4. Material und Methoden 1. Material
4.2.15. Northern-Blot-Analyse
4.2.15.1. 1,3 %iges denaturierendes Formaldehyd-Gel zur elektrophoretischen Auftrennung von RNA
Mit dieser Methode wird RNA der Größe nach aufgetrennt. Formaldehyd bewirkt eine Denaturierung (Entfaltung) der RNA und eine gleichzeitige Inaktivierung der ubiquitär vorkommenden RNasen. Um die Sekundärstruktur der RNA aufzulösen, wurden die Proben vor dem Auftragen auf das Gel erhitzt und mit Formamid versetzt. Zu Beginn wurden alle zur Gelelektrophorese verwendeten Teile mit aqua bidest. abgespült. Zur Herstellung eines 150 ml Gels wurden 1,95 g Agarose (Agarose Ultra pure; GIBCO BRL) und 137,5 ml aqua bidest.
solange in der Mikrowelle erhitzt, bis sich die Agarose vollständig löste. Die Lösung wurde auf 70°C abgekühlt. Unter dem Abzug wurden schnell 7,5 ml MOPS Puffer, 5 ml säurefreies 37 %iges Formaldehyd und 6 µl Ethidiumbromid (10 µg/µl; Sigma) der Agarose-Lösung zugesetzt. Diese wurde unter Vermeidung von Luftblasen in einen 15 x 15 cm großen Gelträger gegossen. Die Aushärtung des Gels wurde genutzt, um die zu untersuchenden RNA-Proben auf Eis aufzutauen und je 10 µg der RNA mit aqua bidest. auf ein Volumen von 5,5 µl aufzufüllen. Pro RNA-Probe wurde 14,5 µl des vorher bereitgestellten RNA-Mixes zugegeben und diese 20 min bei 65°C denaturiert. 5 µg des verwendeten RNA-Größenmarkers (0,24-9,5 kb RNA Ladder; GIBCO BRL) wurde in genau der gleichen Weise vorbereitet und behandelt. Jeder Probe wurde auf Eis je 2 µl des 10 x RNA-Laufpuffers (GIBCO BRL) zugegeben. Das vollständig ausgehärtete Gel wurde zuvor in die Gelkammer gesetzt und mit 1 x MOPS als Laufpuffer aufgefüllt. Die Gel-Taschen wurden dann mit den Proben beladen. Bei einer angelegten Spannung von 75 Volt bzw. 42 mA läuft das Gel ca. 4 Stunden. Anschließend wurde das Gel auf dem UV-Tisch betrachtet und mit einer Polaroid Kamera photographiert.
20 x MOPS-Puffer 200 mM MOPS (SIGMA)
50 mM Na-Acetat 10 mM EDTA, pH 8,0
ad 1000 ml aqua bidest., pH 7,0
10 x RNA-Auftragungspuffer 50 % Glycerol 1 mM EDTA, pH 8,0 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylen Cyanol FF
RNA-Mix 1 ml Formamid
350 µl Formaldehyd 37 % 100 µl 20 x MOPS
4.2.15.2. Northern-Blot, Kapillartransfer von RNA
Die in einem denaturierenden Formaldehyd-Gel elektrophoretisch aufgetrennte, negativ geladene RNA wurde in diesem Verfahren auf eine positiv geladene Trägermembran durch Kapillarkräfte übertragen. Hierzu wurde eine Plastikschale zu etwa einem Drittel mit 10 x SSC Puffer gefüllt. Eine Glasplatte wurde der Länge nach über die Plastikschale gelegt. Zwei Schichten Whatman 3 mm Papier (Whatman Internat. Ltd.; Maidstone, England) wurden so auf die Glasplatte gelegt, dass deren Enden in den SSC Puffer reichen. Diese Papierschichten wurden ebenfalls komplett mit 10 x SSC Puffer befeuchtet. Eventuell zwischen den Papierschichten entstandene Luftblasen wurden entfernt. Das RNA-Gel wurde auf das Whatman Papier gelegt und mit einer Nylonmembran (Hybond N +; Amersham, Braunschweig) bedeckt. Die Nylonmembran wurde zuvor auf die Größe des Gels zurechtgeschnitten und mit aqua bidest. befeuchtet. Weitere 3 Schichten ebenfalls mit aqua bidest. befeuchteter Whatman Papiere wurden auf der Nylonmembran platziert. Wichtig ist hier die Vermeidung von Luftblasen innerhalb der zahlreichen Papierschichten, da an den Stellen der Luftblasen die Übertragung der RNA auf die Trägermembran verhindert wird. Zur Unterstützung der Kapillarwirkung wurde ein Stapel Papierhandtücher obenauf gelegt und mit einer Glasplatte sowie einem Gewicht beschwert. 24 Stunden später wurde der Blot abgebaut.
Die auf die Nylonmembran übertragene RNA wurde im UV-Stratalinker (Stratagene) durch beidseitige UV-Bestrahlung fixiert. Dabei bindet der Zucker-Phosphat-Anteil der einzelsträngigen-RNA-Moleküle an die Trägermembran, der Basen-Anteil bleibt frei zugängig, so dass sie sich mit den komplementären Nukleinsäuremolekülen einer spezifischen Sonde in der darauf folgenden Hybridisierungsreaktion verbinden können. Die Membran kann bis zur Hybridisierung bei -20°C eingefroren und so aufbewahrt werden.
4.2.15.3. Nichtradioaktive Hybridisierung von Northern-Blots
Prinzip:
RNA-Sequenzen, die durch Northern-Blotting auf eine Membran übertragen werden, kann man mit Hilfe der nichtradioaktiven Hybridisierung identifizieren. Die Hybridisierung erfolgt mit einer Sequenz-spezifischen Digoxigenin-markierten Sonde. Dazu wird die Membran mit dieser nichtradioaktiv markierten Sonde inkubiert. Anschließend hybridisiert die Sonde mit den homologen RNA-Sequenzen auf der Membran. So können bestimmte Sequenzen der auf die Trägermembran übertragenen RNA mit dieser Sequenz-spezifisch markierten Sonde identifiziert werden. Dabei kann das Digoxigenin mit einem Anti-DIG-Antikörper nachgewiesen werden. Dazu ist dieser Anti-DIG-Antikörper an eine Alkalische Phosphatase gebunden. Wird jetzt ein Chemolumineszenz-Substrat, CDP-Star (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim), zugesetzt wird diese von der Alkalischen Phosphatase enzymatisch dephosphorylisiert. Es kommt zu einer photochemischen Reaktion, bei der Energie in Form von Licht frei wird. Legt man einen Röntgenfilm auf den Blot, so wird dieser an der betreffenden Stelle geschwärzt. Die Exposition der Röntgenfilme erfolgt bei Raumtemperatur.
Die Expositionszeiten richten sich nach der Stärke der erhaltenen Signale und reichen von Sekunden bis mehrere Stunden.
Durchführung:
Die Hybridisierung erfolgte in silikonbeschichteten Rollerflaschen im Hybridisierungsofen (Techne Hybridiser HB-1D, Wertheim). Die Trägermembran wurde mit der RNA-Seite nach innen zeigend in die Rollerflaschen eingelegt. Die Bildung von Luftblasen wurde vermieden.
Mit 30 ml der vorgewärmten Hybridisierungslösung wurde die Membran 3 Stunden bei 65°C prähybridisiert. Anschließend wurden 100 ng der DIG-markierten Doppelstrang-Sonde in 100 µl aqua bidest. aufgenommen und 5 Minuten bei 95°C denaturiert. Diese Lösung wurde in 20 ml frischer Hybridisierungslösung eingefüllt und die Membran erneut, diesmal über Nacht, bei 65°C im Hybridisierungsofen hybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde am nächsten Morgen verworfen und die Membran 3x je 20 Minuten bei 65°C mit je 50 ml vorgewärmtem Waschpuffer gewaschen. Bei diesem Vorgang wurde die bislang noch nicht hybridisierte Sonde von der Membran entfernt. Die Trägermembran wurde in eine mit aqua bidest.
abgespülte Plastikschale gelegt und 5 Minuten mit 50 ml Maleinsäurepuffer auf einem Schwenktisch gewaschen. Danach erfolgte ein erneutes Waschen der Membran über einen Zeitraum von einer Stunde mit 70 ml Blockierungslösung. Ein 30 minütiger Waschgang mit 30 ml der Blockierungslösung, der diesmal 2 µl DIG-Antikörper hinzu gegeben wird, folgte.
Ein 4xiges Wachen mit Waschpuffer für je 10 Minuten schloß daran an. Die Membran wurde im Anschluss daran erst 5 Minuten in Substratpuffer und dann 5 Minuten in Substratpuffer, dem CDP-Star zugesetzt wird, inkubiert. Die Membran wurde danach aus der Flüssigkeit genommen und möglichst Luftblasenfrei in Folie eingeschweißt. Die Folie wurde in eine Filmkassette eingelegt und ein Röntgenfilm (X-OMAT AR; Eastman Kodak Company, Rochester, New York) aufgelegt. Die Expositionszeit des Röntgenfilms richtete sich nach der Stärke der Signale. Die Filmentwicklung erfolgte in einer Röntgenfilm-Entwicklungsmaschine. Die Intaktheit, das Auftragen gleicher Mengen der Proben und der gleichmäßige Transfer, wurden mittels einer 18S-Sonde überprüft. Diese Kontrollsonde wurde genau nach demselben Verfahren hergestellt und verwendet, wie bereits zuvor beschrieben. Für alle in dieser Arbeit hergestellten Northern-Blots wurde dieselbe Sonde als Kontrolle eingesetzt.
Hybridisierungslösung 0,25 M NA2HPO4, pH 7,2 1 mM EDTA, pH 8,0 20 % SDS
0,5 % Blockierungslösung
Waschpuffer 20 mM NA2 HPO4, pH 7,2 (für stringentes Waschen) 200 mM NA2HPO4, pH 7,2 (für nicht stringentes Waschen) 1 mM EDTA, pH 8,0
1 % SDS
Maleinsäurepuffer 0,1 M Maleinsäure 3 M NaCl
0,3 % Tween-20, pH 8,0
Blockierungspuffer 0,1 M Maleinsäure 3 M NaCl
0,3 % Tween-20, pH 8,0 0,5 % Blockierungslösung
Konjugatpuffer Anti-DIG-Antikörper konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) 1:15000
verdünnt in:
1 M Maleinsäure 3 M NaCl
0,3 % Tween-20, pH 8,0 0,5 % Blockierungslösung
Substratpuffer 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5 0,1 M NaCl
50 mM MgCl2