HSP-neu Varianten

Mit einer als HSP-neu bekannten virtuellen Sequenz und innerhalb dieser Sequenz ausgewählten Primern konnten zwei neue HSP-neu Varianten identifiziert werden, die jeweils durch drei unabhängige Klone repräsentiert werden. Bei zwei dieser Varianten handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Splicevarianten.

Eine dieser so erhaltenen HSP-neu Varianten (HSP-neu Variante 1) stimmt in ihrer Sequenz völlig mit der virtuellen HSP-neu Ausgangssequenz überein. Bei allen drei Klonen endet das offene Leseraster in der Aminosäuresequenz mit einem Methionin. Somit konnten diese Klone das Methionin am C-terminalen Ende der HSP-neu Ursprungssequenz bestätigen, so dass es sich hier nicht um einen Sequenzierungsfehler handelt. Diese Sequenzinformation kann als gesichert angesehen werden.

Die zweite als neu Variante 2 benannte Sequenz ist mit der virtuellen Sequenz von HSP-neu bis auf einen fehlenden Bereich von insgesamt 26 Nukleotiden, identisch. Diese Aussparung in der Nukleinsäuresequenz bewirkt eine deutliche Verlängerung der Aminosäuresequenz von HSP-neu Variante 2 im C-terminalen Bereich, da dieser im Gegensatz zur HSP-neu Sequenz der Bereich des Stop-Codons TGA fehlt. Ansonsten stimmen die Aminosäuresequenzen von HSP-neu Variante 1 und HSP-neu Variante 2 überein. Der in der HSP-neu Variante 2 verlängete C-Terminus könnte sich eventuell auf die Nutzung eines weiteren, stromabwärts in der Sequenz liegenden, Stop-Codons und des zweiten Polyadenylierungssignal zurückführen lassen.

Diese HSP-neu Varianten, liegen möglicherweise zusammen mit der Heparin-bindende Form von HSP-1 als so genanntes Heterooligomer vor (90kDa). Die nicht Heparin-bindende Form von HSP-1 unterscheidet sich von dieser durch einen verkürzten N-Terminus, der sich durch nur drei O-Glykosylierungen auszeichnet (Mahnaz-Ekhlasi-Hundrieser, in Vorbereitung).

Die in der vorliegenden Arbeit charakterisierten HSP-2 ähnlichen, als HSP-neu Variante 1 und 2 bezeichneten Sequenzen, weisen gegenüber der HSP-2 Sequenz von Calvete et al (1995) an Position +7 ein Asparagin mit einer vorhergesagten N-Glykosylierung und an Position +12 ein Threonin mit vorhergesagter O-Glykosylierung auf (NetOGlyc 2.0).

Vergleicht man den N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz dieser HSP-neu Varianten 1 und 2 mit der Aminosäuresequenz von HSP-1, so fällt hier ebenfalls ein Asparagin an Position +7 auf. Dieses wird von „NetOGlyc 2.0“, einem Sequenzanalyseprogramm „Center for biological sequence analysis“ der Technical University of Denmark/DTU mit einer N-Glykosylierung vorhergesagt. Üblicherweise müsste ein N-glykosyliertes Asparagin innerhalb eines so genannten Sequons liegen. Darunter versteht man ein definiertes Aminosäuretriplett, welches aus Asn-X-Ser/Thr besteht, wobei X für jede beliebige Aminosäure steht außer für Prolin. Dies ist in der vorliegenden Sequenz nicht der Fall. Jedoch gibt es auch Ausnahmen, in denen es vorkommt, dass ein Protein an einem Asparagin N-glykosyliert sein kann ohne Bestandteil eines Sequons sein zu müssen. Die vorhergesagte N-Glykosylierung an Position +7 wäre also durchaus möglich.

Die dritte in dieser Arbeit erhaltene HSP-neu Variante, HSP-unbekannt, stimmt nur sehr partiell mit der Sequenz der anderen HSP-neu Varianten 1 und 2 überein. Obwohl der gesamte Anfangsbereich der Signalpeptid-kodierenden Region völlig übereinstimmt, fehlt dagegen die gesamte N-terminale Erweiterung. Auch die für die Fn2-Dömänen kodierende Region fehlt weitgehend. Hier ist nur der letzte Bereich der zweiten Fn2-Domäne übereinstimmend (C(2X)PF(8-9)WC(12-14X)C). Der C-Terminus dieser Sequenz endet wie

HSP-1 mit einem Cystein. Obwohl diese als HSP-unbekannt bezeichnete Variante N-terminal sehr stark trunkiert ist und bislang nur durch einen Klon repräsentiert wird, läßt sich aufgrund der vorliegenden Sequenzinformationen davon ausgehen, dass es sich hierbei um eine weiter HSP-Variante handelt.

Insgesamt läßt sich die Heterogenität dieser Gruppe von HSP-Varianten vermutlich auf alernatives Splicing der mRNA zurückführen. Andererseits besteht dem gegenüber auch die Möglichkeit, dass es zusätzliche sehr ähnliche Gene gibt die diese HSP-Varianten kodieren.

Dafür spricht auch, dass es bei Rind und Ziege auch mehr als zwei Gene für diese Seminalplasmaproteine gibt.

Die Ähnlichkeit zwischen HSP-1 und den HSP-neu-Varianten ist auf Aminosäureebene insgesamt größer als im Vergleich zu den anderen Proteinen dieser Gruppe. Dies könnte bedeuten, dass eine Genduplikation erst nach Abspaltung der Säugerfamilien stattgefunden hat. Das demgegenüber die Ähnlichkeit auf Nukleinsäureebene zwischen den einzelnen Vertretern dieser Gruppe deutlich größer ist, könnte auf eine beschleunigte Evolution hindeuten.

6.2. Northern-Blot-Analyse 6.2.1. HSP-Varianten

Zur Untersuchung der Gewebespezifität der HSP mRNA anhand von Northern-Blot-Analysen wurde eine Digoxigenin markierte Sonde hergestellt. Die Homologie der verschiedenen HSP-Varianten im Sequenzbereich der Sonde, ermöglichte den Nachweis aller HSP-HSP-Varianten gleichzeitig. Die so durchgeführte Northern-Blot-Analyse zeigte nur in der Samenleiterampulle ein deutliches Hybridisierungssignal. Dabei lag die Größe der Bande bei 0.7 kb. Demnach würde es sich um ein samenleiterampullenspezifisches Genprodukt handeln.

Da es sich jedoch bei Northern-Blot-Analysen um so genannte halbquantitative Verfahren handelt, die nur eine geringe Empfindlichkeit haben, können kleine Mengen an Transkripten mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden (Melton et al., 1984). Eine RT-PCR ist im Gegensatz dazu deutlich sensitiver. So lassen sich selbst einzelne Transkripte in einem Probenvolumen nachweisen. Die RT-PCR birgt jedoch andererseits die Gefahr einer Kontamination durch genomische DNA, wenn die Primer nicht Intron-übergreifend sind, da generell keine mRNA komplett frei von genomischer DNA ist. Dies würde erklären, warum voran gegangene Arbeiten anhand verschiedener Methoden wie RT-PCR und

Immunhistochemie auch Regionen des Nebenhodens als Expressionsort von HSP identifizieren konnten. Dort zeigten sich Signale, wenn auch deutlich schwächer, im Caput und Corpus des Nebenhodens (Bellair, 1998).

Das in dieser Arbeit nachgewiesene Signal im Bereich der Samenleiterampulle lässt in jedem Fall den Schluss zu, dass die HSP Transkripte vorrangig dort exprimiert werden. Das diese auch in anderen Geweben exprimiert werden könnten wäre denkbar. Ein bislang nicht geglückter Nachweis könnte auf eine geringe Häufigkeitsrate der Transkripte zurückzuführen sein. Hier gilt auch, dass die nichtradioaktive Hybridisierung gegenüber der radioaktiven weniger sensitiv ist. Auch eine Beeinflussung des Nachweises der Transkripte durch das Alter der Tiere, aus denen die Organproben stammen, ist hier ebenso denkbar.

6.2.2. PDC-109

Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine Reihe verschiedener boviner mRNAs aus Nebenhoden, akzessorischen Geschlechtsdrüsen und mehreren männlichen und weiblichen bovinen Vergleichsgeweben auf insgesamt zwei Northern Blot Gelen aufgetragen.

Ein deutliches Hybridisierungssignal konnte ausschließlich im Bereich des Seminalvesikels nachgewiesen werden. Das in dieser Arbeit charakterisierte Expressionsmuster der PDC-109 mRNA scheint demnach seminalvesikelspezifisch zu sein.

Trotzdem könnte ein fehlender Nachweis der PDC-109 mRNA in anderen Geweben auch auf eine Menge der PDC-109 Transkripte unterhalb der Nachweisgrenze zurückzuführen sein.

Auch zeigt sich die nichtradioaktive Hybridisierung gegenüber der radioaktiven oftmals weniger sensitiv. Da der Einbau des Digoxigenins in die Sonde in der vorliegenden Arbeit nur qualitativ überprüft wurde, besteht ebenfalls die Möglichkeit, dass bei einer geringen Menge an mRNA die Signalstärke zu schwach war. Ebenso ist eine Beeinflussung der Transskriptmenge durch das Alter denkbar, so dass die mRNA Menge unter der Nachweisgrenze lag. Dass spezifische PDC-109 mRNA, ausschließlich im Seminalvesikel nachgewiesen werden konnte, würde allerdings vorangegangene Untersuchungen bestätigen, bei denen auf bereits aus dem Nebenhoden entnommenen Spermien keine BSP-Proteine nachgewiesen werden konnten.

Vergleicht man die Expressionsorte der HSP mRNA und der PDC-109 mRNA, so ist festzustellen, dass diese entlang des männlichen Geschlechtstraktes und dort von verschiedenen akzessorischen Geschlechtsdrüsen synthetisiert und sezerniert werden.

Die tierartlichen Unterschiede im Verteilungsmuster der Expression der Seminalplasmaproteine unterstützen die Vermutung, dass ein funktioneller Zusammenhang zwischen dem Expressionsort und den anatomischen Besonderheiten besteht. Für verschiedene Genprodukte des Nebenhodens konnten bereits regional und segmental variierende Expressionsmuster definiert werden (zusammengefasst in Kirchhoff, 1999). Dies würde auch erklären warum die Seminalplasmaproteine der verschiedenen untersuchten Spezies, aufgrund unterschiedlicher Sekretionsorte zu verschiedenen Zeiten mit den Spermien in Kontakt treten (Töpfer-Petersen et al., 1995). So kommt auch das in der Samenblase synthetisierte PDC-109 erst während der Ejakulation mit den Spermien in direkten Kontakt.

Trotzdem ist die Zeit ausreichend für eine Bindung an die Spermienmembran (Müller et al., 1998; Greube et al., 2001). Dort sind die Proteine auf der Spermienoberfläche als peripheres Membranprotein nachweisbar und binden im postakrosomalen Bereich sowie am Mittelstück der Spermien an diese (Manjunath et al., 1993). Die in der Samenleiterampulle synthetisierten und sezernierten HSPs treten ebenfalls erst während der Ejakulation in direkten Kontakt mit den Spermien. Somit entspricht das Verteilungsmuster von PDC-109 dem des HSP-1 auf der Spermienoberfläche (Hess, 1998). HSP-1 ist sowohl im Bereich des Akrosoms, als auch des Mittelstückes an die Spermienoberfläche gebunden. Der Interaktionsmodus der HSP-Proteine scheint im wesentlichen denen der PDC-109 Proteine zu ähneln (Greube et al, 2003 in Voebereitung). Im Gegensatz zu PDC-109 konnte HSP-1 jedoch bereits an Spermien, die aus dem distalen Nebenhodenkörper entnommen wurden, nachgewiesen werden (Töpfer-Petersen et al., 1998). Dass dieser Nachweis im Nebenhodenkörper in der vorliegenden Northern Blot Analyse nicht möglich war, könnte, wie schon erwähnt, an einer eventuell unter der Nachweisgrenze liegenden Transkriptmenge, an der geringeren Sensitivität der Methode oder an dem Lebensalter des Tieres liegen.