer veränderten Zusammensetzung des intraluminalen Milieus (Bedford, 1991). Auch die Expressionsrate einiger epididymaler Sekretproteine wird durch eine Erhöhung der Temperatur beeinträchtigt (Pera et al., 1996).

2.4.1.4. Beitrag der akzessorischen Geschlechtsdrüsen zum Seminalplasma

Das Seminalplasma wird als flüssiger, spermienfreier Anteil des Ejakulates definiert. Es wird zu unterschiedlichen Anteilen von Hoden, Nebenhoden, Samenleiter und der akzessorischen Geschlechtsdrüsen gebildet. Entsprechend der speziesspezifischen Ausprägung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen variiert die Zusammensetzung des Seminalplasmas bei den verschiedenen Tierarten. Das Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen stellt die mengenmäßig größte Fraktion des Seminalplasmas (Setchel, 1994). Seminalplasmaproteine, die bereits im Seminalplasma an die Spermienoberfläche binden, treten mit dem Epithel des Oviduktes in Kontakt, um dort ein Spermienreservoir zu bilden (Suarez et al., 1998; Lefebvre et al., 1997). Kapazitierte Spermien sind zu dieser Bindung nicht mehr in der Lage (Suarez et al., 1998; Revah et al., 2000). Mehrere Hinweise lassen die Vermutung zu, dass es sich bei diesem Protein um ein Produkt der akzessorischen Geschlechtsdrüsen handelt (Revah et al., 2000). In diesem Zusammenhang konnte PDC-109 isoliert werden, eines der drei am häufigsten vorkommenden Proteine des bovinen Seminalplasmas. Bei den zwei anderen handelt es sich um BSP-A3 und BSP-30K. Das PDC-109 besteht aus einer Mischung aus BSP-A1 und BSP-A2, die sich nur in ihrer Glykosylierung unterscheiden (Calvete et al., 1994; Gerwig et al., 1996). BSP-A1 ist in einer glykosylierten, BSP-A2 ist in einer nicht glykosylierten Form zu finden. PDC-109 gehört mittlerweile zu den gut untersuchten Seminalplasmaproteinen. So wird ihm eine regulative Rolle während der Kapazitation

zugeschrieben (Therien et al., 1995). Großer Wert wird dabei auf seine Funktion bei der Befruchtung gelegt. So geht man davon aus, dass PDC-109 während der Ejakulation über Phospholipide auf der Plasmamembran der Spermienzelle an diese bindet. Während der darauf folgenden Kapazitation lösen sich einige PDC-109-Proteine wieder von der Plasmamembran (Calvete et al., 1994), was anscheinend dazu führt, dass sich endogene Lipide, vor allem Phosphatidylcholin und Cholesterin, aus der Plasmamembran lösen. Dies führt zu einem Cholesterin-Efflux aus der Spermienmembran und dadurch bedingt zu einer Destabilisierung der Membran im Sinne einer erhöhten Membranfluidität (Greube et al., 2001; Müller et al., 2002; Therien et al., 1998; Töpfer-Petersen et al., 1998).

2.4.2. Seminalplasmaproteine

2.4.2.1. Zusammensetzung des Seminalplasmas

Das Seminalplasma besteht aus verschiedenen Komponenten, wie Ionen, niedermolekularen organischen Substanzen und Proteinen, wobei die Zusammensetzung und das Volumen speziesspezifisch sind. Auch ist die Zusammensetzung sowohl individuellen, jahreszeitlichen und hormonell bedingten Schwankungen unterworfen (Mann und Lutwack-Mann, 1981). Die im Seminalplasma enthaltenen speziesspezifischen Proteine treten mit den Spermien in einer tierartlich vorgegebenen räumlichen und zeitlichen Abfolge während der Ejakulation in direkten Kontakt und beeinflussen das Befruchtungsgeschehen im weiblichen Genitale (Töpfer-Petersen et al., 1998b). Diese Proteine sind an Prozessen wie Kapazitation, Akrosomenreaktion und Fusion der Spermienzelle mit der Eizelle beteiligt (Bedford, 1983).

Aufgrund struktureller Eigenschaften konnten drei Proteinfamilien charakterisiert und näher untersucht werden (siehe unten). Dazu zählen die zuerst bei Ratte und Maus beschriebenen sogenannten CRISP-Proteine (Brooks et al., 1996a; Haendler et al., 1993; Eberspaecher et al., 1995; Cohen et al., 1996; Krätzschmar et al., 1996), die vor allem beim Schwein vorkommenden Spermadhesine (Reinert et al., 1997; Töpfer-Petersen et al., 1998a) und die bovinen und equinen Fn2-Domänen-Proteine (Töpfer-Petersen et al., 1995). Ansonsten dient das Seminalplasma dem Schutz, Transport und der Ernährung der Spermien.

2.4.2.2. CRISP-Proteine

Diese erstmals im Genitaltrakt männlicher Nager nachgewiesenen Proteine gehören zu einer evolutionär konservierten Proteinfamilie. Sie verdanken ihren Namen dem hohen Gehalt an Cysteinen im C-terminalen Bereich und werden daher als Cysteine-Rich Secretory Proteins 1- 3 (CRISP 1-3) bezeichnet (Haendler et al., 1993). CRISP-Proteine sind bei allen Säugern zu finden (Kasahara et al., 1989; Haendler et al., 1993; Hayashi et al., 1996; Krätzschmar et al., 1996).

Zu der Familie der CRISP-Proteine gehören drei saure Glykoproteine, AEG-1, AEG-2 (Acidic Epididymal Glycoprotein 1/2) und TPX-1 (Testis Specific Protein), welche sich durch 16 konservierte Cystein Reste an ihrem C-Terminus auszeichnen. Hauptexpressionsort für die CRISP-Proteine ist der männliche Genitaltrakt. Ihnen wird eine wichtige Rolle bei den Wechselbeziehungen zwischen Spermien und anderen Zellen zugeschrieben, vor allem während der Spermienreifung und Fertilisation. Das CRISP-1 Protein ist androgenreguliert und wahrscheinlich das murine Orthologe des bei der Ratte nachgewiesenen Glykoproteins DE/AEG. Eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem an Rattenspermien gebundenen Glykoprotein DE/AEG und dem im Nebenhoden der Maus nachgewiesenen CRISP-1 Protein hat das equine Seminalplasmaprotein HSP-3 (Calvete et al., 1994). Laut Schambony et al.

(1998), gehört es ebenfalls zur Familie der CRISP-Proteine. Untersuchungen zeigten eine Bindung von HSP-3 an den postakrosomalen und äquatorialen Bereich des Spermienkopfes sowie an das Mittelstück (Schambony et al., 1998) was auf Funktionen bei der posttestikulären Spermienreifung und der Bindung des Spermiums an die Zona-pellucida schließen lässt. Beim Pferd findet die Transkription und Expression in der Speicheldrüse, Samenleiterampulle und in den Seminalvesikeln statt. Im Gegensatz zu den anderen Säugetieren findet die Synthese des equinen CRISP-3 Proteins hauptsächlich in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen statt.

2.4.2.3.

Spermadhesine werden vor allem im Nebenhoden und in der Samenblase gebildet und binden während der Ejakulation an die Spermienoberfläche (Calvete et al., 1994b, 1994d).

Spermadhesine, die zur Familie der Heparin-bindenden Proteine gehören, wurden im Seminalplasma des Ebers charakterisiert. Die Primärstruktur von Spermadhesinen konnte

beim Eber gefunden werden (aSFP (acidic seminal fluid protein), PSP-I/II, AQN 1, AQN3, AWN (die Kennzeichnung erfolgt in Anlehnung an die Aminosäuresequenz)) (Sanz et al., 1991, 1992a, 1992b; Kwok et al., 1993; Calvete et al., 1997). Sie bestehen aus 109-133 Aminosäuren, enthalten zwei konservierte Disulfidbrücken und stimmen in ihrer Aminosäuresequenz zu 40-60 % überein. Lokalisiert sind sie auf der Spermienoberfläche (Töpfer-Petersen et al., 1995). Dort nehmen sie an unterschiedlichen Wechselwirkungen mit Bestandteilen der Zona-pellucida teil oder interagieren mit Substanzen in der natürlichen Umgebung der beiden Gameten. Die Fähigkeit an Heparin, Rezeptoren der Zona-pellucida und an Protease-Inhibitoren zu binden legt die Vermutung nahe, dass Spermadhesine an der Kapazitation und/oder an der Bindung des Spermiums an die Zona-pellucida beteiligt sind (Sanz et al., 1992a, 1992b; Töpfer-Petersen et al., 1995). Ihre Bindung an Heparin und an die Zona-pellucida ist dabei von dem Grad ihrer Glykosylierung abhängig (Calvete et al., 1993).

Spermadhesine der AWN-Familie werden im Rete testis und in den Tubuli recti des Hodens sezerniert (Sinowatz et al., 1995). Im Seminalplasma des Bullen konnte ein saures Protein isoliert werden (acidic seminal fluid protein, aSFP), das eine 43 %tige Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz der porcinen Spermadhesine aufweist (Wempe et al., 1992). Dieses ist nur locker an die Spermienoberfläche gebunden und löst sich während der Kapazitation leicht wieder von dieser ab (Dostalova et al., 1994). Ein im Seminalplasma des Hengstes isoliertes Protein (HSP-7) ist zu 98 % identisch mit dem beim Eber isolierten Spermadhesin AWN, welches an die Zona-pellucida bindet (Calvete et al., 1994a). Trotz ihrer strukturellen und funktionellen Ähnlichkeit unterscheiden sie sich beträchtlich in ihrer Lage auf der Oberfläche des Spermiums (Reinert et al., 1996). Kürzlich konnte auch beim Hirsch (Capra hircus) ein Seminalplasmaprotein isoliert werden, welches eine strukturelle Homologie zu den Spermadhesinen von Eber und Hengst aufweist (Teixeira et al., 2002).

Die beim Hengst und Eber isolierten homologen Proteine werden an unterschiedlichen Orten im männlichen Genitaltrakt sezerniert und binden an unterschiedlichen Bereichen des Spermiums. So bindet das beim Hengst isolierte HSP-7 ausschließlich im Bereich des äqualitorialen Segmentes des Spermiums, während dessen das AWN des Ebers im Bereich des gesamten Akrosoms vorkommt. Der unterschiedliche zelluläre Ursprung und die unterschiedliche Verteilung der Spermadhesine auf der Spermienoberfläche bei den verschiedenen Tierarten lässt eine speziesspezifische Funktion bei der Fertilisation strukturell verwandter Proteine vermuten.

2.4.2.4. Fibronektin-TypII(Fn2)-Domänen-Proteine

Die Fibronektin-TypII(Fn2)-Domänen-Proteine des Seminalplasmas gehören zu den so genannten Heparin-bindenden Proteinen. Dabei handelt es sich vorwiegend um niedermolekulare Proteine, die höhermolekulare Multimere bilden können (Calvete et al., 1994; Töpfer-Petersen et al., 1998b). Die Fn2-Domäne ist Bestandteil strukturell sehr verschiedener Proteinfamilien. Fn2-Domänen-Proteine bilden bei Hengst und Bulle einen Hauptbestandteil der Seminalplasma-Proteine. Der Name beschreibt die große Ähnlichkeit zu den TypII Strukturen der Gelatin- und Heparin-bindenden Domäne des Fibronektins (Seidah et al., 1987; Constantine et al.,1992; Töpfer-Petersen et al., 1998). Die einzelne Fn2-Domäne ist durch eine bestimmte Anzahl von invarianten Aminosäuren einschließlich zweier Disulfidbrücken charakterisiert, die in einer definierten Abfolge aufeinander folgen (Cx2PFx8-9WCx12-14C) (Constantine et al., 1992).

Die Fn2-Domänen-Proteine des Seminalplasmas der verschiedenen Säugerspezies unterscheiden sich durch die Zahl ihrer Fn2-Domänen, durch die Länge der N-Termini und durch den Grad ihrer Glykosylierung (Calvete et al., 1996).

Bei Rind (bovine seminal protein, BSP-A1/2 (PDC-109), BSP-A3 und BSP-30K) und Pferd (horse seminal protein, HSP-1/2) machen sie einen Gesamtproteinanteil am Seminalplasma von über 60 % aus (Salois et al., 1999; Calvete et al., 1994).

Die Fähigkeit der BSPs an Heparin zu binden, ist anscheinend abhängig von ihrer Konformation und der Bildung von Multimeren. So können nur Multimere von mindestens vier PDC-109 (BSP-A1/2) Molekülen Heparin binden (Calvete et al., 1999). Calvete et al.

(1999) konnte zeigen, dass an der Heparin-Bindung von PDC-109 vor allem sechs basische Aminosäuren beteiligt sind, die sich zu einem „Cluster“ zusammenlagern.

Heparin bzw. heparinähnliche Glykosaminoglykane werden besonders während der Follikel- Phase im weiblichen Genitale gebildet (Calvete et al., 1995b). In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Heparin oder heparinähnlichen Glykosaminoglykanen an die Spermien einen stimulierenden Einfluss auf die Kapazitation hat (Handrow, 1982;

Lenz et al., 1982, 1983; Lee et al., 1985). Bovine Seminalplasmaproteine bewirken eine Zunahme der Bindungsstellen für Heparin auf der Spermienoberfläche und potenzieren so die Heparin-induzierte Kapazitation der bovinen Spermien (Chandonnet et al., 1990; Therien et al., 1995).

Neben der Fähigkeit an Heparin bzw. heparinähnlichen Glykosaminoglykanen zu binden, sind sie auch in der Lage, eine spezifische Bindung mit High-Density Lipoproteinen (HDL) und

mit Phospholipiden einzugehen, die eine Phosphorylcholingruppe besitzen (Desnoyers u.

Manjunath, 1992; Gasset et al., 1997). Ebenso wie die Heparinbindung der BSPs spielt die Bindung an HDL eine Rolle bei der Kapazitation, die dadurch potenziert wird. Über phosphocholinhaltige Phospholipide erfolgt die Bindung an die Spermienoberfläche (Desnoyer u. Manjunath, 1992; Manjunath et al., 1994). Diese direkte Bindung an die der Spermienoberfläche führt zu einem primären Cholesterin/Phospholipid Efflux, der eine Veränderung der Membranstruktur zur Folge hat. In vivo wird dies als Beginn der Kapazitation gedeutet (Müller et al., 2002; Therien et al., 1998, 1999; Moreau et al., 1999a, b). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass PDC-109 (BSP-A1/2) als Rezeptor an der Bindung an das Ovidukt-Epithel und somit an der Bildung eines funktionellen Spermienreservoires beteiligt ist (Gwathmey et al., 2003). Dabei binden der Spermien über Oberflächenlektine an Kohlenhydratstrukturen des Ovidukt-Epithels (Suarez, 2001; Töpfer- Petersen et al., 2002).

Ähnliche Proteine wurden auch bei anderen Huftieren gefunden, darunter die equinen Seminalplasmaproteine HSP-1 und HSP-2 (horse seminal plasma proteins), die zwar auch zur Heparin-Bindung in der Lage sind, jedoch in einem geringeren Ausmaß. Auch scheint die Immobilisierung und Lipidextraktion aus der Spermienmembran deutlich niedriger (Greube et al., 2003 in Vorbereitung). HSP-1 und HSP-2 unterscheiden sich ebenfalls in dem Grad ihrer Glykosylierung und der Länge ihrer N-terminalen Bereiche (Calvete et al., 1995). Eine Oligomerisierung von HSP-1 mit HSP-2, ähnlich wie bei PDC-109, ist die Voraussetzung zur Bindung von Heparin. Allerdings ist nur eine der beiden Glykoformen von HSP-1 zur Bildung von Oligomeren in der Lage (Calvete et al., 1995a).

Auch das aus dem Seminalplasma des Ebers isolierte porcine homologe Protein (pB1) besitzt zwei Fn2-Domänen. Es weist eine 60-65 %tige Sequenzübereinstimmung zu den equinen und bovinen Seminalplasmaproteinen auf und verfügt ebenso wie diese über die Fähigkeit an Heparin und Phosphorylcholin zu binden (Calvete et al., 1997). Im Gegensatz zu diesen kommt pB1 jedoch in einer vergleichsweise geringen Menge im Seminalplasma vor (Calvete et al., 1997; Plucienniczak et al., 1999). Im Unterschied zu den bovinen und equinen Homologen die Homo-Oligomere bilden, bildet pB1 einen heteromeren Komplex mit einem Spermadhesin, dem AQN-1.

Anhand ihrer Sequenzähnlichkeit mit den BSPs konnte erst kürzlich im dem Seminalplasma der Ziege vier weitere Vertreter dieser Proteine nachgewiesen werden. Diese als GSP-20 und GSP-22 (Goat Seminal plasma Protein) bezeichneten Proteinen sind ebenfalls zur Bindung an Heparin in der Lage (Villemure et al., 2003).

Die Produktion der einzelnen Vertreter dieser Proteinfamilie findet posttestikulär in unterschiedlichen Regionen des männlichen Genitaltraktes statt. Dadurch bedingt treten diese zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit den Spermien bzw. mit der Spermienoberfläche in Kontakt (Töpfer-Petersen et al., 1995).

Kürzlich konnte beim Menschen das sog. Humane-Epididymis-Protein-12 (HE12), ein weiteres hochkonserviertes Fn2-Domänen-Protein kloniert werden, welches im Gegensatz zu den HSPs und BSPs vor allem im Corpus-Bereich des Nebenhodens synthetisiert wird (Saalmann et al., 2001). Dieses neuartige Protein zeichnet sich im Gegensatz zu den Fn2- Domänen-Proteinen der Huftiere durch vier tandemartig hintereinander angeordnete Fn2- Domänen aus, jedoch nur die beiden Ersten zeigen eine deutliche Übereinstimmung (50-60 % Aminosäureidentität) mit den Fn2-Domänen der BSPs und HSPs. Dagegen sind die beiden anderen eher den Fn2-Domänen der Gelatinasen bzw. dem Hagemann-Faktor ähnlich.

Eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Heparin-bindenden Proteinen aus dem Seminalplasma der Huftiere (PDC-109, HSP-1, HSP-2 und pB1) weisen auch die HE12-homologen CE12 Proteine des Hundes auf (Münz, et al., 2001). Diese verfügen ebenfalls über vier tandemartig hintereinander geschaltete Fn2-Domänen, von denen auch die ersten beiden den Domänen der Seminalplasmaproteine der Huftiere signifikant ähneln (Desnoyers u. Manjunath, 1992;

Calvete et al., 1995, 1996, 1997).

Eine partielle beim Schwein klonierte cDNA scheint zu 85 % mit der von HE12 überein zu stimmen (Schäfer, persönliche Mitteilung).

Der Ort der Synthese der Fn2-Domänen-Proteinen des Seminalplasmas variiert speziesspezifisch. So werden die BSP-Proteine des Rindes überwiegend von der Samenblase sezerniert und binden während der Ejakulation an Phospholipide der Spermienplasmamembran (Desnoyer u. Manjunath, 1992; Manjunath et al., 1994). Der Hauptort der Sekretion von HSP-1 und -2 ist die Ampulle. HSP-1 konnte jedoch schon an Spermien aus dem distalen Nebenhodenkörper, am Akrosom und Mittelstück, nachgewiesen werden (Töpfer-Petersen et al., 1998). Der Produktionsort der Schweine- und Ziegen- homologen Proteine ist bislang noch nicht bekannt.

2.5. Abläufe im weiblichen Genitale 2.5.1. Kapazitation

Nach der posttestikulären Reifung im Nebenhoden durchlaufen ejakulierte Spermien im weiblichen Genitale einen weiteren Reifungsprozess, der als Kapazitation bezeichnet wird (Yanagimachi, 1994). Während der Ejakulation kommen die Spermien mit bestimmten Komponenten des Seminalplasmas in Kontakt, die durch eine Maskierung von Oberflächenstrukturen eine vorzeitige Kapazitation verhindern. Mit dem Verlust dieser schützenden Oberflächenproteine, den sogenannten Dekapazitationsfaktoren, beginnt die Kapazitation. Bedingt durch einen Cholesterin-Efflux aus der Plasmamembran der Spermien kommt es zu einem Absinken des Cholesterin-Phospholipid-Verhältnisses. Die Folge ist eine Destabilisierung und Umgruppierung von Membranstrukturen (Töpfer-Petersen et al., 1998).

Mittlerweile haben sich viele Studien mit der Identifizierung Cholesterin-reduzierender Faktoren im weiblichen Geschlechtstrakt beschäftigt. So konnten Albumin und das High- Density-Lipoprotein als Cholesterin-Akzeptoren charakterisiert werden (Ehrenwald et al., 1990). Therien und Mitarbeiter (1997) konnten in in vitro Versuchen HDL als einen der Auslöser der Kapazitation identifizieren und gleichzeitig eine beschleunigende Wirkung der Seminalplasmaproteinen auf die Kapazitation nachweisen.

Heparin hat einen stimulierenden Effekt auf die in vitro Kapazitation, der über heparinbindende Proteine im Seminalplasma vermittelt wird (Parrish et al., 1988; Thèrien et al., 1995). Heparinähnliche Glykosaminoglykane lassen sich zyklusabhängig im weiblichen Genitale nachweisen und haben regulierende Bedeutung für die Kapazitation in-vivo (Miller et al., 1990; Töpfer-Petersen et al., 1998a).

Desweiteren kommt es im Verlauf der Kapazitation zu einem vermehrten Einstrom von Kalzium, zu einem Anstieg des intrazellulären pH-Wertes und zu einer veränderten Membranspannung.

Der Ort der Kapazitation ist speziesspezifisch unterschiedlich und liegt bei Uterusbesamern aller Wahrscheinlichkeit nach im caudalen Isthmus-Bereich des Oviduktes, wo die Spermien bis zur Befruchtung gespeichert werden. Bei Vaginalbesamern sind erste Veränderungen der Spermienmembran bereits im Verlauf der Zervixpassage zu beobachten (Yanagimachi, 1994;

Töpfer-Petersen et al., 1998b). Im Bereich des Oviduktes kommt es auch zur Bildung eines Spermienreservoires (Hunter, 1988; Lefebvre et al., 1995). Derartige Reservoire konnten bei Rind, Pferd, Schweinen, Mäusen, Hamstern und Schafen gefunden werden (Lefebvre et al., 1995; Suarez, 1987; Smith u. Yanagimachi, 1991). Man nimmt an, dass es mehrere

Funktionen für die Bildung dieser Reservoire gibt. Sie dienen dazu die Befruchtungsfähigkeit der Spermien zwischen dem Zeitpunkt der Insemination und der Ovulation zu erhalten (Pollard et al., 1991; Chian u. Sirad, 1994) und um den zeitlichen Ablauf der Kapazitation zu steuern bzw. zu gewährleisten (Chian et al., 1995).

Ein Fucose-bindendes Protein konnte aus bovinem Seminalplasma und Spermien isoliert werden (Ignotz et al., 2001). Dabei handelt es sich sehr wahrscheinlich um das PDC-109, das als Rezeptor für das Ovidukt-Epithel fungiert und somit direkt an der Bindung der Spermien beteiligt ist (Gwathmey et al. 2003). Für die Bindung an Epithelzellen des Oviduktes ist ein Erkennen der Fucose-Bindungsstellen nötig. Dieses wird durch Ca²⁺-abhängige Oberflächenlektine vermittelt, die mit der Spermienmembran assoziiert sind (Suarez et al., 1998; Lefevbre et al., 1997).

Durch in vitro Versuche konnte gezeigt werden, dass die Kapazitation ein temperaturabhängiger, nicht speziesspezifischer Prozess ist (Yanagimachi, 1994). Dass laut Yanagimachi (1994) der Vorgang der Kapazitation auch in vitro ablaufen kann, vorausgesetzt die verwendeten Medien entsprechen den natürlichen Bedingungen im weiblichen Genitale, hat sich in vielen Studien bestätigt. Die Kapazitation ist Vorraussetung für die Akrosomenreaktion. So können nur kapazitierte Spermien an die Zona-pellucida binden und die Akrosomenreaktion vollziehen (Yanagimachi, 1994).

Die von Bielfeld et al. (1994) aufgestellte Behauptung, dass humane Spermien in vitro die Akrosomenreaktion durchlaufen ohne zuvor kapazitiert zu sein, konnte durch Cohen-Dagay et al. (unveröffentliche Daten) ebenfalls in vitro, wiederlegt werden. Sie zeigten ebenfalls, dass die Lebensdauer der Spermien durch den Prozess der Kapazitation nicht verlängert wird sondern mit 1-4 Stunden eher kurz ist.

2.5.2. Akrosomenreaktion

Nach dem Wegfall der Dekapazitationsfaktoren kommt es zur Akrosomenreaktion und somit Aktivierung der akrosomalen Enzyme. Während der Akrosomenreaktion fusioniert die äußere Akrosomenmembran mit dem darüber liegenden Plasmalemma des Spermienkopfes. So entstehen Poren, durch die die im Spermienakrosom gespeicherten lytischen Enzyme (Hyaluronidase und Proteasen) freigesetzt werden. Die trypsinähnliche Protease Akrosin ermöglicht die Proteolyse der Glykoproteine der Zona-pellucida. Durch die Hyaluronidase wird der von den Cummuluszellen gebildete Schutzwall aus Hyaluronsäure durchbrochen.

Dies ermöglicht es dem Spermium, die Zona-pellucida zu penetrieren und mit der Vitellinmembran der Eizelle zu verschmelzen (Yanagimachi, 1994). Auslöser für die Akrosomenreaktion ist der Kontakt des kapazitierten Spermiums mit der Zona-pellucida der Eizelle. Bei der Zona-pellucida handelt es sich um eine Schicht von Glykoproteinen, von der die Eizelle umgeben ist. Exponierte Kohlenhydratseitenketten der Zona-pellucida ermöglichen die Bindung von Spermien über komplementäre Rezeptoren (Zona-pellucida- bindende Proteine), die sich auf der Spermienoberfläche befinden (Töpfer-Petersen et al., 1998). Das Zona-pellucida-Protein 3 (ZP3), eines der Glykoproteine in der Zona-Pellucida, ist in der Lage, sich mit einem der komplementären Oberflächenrezeptoren des Spermiums zu verbinden und so die Akrosomenreaktion auszulösen (Cohen-Dagay u. Eisenbach, 1994;

Wassarman u. Litscher, 1995). Da die Protease Akrosin auch an Kohlenhydrate bindet, wird auch eine Beteiligung an der Bindung des Spermiums an die Zona-pellucida postuliert (Töpfer-Petersen u. Henschen, 1987, 1988). Bei der Akrosomenreaktion handelt es sich um einen exocytotischen Prozess, der durch einen Kalzium-Influx, eine Steigerung des intrazellulären pH-Wertes sowie eine Zunahme an zyklischem AMP gekennzeichnet ist (Yanagimachi, 1994; Fraser, 1995; Storey, 1995). Glykosaminoglykane wie Heparin, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat können in vitro die Akrosomenreaktion auslösen (Kopf u. Gerton, 1991; Varner et al., 1993).

3. Fragestellung und Ziele

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der molekularen Klonierung und Charakterisierung der Fn2-Domänen-Proteine aus dem Seminalplasma der Huftiere.

Ziel dieser Arbeit war zum einen, die vollständige molekulare Klonierung der equinen Fn2- Domänen-Proteine, der sog. HSPs auf Nukleinsäureebene und der Vergleich der erhaltenen cDNA-Sequenzen mit den bereits bekannten HSP-1 und HSP-2-Protein Sequenzen von Calvete et al., 1995. Eine umfassende Charakterisierung dieser Fn2-Domänen-Proteine ist die Grundlage dafür, die Unterschiede in ihrer Struktur hinsichtlich ihrer Funktion analysieren zu können.

Zum anderen sollte zur Vorbereitung der rekombinanten Expression der Proteine in Insektenzellen Plasmid-Konstrukte hergestellt werden, welche nur die für das reife Protein kodierende cDNA-Sequenz enthalten sollte. Diese Konstrukte dienen der Subklonierung in ein Baculo-Virus-System, welches die rekombinante Expression in Insektenzellen ermöglicht.

So können große Mengen an reinem Protein hergestellt werden, die anschließend in in vitro Untersuchungen zur Verfügung zu stehen.

4. Material und Methoden 4.1. Material

4.1.1. Gewebe und RNA-Extrakte

Für diese Arbeit wurde equine RNA männlicher Geschlechtsorgane verwendet, die aus dem Hoden, dem Nebenhoden, der Samenleiterampulle sowie dem Samenleiter stammte. Die Gesamt-RNAs wurden teilweise bereits vom IHF zur Verfügung gestellt.

Zur Verwendung kam auch bovine RNA aus dem männlichen Geschlechtstrakt eines geschlechtsreifen Bullen (Hoden, Nebenhoden, akzessorische Geschlechtsdrüsen) sowie aus Kontrollgeweben weiblicher Geschlechtsorgane (Uterus, Ovar, Corpus luteum) und ausgewählten somatischen Organsystemen (Lunge, Niere, Milz, Schilddrüse, Gehirn) der gleichen Spezies.

Die Rindergewebeproben wurden unmittelbar nach der kommerziellen Schlachtung eines adulten Bullen entnommen und zur RNA-Extraktion verwendet.

Die verschiedenen Organproben wurden präparatorisch isoliert, in Eppendorfreaktionsgefäße überführt und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Größe der Gewebestücke lag zwischen 0,5 und 1 g. Die Entnahme der Kontrollgewebe erfolgte auf gleiche Weise. Alle Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert.

4.2. Methoden

4.2.1. RNA-Extraktion aus Geweben

Bei der Extraktion von Gesamt-RNA wird die zelluläre RNA von umgebenden Zellkomponenten getrennt und die ubiquitär vorhandenen RNasen gleichzeitig inaktiviert.

Die bei -80°C gelagerten bovinen Gewebeproben wurden in Alufolie gewickelt, gewogen und mit einem Hammer grob zerkleinert. Um einer Erwärmung der Proben und daraus resultierender RNA-Degradation vorzubeugen, wurden die Proben in kurzen Zeitabständen wiederholt in flüssigen Stickstoff getaucht. Die zerkleinerten Proben wurden in vorgekühlte Teflon-Gefäße überführt und im Mikro-Dismembrator (B. Braun, Biotech International, Melsungen) bei 1800 UpM zweimal je 50 Sekunden pulverisiert. Das pulverisierte Gewebe wurde in einer adequaten Menge peqGOLD RNAPureTM Lösung (peqlab, Biotechnologie GmbH, Erlangen) suspendiert (2 ml Lösung je 100 mg Gewebe) und durch sofortiges

vortexen homogenisiert. Dies bewirkt die Lyse der Zellen. Das Homogenat wurde auf Eis mit Chloroform versetzt (im Volumenverhältnis 1:10), kurz und kräftig geschüttelt und 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugieren, 60 Minuten bei 4°C und 4000 UpM, wurde die Probe in drei Phasen getrennt: eine untere Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und die obere wässrige Phase. Nur in der wässrigen Phase ist die RNA enthalten.

DNA und Proteine finden sich in den beiden anderen Phasen. Die wässrige Phase wurde vorsichtig abpipettiert und in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt. Zur Fällung der RNA (RNA-Präzipitation) wurde das gleiche Volumen an eiskaltem Isopropanol zugegeben und geschüttelt. Der Ansatz wurde 15 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend erneut 60 Minuten bei 4000 UpM und 4°C zentrifugiert (Megafuge 2.0 R; Heraeus, Osterode). Der Isopropanolüberstand wurde verworfen und das verbleibende Pellet mit der darin enthaltenen RNA 3x je 15 Minuten bei 4000 UpM und 4°C mit jeweils 1ml 70 %igem Ethanol gewaschen, um Phenol-Chloroform-Reste zu entfernen. Das gewaschene Pellet wurde nach Verwerfen des Überstandes in einer adequaten Menge H₂O in PCR-Qualität gelöst. Die RNA- Extrakte wurden bis zur Konzentrationsbestimmung (siehe unten, 5.2.6.) in Eppendorf-Tubes bei -80°C aufbewahrt.

4.2.2. Herstellung von cDNA durch Reverse Transkription

Ein Enzym, die Reverse Transkriptase, ist in der Lage, labile mRNA-Moleküle in stabilere DNA umzuschreiben. Es entstehen DNA-Kopien, die komplementär zur Ausgangs-RNA sind.

Diese werden als cDNA (engl.: copy oder complementary DNA) bezeichnet. Der Reaktionsansatz begann mit der Denaturierung der RNA, so dass die Sekundärstruktur aufschmelzen und Einzelstränge entstehen. Um mit der Synthese der cDNA beginnen zu können, benötigt das Enzym Reverse Transkriptase (RT) ein kurzes Stück doppelsträngige Nukleinsäure. Zu diesem Zweck wurden dem Reaktionsgemisch Oligonukleotide aus Desoxythymidin-Nukleotiden (OligodT), hinzugefügt. Diese hybridisieren mit den Poly(A)- Schwänzen der mRNA-Moleküle und bilden so die Startmoleküle für die cDNA-Synthese. So wird gewährleistet, dass nur polyadenylierte mRNA-Sequenzen in cDNA umgeschrieben werden. Die übrige Zell-RNA, größtenteils ribosomale RNA bleibt unberücksichtigt. Zur Herstellung der cDNA wurde hier die SuperScriptTM II Transkriptase (GIBCO BRL) verwendet. Für einen Reaktionsansatz von 20 µl wurden 5 µg Gesamt-RNA-Extrakt eingesetzt. Hinzugefügt wurden 1 µl Oligo(dT)-Primer (500 µg/ml) und aqua bidest. bis zu

einem Gesamtvolumen von 12 µl. Dieser Ansatz wurde 10 Minuten auf 70°C erhitzt. Dabei wird die Sekundärstruktur der RNA aufgelöst. Auf Eis wurden nacheinander folgende Reagentien hinzupipettiert: 4 µl eines 5x Erststrangpuffers (GIBCO BRL), 2 µl 0,1 M DTT (GIBCO BRL) und 1 µl des 10 mM dNTP-Mix (10 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP). Der Ansatz wurde vorsichtig gemischt und im Wasserbad bei 42°C für 2 Minuten inkubiert. 1 µl der SuperScriptTM II Transkriptase (200 U/µl) wurde hinzugefügt und erneut für 50 Minuten bei 42°C inkubiert. Um die ablaufende Reaktion zu stoppen und das Enzym zu deaktivieren, wurde der Reaktionsansatz auf 70°C erhitzt. Die in dieser Reaktion synthetisierte cDNA kann jetzt als Template in eine PCR eingesetzt werden (RT-PCR).

4.2.3. RT-PCR, Polymerase-Kettenreaktion

Prinzip:

Spezifische Fragmente eines DNA-Stranges können mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt (amplifiziert) werden. Wird durch reverse Transkription gewonnene cDNA in eine PCR eingesetzt, so spricht man in diesem Fall von einer RT-PCR. Dazu benötigt man neben den zu vervielfältigenden DNA-Strängen zwei Oligonukleotide (sog. Primer), ausreichende Mengen Desoxynukleosid-Triphosphate und eine thermostabile DNA- Polymerase, z.B. eine Taq-Polymerase. Zuerst wurde der DNA-Doppelstrang durch Erhitzen auf 95°C denaturiert. Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Strängen getrennt. Eine Einzelstrang-DNA entsteht. Die thermostabile Polymerase benötigt jedoch einen kurzen, doppelsträngigen DNA-Abschnitt, um die Synthese beginnen zu können.

Dazu wurden zwei kurze, ca. 20 Nukleotide umfassende Primer ausgewählt, die jeweils komplementär zu der Sequenz des zu vervielfältigenden DNA-Einzelstranges sind. Die Primer wurden so gewählt, dass sie an den Bereich der Einzelstrang-DNA angrenzen, der vervielfältigt werden sollte. Die Primer sollten eine annähernd gleiche Anzahl und Zusammensetzung an Nukleotiden haben, da sich anhand dieser die Temperatur errechnet, bei der die Primer an die Einzelstrang-DNA binden. Diese Temperatur wird als „Annealing“- Temperatur bezeichnet. Nach folgender Gleichung, die auch als „The Wallace rule“

(Sambrook, J. u. D. W. Russell, 2001) bezeichnet wird, errechnet sich die für die Primerpaare spezifische „Annealing“-Temperatur: Tm (in°C)= 2 (A+T) + 4 (G+C). Auf diese Temperatur wurde der Reaktionsansatz abgekühlt, um das Anlagern der Primer zu ermöglichen. Danach beginnt die Polymerase mit der Synthese der dazwischenliegenden DNA-Abschnitte. Die