4. Material und Methoden 1. Material
6.4. Herstellung eines PDC-109 Konstruktes als Vorbereitung zur rekombinanten Expression in Insektenzellen
Das in dieser Arbeit hergestellte PDC-109-Plasmidkonstrukt dient als Grundlage zur Anwendung der Klonierungsstrategie für die rekombinanten Expression in Insektenzellen.
Um ein Protein, in diesem Fall PDC-109, funktionellen Tests unterziehen zu können, muss dieses zuerst in reiner Form und in größeren Mengen zur Verfügung stehen. Dazu macht man sich die rekombinante Expression in vivo nachgewiesener Proteine zu nutze.
Jedoch ist die Expression und korrekte Faltung Cystein-reicher Proteine, wie PDC-109, in Bakterienzellen nicht gewährleistet, weshalb man sich der für diesen Prozess besser geeigneten Insektenzellen bedient. Ziel ist die rekombinante Expression in einem Baculo-Virus-Vektor-System, welches sich ein Honigbienen-Mellitin-Signalpeptid zu nutze macht.
Bei diesem handelt es sich um ein Signalpeptid, das die effiziente Sekretion des nativen Honigbienen-Mellitins in großen Mengen ermöglicht. Dadurch erfolgt auch eine effiziente Sekretion und anschließende Ausschüttung von PDC-109 in ein Kulturmedium. Dazu wird die cDNA-Sequenz des reifen PDC-109-Moleküls ohne den für das eigene Signalpeptid kodierenden Bereich hinter ein Honigbienen-Mellitin-Signalpeptid des pMelBac-Vektors kloniert.
Das rekombinant exprimierte PDC-109 könnte in funktionellen Tests eingesetzt werden und die ermittelten Ergebnisse anschließend direkt mit denen des nativen Proteins verglichen
werden (Greube et al., 2001). Auch ließen sich mit dem funktionell bereits gut charakterisierten PDC-109 als Grundlage Vergleiche hinsichtlich anderer Spezies anstellen.
Man könnte künstliche Proteinkonstrukte entwerfen, die sich zum Beispiel in ihrer Struktur durch eine unterschiedliche Anzahl von Domänen auszeichnen, oder bestimmte Fn2-Domänen gar nicht haben. Anhand dieser Konstrukte wäre es zum einen möglich, die Bedeutung der unterschiedlichen Anzahl der Fn2-Domänen bei den einzelnen Spezies zu untersuchen, zum anderen wäre es möglich, die Frage zu klären, warum manche Tierarten (Rind, Pferd, Schwein) nur zwei andere dagegen vier Fn2-Domänen (Mensch, Hund) bzw.
eine Mischung von beiden (Pferd, Schwein) besitzen.
Auch die Vermutung, dass die Proteine der Spezies, die nur zwei Fn2-Domänen besitzen, auf eine Bildung von Multimeren angewiesen sind um ihre Funktion ausüben zu können, ließe sich so untersuchen.
7. Zusammenfassung
Alexandra Schupp
Klonierung und Charakterisierung von Seminalplasmaproteinen der Huftiere
Die vorliegende Arbeit beschreibt die molekulare Klonierung der Hauptseminalplasma-Proteine des Hengstes sowie eine Klonierungsstrategie zur rekombinanten Expression von Fibronektin-Typ II (Fn2)-Domänen-Proteinen in Insektenzellen.
Frühere Arbeiten (Calvete et al. 1994, 1995) charakterisierten die Hauptseminalplasma-Proteine des Hengstes, HSP-1 und HSP-2, als Spermien-bindende Sekretproteine der Samenleiterampulle. Strukturell sind sie durch zwei konservierte , Tandem-artig verknüpfte Fn2-Domänen und durch unterschiedliche N-terminale Peptid-Sequenzen gekennzeichnet. Sie ähneln damit den Hauptseminalplasma-Proteinen des Bullen, vor allem dem sog. „Major protein“ PDC-109 (= BSP-A1/A2).
Aus einer equinen Samenleiter-Ampulle wurde auf der Grundlage einer partiellen HSP-1 cDNA-Sequenz (accession # P81121) mit Hilfe einer 5’-inversen RT-PCR-Technik der bisher unbekannte 5’-Bereich der HSP-1 cDNA erhalten. Dieser Bereich umfasste ein offenes Leseraster, das ein typisches hydrophobes Signalpeptid sowie einen hydrophilen, O-glykosylierten N-Terminus vorhersagte. Letzterer stimmte mit dem durch Peptidsequenzierung bekannten N-Terminus des HSP-1 überein (vergleiche auch Calvete et al. 1995).
Anhand dieser neuen Sequenzdaten sowie der bereits bekannten partiellen HSP-1 cDNA-Sequenz wurde mittels RT-PCR eine vollständige HSP-1 cDNA gewonnen. Die Nukleinsäuresequenz wurde anhand von 6 unabhängigen cDNA-Klonen bestätigt. Alle 6 Sequenzen waren identisch, und das dort vorhergesagte Protein stimmte vollständig mit der HSP-1-Proteinsequenz sowie der AA’BB’-Domänen-Struktur überein.
Außerdem wurde wurden mittels RT-PCR-Klonierung weitere cDNAs erhalten, die HSP-2-ähnliche Proteine kodieren, d.h. Proteine der Domänen-Struktur ABB’. Aus vorausgegangenen Arbeiten (Calvete et al.,1995) war bereits bekannt, dass das equine HSP-2 kein reines Protein darstellte, sondern ein Gemisch aus sehr nahe verwandten Proteinen, die sich biochemisch nicht trennen ließen. Die hier durchgeführten Arbeiten bestätigen auf cDNA-Ebene diese Heterogenität des HSP-2.
Anhand einer aus Vorarbeiten bekannten, virtuellen sog. HSP-neu cDNA-Sequenz wurden mittels RT-PCR zwei Klonfamilien erhalten, die sehr wahrscheinlich auf zwei RNA-Varianten des gleichen Gens zurückgehen. Die zwei resultierenden cDNA-Sequenz wurden anhand von jeweils drei unabhängigen Klonen verifiziert. Sie unterscheiden sich in 26 Nukleotiden. Die Deletion dieser Nukleotide in einer der Varianten führt zu einer Verschiebung des Leserasters und damit zu einer C-terminalen Verlängerung der
vorhergesagten Proteinsequenz, während ein einheitlicher N-Terminus vorhergesagt wird.
Dieser stimmte zwar nicht vollständig mit der HSP-2-Sequenz überein, war dieser aber sehr ähnlich und bestätigte die ABB’-Domänenstruktur.
Darüber hinaus wurden noch weitere, unvollständige cDNA-Klone erhalten, von denen einer ein weiteres, bisher unbekanntes HSP-ähnliches Protein vorhersagte. Diese Sequenz ist bisher aber nur durch einen Klon repräsentiert und muß in zukünftigen Arbeiten näher analysiert und bestätigt werden.
Anhand von Northern Blot-Analysen wurde schließlich die Samenleiterampulle als Hauptexpressionsort der HSP-Proteine auf mRNA-Ebene bestätigt.
Fn2-Domänen sind durch ein charakteristisches Disulfid-Brücken-Muster gekennzeichnet. Da sich native Disulfid-Brücken-Muster in bakteriellen Expressionssystemen häufig schlecht ausbilden, wurde eine Klonierungsstrategie für die rekombinante Expression dieser Proteine in Insektenzellen entwickelt. Diese Strategie wurde zunächst für das bovine Homologe der HSP-Proteine überprüft, das PDC-109. Dazu wurde anhand der bereits publizierten cDNA-Sequenz ein Subklon gewonnen, der den Bereich des offenen Leserasters umfasst, der das
„reife“ PDC-109 kodiert. Mit Hilfe dieses Subklons wurde zunächst durch Northern Blot die Bläschendrüse des Bullen als Hauptexpressionsort des PDC-109 bestätigt. Anschließend wurde ein Plasmid-Konstrukt erzeugt, das nach Umklonierung eine rekombinante
Proteinexpression und eine Sekretion des Proteins in den Überstand von Insektenzellkulturen erlauben sollte. Die hier entwickelte Strategie sowie das resultierende Vektorkonstrukt sind auch für die Subklonierung der „reifen“ HSP-Protein-kodierenden Sequenzen geeignet.
8. Summary
Alexandra Schupp
Cloning and Characterization of the seminal plasma proteins of the ungulates
The preceding study describes the molecular cloning of the stallion‘s major seminal plasma proteins as well as a cloning strategy for the recombinant expression of fibronectin-typeII (Fn2)-module-proteins ((Fn2-modules) in insect cells.
Previous studies (Calvete et al., 1994, 1995) characterised the stallion’s major seminal plasma proteins, HSP-1 and HSP-2, as sperm-binding secretory proteins from the ampulla ductus deferentis. Structurally they are typified by two preserved tandemly arranged Fn2-modules and by different N-terminal peptide sequences. In this they are similar to the major seminal plasma proteins of the bull, in particular to the so-called “Major protein” PDC-109 (= BSP-A1/A2).
On the basis of a partial HSP-1 cDNA sequence (accession # P81121) from an equine ampulla ductus deferentis the previously unknown 5’ region of HSP-1 cDNA was obtained. This region comprised an open reading frame (ORF), which predicted a typical hydrophobic signal-peptide encoding sequence as well as a hydrophilic, O-glykosylated N-Terminus. The latter agreed with the N-Terminus of the HSP-1 identified by peptide sequencing (cf. also Calvete et al. 1995).
Based on these new sequencing results, as well as the already identified partial HSP-1 cDNA-sequence, a complete HSP-1 cDNA was obtained using RT-PCR. The nucleotide acid sequence was confirmed using 6 independent cDNA clones. All 6 sequences were identical, and the predicted protein conformed completely to the HSP-1 protein sequence and to the AA’BB’ domain structure.
In addition, further cDNAs were obtained using RT-PCR cloning, which encodes proteins similar to HSP-2, i.e. proteins with the domain structure ABB’. It had already been established in previous studies (Calvete et al. 1994), that the equine HSP-2 is not a pure protein, but rather a mixture of very closely related proteins, which could not be separated by biochemical processes. The studies carried out here confirm the heterogeneity of HSP-2 on the cDNA level.
Based on a virtual so-called HSP-new cDNA sequence identified in previous studies, and using RT-PCR, two clone families were identified, which very probably go back to two RNA-variants of the same gene. The two resultant cDNA sequences were each verified using three
independent clones. They differ in 26 nucleotides. The lack of these nucleotides in one of the variants leads to a displacement of the (ORF) and therefore to an extension in the C-terminal region of the aforementioned sequence of proteins, whilst a unified N-Terminus is predicted.
This did not fully agree with the HSP-2 sequence, but was very similar and confirmed the ABB’ domain structure.
Furthermore, additional incomplete cDNA clones were obtained, of which one predicted a further and as yet unknown protein similar to HSP. This sequence is to date only represented by a clone and in future studies will have to be more closely identified and confirmed.
Using Northern-Blot-Analysis, ampulla ductus deferentis was finally confirmed as the main point of expression of HSP-proteins at the level of mRNA.
Fn2-modules are typified by a characteristic bridge pattern. As native disulphide-bridge pattern often develop poorly in bacterial expression systems, a strategy for cloning the recombinant expression of these proteins in insect cells was developed. This strategy was initially checked for bovine homology of HSP proteins, the PDC-109. A sub-clone was obtained based on the already published cDNA sequence, which encompasses the area of the ORF, which encodes the “mature” PDC-109. With the help of this sub-clone and using Northern-Blot-Analysis, the bull’s vesicle gland was confirmed as the main point of expression of PDC-109. Afterwards a plasmidconstruct was created, which should allow, after further cloning, a recombinant expression of protein and a secretion of protein in the insect cell culture. The strategy developed here, as well as the resultant vectorconstruct, is ideal for the sub-cloning of the “mature” HSP-protein encoding sequences.
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Hamilton, D. W. (1990)
Anatomy of mammalian male accessory reproductive organs.
In: Marshall´s Physiology of Reproduction, Vol. 2, Reproduction in male.
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