4. Material und Methoden 1. Material
6.3. Strukturvergleich der Fibronektin-TypII-Domänen-Proteine
Fibronektin-TypII-Domänen-Proteine
Abb. 23: Strukturvergleich der Fn2-Domänen-Proteine der bislang untersuchten Spezies. Die jeweiligen Bereiche invarianter Aminosäuren im N-terminalen Bereich sind mit A und A´
bezeichnet. Die Fn2-Domänen sind mit B und B´ benannt und farbig markiert.
A‘
A
A
A A A‘
A‘
HSP-1
HSP-neu-Var.1
HSP-neu-Var.2
PDC-109
BSP-A3
BSP-30K
pB1
EQ12/SE12
HE12
CE12 B
B
B
B
B
B
B
B‘
B
B‘
B‘
B‘
B‘
B‘
A
Die Hauptproteinkomponente des equinen Seminalplasmas wird sowohl von dem hier untersuchten HSP-1 (30kDA) als auch von HSP-2 (25kDa) gebildet. HSP-1 kommt in einer Heparin-bindenden als auch in einer nicht Heparin-bindenden Fraktion vor (Calvete et al., 1995c). Dabei handelt es sich um verschiedene Glykoformen ein und desselben Proteins.
Zusätzlich zu diesen Fn2-Domänen besitzt HSP-1 in der Heparin-bindenden Form N-terminal zwei Bereiche, die jeweils aus ca. 13-15 Aminosäuren bestehen, so genannte A-Domänen (AA´). Diese verfügen über insgesamt vier O-Glykosylierungsstellen (Abb. 23). Betrachtet man sich die Aminosäuresequenzen der in dieser Arbeit charakterisierten unterschiedlichen HSP-neu Varianten 1 und 2 so weisen allle HSP-Varianten zwei Fn2-Domänen (BB‘) auf.
Jedoch verfügen diese HSP-neu Varianten jeweils nur über eine etwa 15 AS-langen N-terminale Extensionen (ABB‘) mit nur zwei O-Glykosylierungsstellen.
Auch die Primärstrukturen von PDC-109 (BSP-A1/2) sowie von BSP-A3 verfügen wie die HSP-neu Varianten über jeweils eine A-Domäne (A) und zwei aufeinanderfolgende Fn2-Domänen (BB‘). Im N-terminalen Bereich besitzt das PDC-109 nur eine einfach glykosylierte A-Domäne, wohin gegen das BSP-A3, ansonsten identisch mit diesem, N-terminal keine Glykosylierungsstelle hat.
Das ebenfalls zu den bovinen Seminalplasmaproteinen gehörende BSP-30K ist durch einen 48 Aminosäuren langen N-Terminus gekennzeichnet, der insgesamt sechs O-Glykosylierungen aufweist, gefolgt von nur einer A-Domäne (XABB`) (Calvete et al., 1996).
Das homologe porcine Seminalplasmaprotein (pB1) kommt in vergleichsweise geringer Menge im Seminalplasma vor und besitzt nur eine A-Domäne mit einer O-Glykosylierungsstelle im N-terminalen Bereich, auf die die zwei Fn2-Domänen folgen (ABB´). Außer einem geringen Selbstassoziationsgrad liegt es in Form eines Heterotetramers in Verbindung mit AQN-1, einem Sepermadhesin, vor.
Die erst kürzlich im Seminalplasma der Ziege nachgewiesenen Vertreter der Fn2-Domänen-Proteine, finden hier aufgrund der bisher geringen Sequenzinformation keine Berücksichtigung (Villemur et al., 2003).
Alle diese Fn2-Domänen-Proteine mit insgesamt zwei Fn2-Domänen, zu denen die von Rind, Pferd und Schwein gehören, sind in der Lage, phosphorylcholin-abhängige Multimere zu bilden. Diese unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit Multimere zu bilden (Hetero- bzw.
„Homo“-Oligomere). Diese Beobachtungen in vitro lassen die Vermutung zu, dass die Bildung von Hetero- bzw. Homo-Oligomeren dieser Fn2-Domänen-Proteine die Bindung von Heparin beeinflussen, wenn gar nicht erst ermöglichen. Um die physiologische Relevanz der
Heparinbindung und der damit verbundenen Oligomerisation von HSP-1, HSP-2 ähnlichen HSP-neu Varianten und von PDC-109 zu klären, müsste unter anderem das Vorhandensein und die Fähigkeit der Proteine Multimere zu bilden, in vivo im weiblichen Genitaltrakt, untersucht werden.
Auch die unterschiedliche Lokalisation und Bindung der Proteine an die Spermienmembran lässt auf unterschiedliche Funktionen dieser Proteine hinsichtlich Motilität und Spermium-Eizell-Interaktion schließen. Zur Charakterisierung dieser Bindungen sowie Aussagen über den Grad der Festigkeit, Stabilität und Veränderung der Bindungen im Verlauf der posttestikulären Spermienreifung, Kapazitation und Akrosomenreaktion sind weitere in vitro und in vivo Untersuchungen erforderlich.
Im Gegensatz zu diesen „kleinen„ Fn2-Domänen-Proteinen konnte zunächst mittels molekularbiologischer Methoden ein neuartiges Protein mit vier Fn2-Domänen aus dem humanen männlichen Genitaltrakt kloniert und charakterisiert werden. Hierbei handelt es sich um das als HE12 bezeichnete Protein (Saalmann et al., 2001). Es besitzt eine große strukturelle Ähnlichkeit zu den Seminalplasmaproteinen der Huftiere (50-60%
Sequenzidentität zu den jeweiligen Fn2-Domänen), wovon die zwei N-terminal gelegenen Domänen die größte Homologie zu denen der Huftiere haben. Die zwei nachfolgenden Fn2-Domänen gleichen eher der Gelatinase bzw. dem Hagemann Faktor (Schulz et al., 1998;
Ponting et al., 1999). Trotz ihrer großen Homologie sind sie den Proteinen der Huftiere nicht ortholog. Im Gegensatz zu diesen wird HE12 im Nebenhodenepithel des mittleren Corpus-Abschnittes synthetisiert (Saalmann et al., 2001).
Ebenso konnten zwischenzeitlich noch weitere HE12-Homologe identifiziert werden, die sich ebenfalls durch insgesamt vier Fn2-Domänen auszeichnen. Dazu gehören das aus dem Nebenhoden des Pferdes klonierte EQ12, das canine epididymale CE12 Genprodukt (Saalmann et al., 2001) und das erst kürzlich aus der epididymalen Flüssigkeit des Ebers isolierte Se12 (Schäfer et al., 2003). Aufgrund eines im offenen Leseraster liegenden Polymorphismus von CE12 können mindestens zwei zusätzliche Isoformen des Proteins angenommen werden, die sich im N-terminalen Bereich unterscheiden (Saalmann et al., 2001). Alle HE12-Homologen stammen zum größten Teil aus dem Nebenhoden.
Über diese Gruppe der Fn2-Domänen-Proteine mit vier Fn2-Domänen kann man zu diesem Zeitpunkt wenig Aussagen über eventuell vorhandene N-terminal verlängerte Bereiche in der Aminosäuresequenz bzw. über posttranslationale Modifikationen machen. Allein bei dem Rüden konnten zwei mRNAs gefunden werden, von denen zumindest eine (CE12a) auf einen
verlängerten N-Terminus ähnlich denen der „kleinen“ Fn2-Domänen-Proteinen schließen lassen. Über Wechselwirkungen mit anderen Makromolekülen ist bisher noch nichts bekannt.
Bislang konnte auch keine Tendenz dieser Gruppe von Fn2-Domänen-Proteine zur Bildung von Multimeren festgestellt werden.
Hier wird deutlich, dass sich die Fn2-Domänen-Proteine in der Anzahl der Fn2-Domänen, in der Aminosäurezusammensetzung und in der Länge der N-terminalen Bereiche, sowie in der jeweiligen Glykosylierung voneinander unterscheiden.
Betrachtet man sich die Sekretionsorte der Fn2-Domänen-Proteinen der Huftiere mit jeweils zwei im Tandem angeordneten Fn2-Domänen, so fällt auf, dass diese hauptsächlich in der Samenleiterampulle und in den Seminalvesikeln synthetisiert und sezerniert werden.
Demgegenüber stehen die Domänen Proteine mit vier hintereinander liegenden Fn2-Domänen, die vorwiegend schon im weiter proximal gelegenen Nebenhoden synthetisiert werden.
Hier stellen sich mehrere Fragen hinsichtlich der Funktion dieser Proteine. Nicht nur, dass die Fn2-Domänen in einer unterschiedlichen Menge sezerniert werden, sie werden auch an unterschiedlichen Regionen entlang des männlichen Geschlechtstraktes synthetisiert. Welche Bedeutung diese Regionalisierung bzw. die unterschiedliche Anzahl der Fn2-Domänen für die Funktion dieser Proteine der einzelnen Spezies hat bleibt noch aufzuklären. Auch stellt sich die Frage, ob die „großen“ Fn2-Domänen-Proteine eine Funktion haben, die die „kleinen“ erst durch die Zusammenlagerung zu Oligomeren erlangen, bzw. ob diese zur Ausübung ihrer Funktionen, nur über den Zusammenschluss zu Multimeren in der Lage sind, oder sich diese dadurch möglicherweise verstärkt. Auch könnte man vermuten, dass die „großen“ Fn2-Domänen-Proteine andere, neue Funktionen,haben über die die „kleinen“ nicht verfügen.
Warum darüberhinaus einige Spezies beide Formen der Fn2-Domänen-Proteine (Pferd, Schwein), andere dagegen nur eine der beiden Fn2-Domänen-Proteine (Rind, Mensch, Hund) bzw. eine Mischung von beiden haben, gilt es in zukünftigen Arbeiten zu klären.
Auch besteht die Möglichkeit, dass aufgrund der eventuell zu geringen Transkriptmenge noch gar nicht alle Formen der Fn2-Domänen-Proteine bei allen Spezies nachgewiesen werden konnten. So konnten überraschenderweise die Fn2-Domänen-Proteine bei den Nagetieren noch gar nicht gefunden werden. Gerade ein Nachweis dieser Proteingruppe bei den Nagern, besonders bei der Maus, wäre interessant, da diese Spezies die Möglichkeit eines gezielten Gen-„knockouts“ bietet. Besäße die Maus ein solches homologes Gen, könnte man durch eine gezielte Mutation dieses Gens die funktionelle Bedeutung untersuchen. Bislang konnten
jedoch keine kreuzhybridisierenden mRNAs bei den Nagern gefunden werden (Saalmann et al., 2001). Allerdings werden in cDNA-Datenbanken zwei hypothetische Nager-Gene mit jeweils zwei Fn2-Domänen vorhergesagt, die als „similar to seminal plasma protein“ HSP-1 und „similar to seminal plasma protein“ BSP-30K (accession # XP 284265 und XM 218325) bezeichnet werden. Bei diesen könnte es sich um die erhofften Nager-Homologe handeln.
Die rekombinante Expression der unterschiedlichen Fn2-Domänen-Proteine in Insektenzellen bietet hier gute Möglichkeiten zur näheren Untersuchung dieser Proteine. Die Expression in Insektenzellen hat hier den Vorteil, dass in diesem Expressionssystem die korrekte Faltung der Cystein-reichen Fn2-Domänen-Proteine gewährleistet ist. So können auf diesem Weg größere Mengen der aufgereinigten Proteine hergestellt werden, die die Grundlage für funktionelle Tests bilden. Zum einen könnten in vivo nachgewiesene Proteine rekombinant exprimiert werden, zum anderen könnten Proteinkonstrukte hergestellt werden, die in vivo so gar nicht existieren. Diese gezielt veränderten Konstrukte könnten es ermöglichen zu untersuchen ob bzw. welche Funktion an eine oder mehrere Fn2-Domäne gebunden ist. Hier wären Konstrukte denkbar, die über eine, zwei oder drei Fn2-Domänen verfügen. Auch unterschiedliche Kombinationen der Fn2-Domänen mit unterschiedlichen N-Termini wären möglich.
Ein erster Schritt hierzu, dient das in dieser Arbeit hergestellte PDC-109 Konstrukt. Dieses bereits gut untersuchte Seminalplasmaprotein, welches zur rekombinanten Expression in einem Baculo-Virus System in Verbindung mit einem Honigbienen-Mellitin-Signalpeptid Verfügung steht, könnte Vorreiter für funktionellen Tests mit anderen Proteinen sein.
Dass die Fn2-Domänen innerhalb der Spezies eine große Homologie aufweisen, spricht für eine gute Konservierung dieser Domänen-Proteine. Die gute Konservierung der Fn2-Domänen zwischen den verschiedenen Spezies kann darauf zurückzuführen sein, dass diese essentiellen Funktionen im Hinblick auf das Befruchtungsgeschehen haben. Diese Funktionen sind nicht nur für die Fortpflanzung einzelner Individuen unerlässlich, sondern auch zur Erhaltung und Entwicklung der Arten in der Evolution. So kann man davon ausgehen, dass diese gut konservierten Bereiche der Fn2-Domänen nicht nur strukturell sondern auch funktionell den gleichen Ursprung haben. Wahrscheinlich liegen sie auf benachbarten Genen innerhalb eines Genoms. Dies würde dafür sprechen, dass sich diese unterschiedlichen Formen der Fn2-Domänen-Proteine durch eine, sich in der Evolution wiederholende Genduplikation entwickelt haben. Die Genduplikation und anschließende Auseinanderentwicklung stellt anscheinend einen wichtigen Mechanismus in der Evolution
der Fn2-Domänen-Proteine dar. Ungleiches crossing-over kann ebenso zu einer Anhäufung zusätzlicher Exemplare des tandemartig wiederholten Gens führen.
Jedoch ist über die Struktur und die Anordnung der Gene, die für die Fn2-Domänen-Proteine kodieren, bisher kaum etwas bekannt.
Daher wäre es sinnvoll die Genomstruktur für andere Spezies aufklären zu können. Ein menschliches Genom existiert bereits. Anhand eines Pferde-Genoms könnte man die cDNA-Sequenzen vergleichen und Aussagen über die Lage und Anzahl der Exons machen. Auch können Spleißvarianten besser identifiziert und interpretiert werden, indem es möglich wäre die genauen Exons zu identifizieren, die innerhalb dieser Spleißvarianten enthalten sind bzw.
welche Exons fehlen. Auch wäre es möglich zu sagen, ob es sich bei den Spleißvarianten um künstliche Sequenzierungsprodukte oder um natürlich vorkommende Varianten der HSP Gene handelt.