Klonierung einer vollständigen HSP-1-kodierenden cDNA

Partielle HSP-1-kodierende Nukleinsäuresequenzen lagen zu Beginn der Arbeit bereits vor.

Diese beruhen auf der entsprechenden Aminosäuresequenz, die durch den sequentiellen Abbau des HSP-1 Proteins bekannt war (Calvete et al., 1995; accession # P81121). Dieses Verfahren, das als Edman-Abbau bezeichnet wird, ermöglichte es, in zyklischen Reaktionsprozessen von einem Ende der Peptidkette jeweils die N-terminale Aminosäure abzuspalten und zu identifizieren, um so schließlich die vollständige Aminosäuresequenz zu erhalten. Diese Aminosäuresequenz wurde anschließend in eine Nukleinsäuresequenz umgeschrieben (revers translatiert), die jedoch aufgrund der Varianz des genetischen Codes nur degeneriert sein konnte. Innerhalb der so ermittelten Nukleinsäuresequenz wählten Bellair et al. (1998) spezifische Primer, die möglichst weit am Ende des jeweiligen 5´- bzw. 3´-Endes des Proteins lagen, um einen größt möglichen Bereich der entsprechenden cDNA amplifizieren zu können. Da die hierzu anhand der Aminosäuresequenz ausgewählten Primer zwangsläufig innerhalb des Bereiches des offenen Leserasters liegen mussten, lag die Vermutung nahe, dass die ermittelte Sequenz noch nicht vollständig sein konnte und dass diese zur Absicherung der richtigen Sequenz noch einmal kloniert werden musste.

So bestand eines der Ziele der vorliegenden Arbeit darin, die schon bekannte cDNA Sequenz von HSP-1 zu überprüfen und diese mit Hilfe der Methode einer 5´Inversen PCR in 5´-Richtung zu vervollständigen.

Dazu wurden 5 µg Gesamt-RNA-Extrakt aus equinem Ampullengewebe bei der 5´Inversen PCR verwendet. Die Auswahl der verwendeten Primerpaare erfolgte anhand der bereits bekannten HSP-1-long-cDNA Sequenz wobei der HSP-1-long-Sense Primer an Position 332-350, der HSP-1-long-Antisense Primer an Position 267-286 und der cDNA Primer an Position 454-472 der Nukleinsäuresequenz lagen. Zur Überprüfung des Versuchsablaufes wurden je 9 µl der Ansätze auf ein 1 %iges Agarose Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

Bei dieser elektrophoretischen Auftrennung zeigte sich neben mehreren schwachen Banden der für eine 5´Inverse PCR typische „Schmier“, da viele Fragmente von unterschiedlicher Länge amplifiziert werden (Abb. 4). Daran anschließend erfolgte die Ligation der linearen PCR Fragmente in den pGEM-TEasy Vektor und die Transformation in gekaufte, kompetente

E. coli DH5α Zellen. Es wurden mehrere positive Kolonien ausgewählt und die Plasmide mit Hilfe einer Minipräparation isoliert. Von dieser Präparation wurden jeweils 10 µl in einen Restriktionsverdau mit EcoRI eingesetzt. Die Restriktionsfragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt und 10 der Proben mit Inserts, von einer Länge von mehr als 400 bp, zur kommerziellen Sequenzierung (MWG Biotech) ausgewählt.

Die Sequenzierung durch MWG Biotech erfolgte, ausgehend von der Vektorsequenz, von zwei Seiten. Die Kombination der längsten durch 5´Inverse PCR gefundenen Sequenzen mit der bereits bekannten Sequenzinformation lieferte eine vollständige HSP-1 cDNA. Das Start-ATG der „Full length“ Sequenz beginnt bei Nukleotid 18, das offene Leseraster (ORF) umfasst 146 Codons. Allerdings ist bekannt, dass für eine effiziente Nutzung des ATGs die Sequenzumgebung wichtig ist. Bei diesem neuen ATG-Methionin an Position -25 scheint es sich um das eigentliche Initiationscodon zu handeln, wenn man den auch als Kozak-Sequenz bezeichneten Sequenzabschnitt betrachtet: CC RCC ATG G. Diese so genannte Konsensussequenz ist optimal, Abweichungen reduzieren die Translationsrate. Die beiden unterstrichenen Positionen sind dabei für die Funktion der Translation besonders wichtig, wobei das R idealer Weise entweder für Adenin oder Guanin steht (Kozak et al., 1987).

Das TGA-Stopcodon beendet das offene Leseraster und liegt an Position +121. Darauf folgt die 3´untranslatierte Region (3´-UTR), die an Position 457-462 und an Position 620-625 zwei mögliche Polyadenylierungssignale (AATAAA) aufweist. Das Polyadenylierungssignal an Position 620-625 liegt 13 Nukleotide vor dem PolyA-Ende (Abb. 5).

Von Calvete et al. (1995) konnte sowohl die N-terminale Aminosäuresequenz von HSP-1 und HSP-2 durch proteolytische Spaltung mit Chymotrypsin, Trypsin und Endoproteinase ASP-N ermittelt werden, als auch anhand der sich überschneidenden Sequenzen die gesamte Proteinsequenz zusammengestellt werden. So konnte er zeigen, dass es sich bei beiden Proteinen um Vertreter einer Proteinfamilie handelt, wobei HSP-1 im Gegensatz zu HSP-2 über einen deutlich verlängerten N-Terminus verfügt. Zuerst konnten die Aminosäuren an Position 5, 12, 22 und 27 in der Sequenz von HSP-1 nicht identifiziert werden.

Untersuchungen zur molaren Masse des Proteins lieferten erste Hinweise auf eine mögliche Glykosylierung an diesen Stellen. Eine Aminosäureanalyse des gesamten Proteins bestätigte die Vermutung, dass es sich bei den nicht identifizierten Aminosäuren um Threonin handelt, das jeweils in O-glykosilierter Form vorlag.

Durch die in dieser Arbeit durchgeführte „Full length“ Klonierung konnte zum einen die vollständige Nukleinsäuresequenz von HSP-1 ermittelt werden, zum anderen konnte aus dieser Nukleinsäuresequenz die entsprechende Aminosäuresequenz ermittelt werden. Diese

Aminosäuresequenz bestätigte die von Calvete 1995 vermuteten Threonine an den Positionen 5, 12, 22 und 27 der Sequenz (Abb. 6).

Verwendete Primer:

HSP-1-long-Sense-Primer: 5´-AAGTGCATCTAACCCATGG-3´

HSP-1-long-Antisense-Primer: 5´-GAGTGACTGAGCACCAAGAA-3´

HSP-1-long-cDNA-Synthese-Primer: 5´-CAGTGGGAACAAAGTGGAG-3

1 2 3 4

600 bp

Abb. 4: Darstellung der elektrophoretischen Auftrennung der 5´Inversen PCR-Produkte von HSP-1: 1 Längenstandard (100 bp Marker); 2 Negativkontrolle (H2O; ohne Template); 3 Positivkontrolle mit 1-long Sense/Antisense-Primer Paar 1; 4 Positivkontrolle mit HSP-1-long Sense/Antisense-Primer Paar 2. Der verwendete cDNA-Primer ist für beide 5´Inversen PCR Ansätze der Gleiche.

cagcaag gcaagctgcc 17 atg gca cca cgt ttg gga atc ttt ctg att tgg gct ggc gct tgt 62 M A P R L G I F L I W A G A C -25 -11 atc ttt ctc caa ctg gac cat gtg gat gga gat ctg cag acg acg 107 I F L Q L D H V D G ⇓ D L Q T T -10 -1 +1 +5 ggg gct gac cat tct gct aca gtg aac cca gat cag cag ctg att 152 G A D H S A T V N P D Q Q L I +6 +20 atg acc aaa cat tct gct aca gtg aca cca gaa aat aaa tgt gtt 197 M T K H S A T V T P E N K C V +21 +35 ttt cca ttc aac tat cga ggc tat cgg tat tac gat tgc act agg 242 F P F N Y R G Y R Y Y D C T R +36 +50 act gat tcg ttt tac cgt tgg tgt tcc tta act ggc act tat tca 287 T D S F Y R W C S L T G T Y S +51 +65 ggg agt tgg aaa tat tgt gct gcc aca gac tat gcc aaa tgt gcc 332 G S W K Y C A A T D Y A K C A +66 +80 ttt ccc ttt gtc tac cgt ggc caa aca tat gac cgt tgc aca act 377 F P F V Y R G Q T Y D R C T T +81 +95 gat gga agt ctt ttt cgc att tct tgg tgc tca gtc act cct aac 422 D G S L F R I S W C S V T P N +96 +110 tat gat cat cat gga gct tgg aaa tat tgc tag taataaaaag tgca 469 Y D H H G A W K Y C * * *

+111 +120

tctaac ccatggccat gaatgcaatg aagcctttga aatctgcgtg aagaaaat 523 ca agaaatctca agcataaagg tgatgctctg tgcaacagag gtgcaaaact t 576 tccctgaaa ctccactttg ttcccactgt gcctgaattc aatcaataaa ccact 630 ttctc tgc(a)n 638

Abb. 5: HSP-1 cDNA (obere Sequenz) und davon abgeleitete Aminosäuresequenz (untere Sequenz). „Full length“ HSP-1 cDNA, die aus Klonen der 5´-Inversen PCR Analyse und bereits bekannten Sequenzinformationen zusammengestellt wurde. Der Pfeil markiert die Spaltstelle der Signalpeptidase. Das Start-Methionin ist unterstrichen, ebenso die beiden möglichen Polyadenylierungssignale. Das Stop Codon TGA ist durch * gekennzeichnet. Der erste der beiden N-terminalen Bereiche an invarianter Aminosäuren ist rosa, der zweite Bereich blau gekennzeichnet. Die Konsensussequenz für die erste Fn2-Domäne ist unterstrichen und grün markiert, die Konsensussequenz für die zweite Fn2-Domäne ist ebenfalls unterstrichen und gelb markiert. Die möglichen O-Glykosylierungsstellen sind umrandet.

Abb. 6: Alignment der Aminosäuresequenz der in dieser Arbeit klonierten HSP-1 cDNA mit der von Calvete et al. (1995) veröffentlichten HSP-1 Aminosäuresequenz (accession # P81121).