Angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung StrucMed
„Steuerelemente bei der Wanderung dendritischer Zellen:
Funktionelle Untersuchungen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix zu CCR7-Liganden und Lymphknoten-
Stromazellen“
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
II
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 08.01.2020
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns
Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Reinhold Förster Kobetreuer der Arbeit: Prof. Dr. rer. nat. Harald Genth
1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Ulrich Kalinke 2. Referent: Prof. Dr. med. Thomas Werfel
Tag der mündlichen Prüfung: 08.01.2020
Prüfungsausschussmitglieder:
Vorsitz: Prof. Dr. med. Michael Klintschar 1. Prüfer: Prof. Dr. rer. nat. Armin Braun
2. Prüferin: Prof.´in Dr. med. Annette Solveig Debertin
1 EINLEITUNG UND HINTERGRUND ____________________________________ 1
1.1 Dendritische Zellen ... 1
1.1.1 Dendritische Zellen und ihre Funktion im Immunsystem ... 1
1.1.2 Subpopulationen der dendritischen Zellen ... 1
1.1.3 Ontogenese ... 3
1.1.4 Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation ... 6
1.1.5 In vitro Generierung von dendritischen Zellen ... 8
1.1.6 Reifung der konventionellen dendritischen Zellen ... 8
1.1.7 Chemokine, Chemokinrezeptoren und ihr Einfluss auf die Migration von dendritischen Zellen... 9
1.1.8 CCR7 und seine Liganden CCL19 und CCL21 ... 14
1.1.9 Migrationsformen der dendritischen Zellen... 17
1.2 Stromazellen der Lymphknoten ... 18
1.2.1 Reifung der Stromazellen im Rahmen der Lymphknoten-Entwicklung ... 19
1.2.2 Stromazell-Subtypen des Lymphknotens ... 20
1.2.3 Stromazellinteraktionen ... 22
2 ZIEL DER ARBEIT _________________________________________________ 24 3 MATERIALIEN UND METHODEN _____________________________________ 25 3.1 Materialien ... 25
3.1.1 Geräte und Einwegartikel ... 25
IV
3.2.3 Die Gewinnung von Stromazellen aus mesenterischen Lymphknoten ... 34
3.2.4 Splitten, Ernten und Versorgen der Stromazellkultur ... 35
3.2.5 Fluoreszenzmarkierung von dendritischen Zellen ... 36
3.2.6 Behandlung von dendritischen Zellen mit C3-Toxin des Clostridium botulinum . 37 3.2.7 Einfrieren und Auftauen von Knochenmarkszellen und mLNSC ... 37
3.2.8 Durchflusszytometrie ... 38
3.2.9 Ermittlung des Migrationsindex mit einer Boyden-Kammer ... 39
3.2.10 Migrationsexperimente in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 40
3.2.10.1 Konstruktion der Migrationskammer ... 40
3.2.10.2 Anmischung der Kollagenlösung ... 41
3.2.10.3 Fertigstellung des Kollagengels und Befüllung der Migrationskammer ... 41
3.2.11 Auswertung der Time Lapse-Aufnahmen ... 42
3.2.11.1 Auswertung mit CellTracker ... 42
3.2.11.2 Auswertung mit Imaris ... 42
3.2.12 Berechnung des Geradlinigkeitsindex (GI) ... 43
3.2.13 Zur Analyse und Auswertung genutzte Programme ... 44
4 ERGEBNISSE ____________________________________________________ 45 4.1 Die Expression von CCR7 und kostimulatorischen Molekülen auf in vitro differenzierten reifen dendritischen Zellen ... 45
4.2 Der Einfluss der CCR7-Ligandenkonzentration auf die Chemotaxis der dendritischen Zellen in der Boyden-Kammer ... 46
4.3 Der Einfluss der CCR7-Liganden auf die Geradlinigkeit der chemotaktischen Migration von dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 47
4.4 Der Einfluss der CCR7-Liganden auf die Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 50
4.5 Die Kultivierung von Stromazellen ... 52
4.6 Das Verhalten der Stromazellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix... 53
4.8 Der synergistische Einfluss von Stromazellen und CCL19 auf die
Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen ... 57 5 DISKUSSION _____________________________________________________ 63
5.1 Charakterisierung der GMCSF-differenzierten dendritischen Zellen ... 63 5.2 Vorteile der dreidimensionalen Kollagenmatrix gegenüber der Boyden-Kammer für
die Analyse der Chemotaxis ... 64 5.3 Einfluss von CCL19 und CCL21 auf die Geradlinigkeit der DC-Migration in der
dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 65 5.4 Einfluss von CCL19 und CCL21 auf die Migrations-geschwindigkeit der dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 67 5.5 Charakterisierung der isolierten Stromazellen aus neonatalen mesenterischen
Lymphknoten ... 70 5.6 Stromazell-DC-Interaktion und ihr Einfluss auf die Geradlinigkeit der DC-Migration in
der dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 71 5.7 Einfluss der Stromazellen auf die Migrationsgeschwindigkeit der dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix ... 73 6 ZUSAMMENFASSUNG _____________________________________________ 76
VI
11 LITERATURVERZEICHNIS __________________________________________ 85
LEBENSLAUF ________________________________________________________ 94
DANKSAGUNG _______________________________________________________ 95
ERKLÄRUNG NACH § 2 ABS. 2 NR. 6 UND 7 PROMO ________________________ 96
1 Einleitung und Hintergrund 1.1 Dendritische Zellen
1.1.1 Dendritische Zellen und ihre Funktion im Immunsystem
Dendritische Zellen (engl.: dendritic cells, DC) stellen essentielle Akteure des Immunsystems dar. Sie wurden von R.M. Steinman und Z.A. Cohn erstmals 1973 als eine seltene Zellpopulation mit einzigartiger Morphologie in den peripheren lymphatischen Organen der Maus beschrieben (1). R.M. Steinman wurde für diese Entdeckung sowie für seine Forschung über DC und ihre Rolle im Immunsystem 2011 posthum mit dem Nobelpreis für Physiologie oder Medizin geehrt. Ihren Namen verdanken die DC den typischen verzweigten bäumchenartigen Ausstülpungen ihrer Zellmembran und des Zytoplasmas (griech.: dendron = Baum) (1). Sie werden nach Phänotyp, Funktion, Ontogenese und Lokalisation in unterschiedliche Subtypen bzw. Vorstufen eingeteilt (2).
Die Hauptfunktion der DC besteht darin, Antigene aus ihrer Umgebung aufzunehmen, zu prozessieren und auf ihrer Zelloberfläche zu präsentieren. Im Vergleich zu den anderen Antigen-präsentierenden Zellen wie B-Zellen, Monozyten und Makrophagen stellen die DC die effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen dar. Dies ist einer der Gründe, warum sie eine essentielle Rolle bei der Induktion und Regulation der adaptiven Immunantwort spielen. Weiterhin beeinflussen sie die Bildung und den Erhalt der Immuntoleranz gegenüber körpereigener und körperfremder nicht-pathogener Proteine durch die Suppression bereits aktivierter T-Zellen und der Aktivierung regulatorischer T-Zellen (3–5).
Dendritische Zellen werden ihrerseits durch Zytokine, Chemokine und membranständigen Molekülen anderer Zellen in ihrer Funktion beeinflusst.
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der Mukosa im Respirationstrakt und im Gastrointestinaltrakt. Diese Subpopulationen haben unterschiedliche organspezifische Funktionen, die durch umgebungsabhängige Co- Stimulatoren und Zytokine beeinflusst werden. Abgesehen von diesen milieuspezifischen Merkmalen gleichen sie sich in wesentlichen Eigenschaften wie der Fähigkeit zur Antigenaufnahme und Präsentation von peptidbeladenen MHC-II Molekülen (engl.: major histocompatibility complex, MHC) (6).
DC können in konventionelle DC (engl.: conventional dendritic cells, cDC) und in nicht- konventionelle dendritische Zellen unterteilt werden. Die cDC werden wiederum in stationäre und migratorische cDC gegliedert.
Die migratorischen cDC sind vorwiegend in peripheren Geweben wie der Haut, dem Darm-Trakt, der Lunge, der Niere und der Leber lokalisiert. Charakteristisch ist ihre ausgeprägte Fähigkeit zur Antigenaufnahme und anschließende Wanderung über die Lymphgefäße in die drainierenden lymphatischen Organe (7). Die im Lymphgewebe stationären cDC werden auch residente cDC oder lymphoide cDC genannt und sind in allen lymphatischen Organen einschließlich der Milz im unreifen Zustand lokalisiert. Die stationären cDC haben zum einen Einfluss auf die peripheren Mechanismen der Toleranzentwicklung. Zum anderen sind sie im reifen, aktivierten Zustand unter dem Einfluss einer bakteriellen oder viralen Infektion in der Lage, Lymphozyten effektiv zu stimulieren sowie Zytokine auszuschütten und somit der Immunabwehr zu dienen (2,7).
Zu den nicht-konventionellen DC zählt man die plasmazytoiden DC (engl.: plasmacytoid dendritic cells, pDC), die heterogene Population der von Monozyten abstammenden DC und die Langerhans-Zellen (engl.: Langerhans cells, LC), wobei die LC eine Sonderstellung einnehmen, auf die im Verlauf noch eingegangen wird. Die pDC werden in vielen Geweben, einschließlich Blut, Knochenmark, Thymus, Leber und lymphatischen Organen nachgewiesen. Die charakteristische Eigenschaft der pDC ist die Ausschüttung von großen Mengen an Typ-I-Interferon bei der viralen Infektion (8,9). Die pDC steigern im aktivierten Zustand deutlich die Expression von MHC-I, MHC-II sowie kostimulatorischen Molekülen, weshalb diskutiert wird, ob sie das Potential zur Aktivierung von Lymphozyten besitzen (2,9). Außerhalb eines infektiösen Geschehens spielen die pDC eine wichtige Rolle bei der Toleranzinduktion (7,10).
Die von den Monozyten abstammenden DC (engl.: monocyte-derived DC, moDC) können in peripheren Geweben wie der Haut, der Lunge, dem Darm oder der Niere gefunden
werden. Sie haben ebenfalls die Fähigkeit zur Antigenaufnahme. Viele Studien deuten darauf hin, dass moDC nicht oder nur sehr eingeschränkt vom peripheren Gewebe in die drainierenden Lymphknoten wandern, und sie ihre Funktion hauptsächlich lokal im peripheren Gewebe erfüllen (11). Die moDC, die man bei Entzündung im Lymphknoten findet, sind wahrscheinlich aus dem Blut in die Lymphknoten eingewandert (12). Die von myeloiden Vorläuferzellen und Makrophagen/DC-Vorläuferzellen (engl.: macrophage-DC progenitor, MDP) stammenden Monozyten differenzieren sich unter dem Stimulus einer bestehenden Entzündung oder Infektion in moDC. Da der inflammatorische Reiz ein grundlegender Faktor für die Bildung der moDC ist, werden sie auch inflammatorische DC genannt. Hierzu zählen auch die TipDC (TNF-α/ iNOS-produzierende DC). In der Lunge konnten kleine Populationen an moDC identifiziert werden, die sich auch ohne eine Entzündung oder Infektion aus Monozyten differenzieren und somit eine Ausnahme darstellen (7,11). Die phänotypische Abgrenzung der moDC von cDC erweist sich als schwierig, da sie beide ähnliche Expressionsmuster der Oberflächenmoleküle aufweisen (7,9).
LC unterscheiden sich durch einige zellspezifische Charakteristika von cDC aber auch von anderen nicht-konventionellen DC. Im nicht-aktivierten Zustand sind sie in der Epidermis lokalisiert, spielen eher eine immunregulatorische Rolle und reproduzieren sich durch lokale Proliferation. Im Zuge eines inflammatorischen Reizes exprimieren die LC verstärkt MHC-II und CCR7 an ihrer Zelloberfläche. Dadurch werden sie in die Lage versetzt, in den drainierenden Lymphknoten einzuwandern und naive T-Zellen zu stimulieren (7,9,13,14).
Die genannten wesentlichen Untergruppen der DC weisen ihrerseits verschiedene Subtypen mit voneinander abgegrenzten Funktionen und Lokalisationen auf. Zur Differenzierung dienen unter anderem die individuell exprimierten Oberflächenmoleküle.
Diese Protein-Marker werden auf der Plasmamembran der Zellen exprimiert und durch
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common myeloid precursors, CMP) abstammen (9,15). Eine weitere davon abweichende Theorie besagt, dass neben den CMP auch die gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (engl.: common lymphoid progenitors, CLP) das Potential besitzen, sich in DC zu differenzieren (2,10). Darüber hinaus gibt es noch die These, dass einzelne Zellen zu unterschiedlichen Stadien der Hämatopoese in der Lage sind, DC-Subpopulationen zu generieren. Zum Bespiel wurde in Transferexperimenten gezeigt, dass sich unmittelbare Vorstufen der pDC, abhängig von ihrer Gewebelokalisation, in konventionelle dendritische Zellen differenzieren können (10). Dies impliziert ein dynamisches Model der DC- Generierung, ganz im Gegensatz zu dem bis dato hauptsächlich vertretenen klassischen verzweigten Modell der Hämatopoese (2). Über die Differenzierungswege der so heterogenen und zahlreichen DC-Populationen wird noch diskutiert. Die Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Abstammung der DC der Maus.
Im Folgenden wird auf die Ontogenese der wesentlichen Untergruppen der DC eingegangen. Alle DC gehen aus gemeinsamen hämatopoetischen Stammzellen (engl.:
hematopoietic stem cells, HSC) des Knochenmarkes hervor. Von der HSC ausgehend entwickeln sich die gemeinsamen myeloischen und lymphatischen Vorstufen (Abb. 1).
Mittels Transferexperimenten wurde festgestellt, dass beide Vorstufen das Potenzial besitzen, cDC zu generieren. Allerdings wird davon ausgegangen, dass unter homöostatischen Bedingungen fast alle cDC von CMP abstammen (9). Die Granulozyten- Makrophagen-Vorläuferzellen, welche sich aus den CMP entwickeln, differenzieren sich im weiteren Verlauf zu MDP. Aus diesen gemeinsamen Vorläuferzellen der Makrophagen und DC entwickeln sich Monozyten und gemeinsame DC-Vorläufer (engl.: common dendritic cell progenitors, CDP). Die pDC Vorläuferzellen (engl.: pDC precursors, pre-pDC) sowie die cDC Vorläuferzellen (engl.: precursor cDC, pre-cDC) gehen ihrerseits aus den CDP hervor. Diese unmittelbaren Vorstufen der pDC und cDC wandern über die Blutbahn in die peripheren lymphatischen oder nicht-lymphatischen Gewebe, wobei sie nur eine kurze Zeit im Blut zirkulieren (10,13). Auf diesem Weg und an ihrem Bestimmungsort vollziehen sie, unter dem Einfluss von gewebespezifischen Transkriptionsfaktoren, eine weitere Differenzierung in die verschiedenen stationären und migratorischen cDC-Subtypen. Die im Lymphgewebe stationären cDC differenzieren sich so beispielsweise über eine spezifische Population von pre-cDC. Die cDC weisen eine kurze Halbwertszeit von
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pre-pDC, pre-cDC oder direkt pDC hervor (10). Die pre-cDC, als unmittelbare Vorstufe der cDC, wandern über die Blutbahn in die peripheren lymphatischen oder nicht-lymphatischen Gewebe (10,13). Dort erfolgt die weitere Differenzierung in cDC-Subtypen (7). Monozyten differenzieren unter dem Stimulus einer bestehenden Entzündung oder Infektion in moDC (Grau hinterlegt) (7,9). Die epidermalen Langerhans- Zellen (LC) differenzieren aus myeloischen Vorläuferzellen, die in der frühen embryonalen und späten fetalen Phase die Haut besiedeln (gestrichelter Pfeil). Unter homöostatischen Bedingungen reproduzieren sie sich durch eine lokale Proliferation. Unter inflammatorischen Bedingungen differenzieren sie sich hingegen auch aus Monozyten (Grau hinterlegt) (14). HSC: hämatopoetische Stammzelle; CLP:
lymphatische Vorläuferzelle; CMP: myeloide Vorläuferzelle; GMP: Granulozyten-Makrophagen- Vorläuferzelle; MEP: Megakaryozyten erythroide Vorläuferzelle; MDP: Makrophagen/DC-Vorläuferzelle;
CDP: DC-Vorläuferzelle; pDC: plasmazytoide DC; cDC: konventionelle DC; moDC: von Monozyten abstammende DC; LC: Langerhans-Zelle. (Abbildung wurde modifiziert mit Erlaubnis der Verlage; Copyright 2014: Chistiakov et al. 2014 und Copyright 2010: Liu & Nussenzweig 2010 (10,13))
1.1.4 Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation
Es bestehen verschiedene Mechanismen der Antigenaufnahme. Eine Möglichkeit der Antigenaufnahme ist die rezeptorvermittelte Phagozytose. Hierbei werden umfangreiche Partikel über große Vesikel in die Zelle aufgenommen. Dies geschieht über die Bindung an spezifische Rezeptoren, wie z.B. an den Opsonine-abhängigen Fc-Rezeptor, den Opsonine-unabhängigen Mannose-Rezeptor, den Lectin-Rezeptor DEC205 oder den sogenannten scavenger-Rezeptoren. Binden die Partikel an einen der genannten Rezeptoren, erfolgt die Ausbildung von Pseudopodien der Zellwand. Diese umschließen die größeren Partikel wie Bakterien oder apoptische Zellen und nehmen sie in Phagosomen auf (17).
Die Pinozytose stellt eine unspezifische Aufnahme von extrazellulären Antigenen dar, wobei zwischen Mikropinozytose und Makropinozytose unterschieden wird. Bei der Mikropinozytose, zu der grundsätzlich alle Zellen fähig sind, handelt es sich um die Aufnahme von Flüssigkeit und in Flüssigkeit gelösten Antigenen geringen Ausmaßes (≤0.1 µm) durch kleine mit Clathrin bedeckte Vesikel. Als Makropinozytose hingegen bezeichnet man die Aufnahme von großen Flüssigkeitsvolumina und darin gelösten Antigenen, die eine Größe von 0.5 – 3 µm besitzen. Zur Makropinozytose sind nur einige Zelltypen fähig, darunter auch unreife DC. Hierbei bilden diese Zellmembranausstülpungen unter der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts (18).
Für die weitere Prozessierung und die letztendliche Antigenpräsentation ist es von Bedeutung, über welchen Mechanismus und welchen Rezeptor das Antigen aufgenommen wurde. In der Regel wird das durch Pinozytose aufgenommene Antigen über MHC-II-Moleküle den CD4+ T-Zellen dargeboten (19). Phagozytose, die abhängig ist vom Fc-Rezeptor (20), scavenger-Rezeptoren (19) oder DEC205 (21), dient ebenfalls der MHC-II assoziierten Antigenpräsentation. Hingegen werden die über den Mannose- Rezeptor aufgenommenen Antigene in ein frühes Endosom eingeschleust und anschließend die Peptide an MHC-I-Molekülen gebunden (19). Auf der Zelloberfläche angelangt, dient das beladene MHC-I-Molekül der Aktivierung von CD8+T-Zellen (19). Das heißt, die DC kann je nach Aufnahmemechanismus Peptide über MHC-II oder über MHC-I präsentieren. Steht die Antigenpräsentation im MHC-II-Kontext, so führt dies zu einer T- Helferzell-Antwort. In Verbindung mit MHC-I kommt es zur zytotoxischen CD8-T-Zell- Antwort. Im Allgemeinen werden auf MHC-I-Molekülen zytosolisch vorliegende Proteine wie virale, bakterielle oder endogene Proteine präsentiert. Die Fähigkeit der DC zytotoxische CD8-T-Zellen zu aktivieren, ohne selbst mit dem Pathogen befallen zu sein, nennt man cross-Präsentation (22).
Neben der Mannose-Rezeptor vermittelten Antigenaufnahme gibt es zwei weitere Mechanismen der cross-Präsentation. Heath et al. (2004) haben gezeigt, dass die Aufnahme des Antigens in ein Endosom und anschließend der Transfer in das Zytosol erfolgen kann. Ist das Antigen im Zytosol, wird es auf dem gleichen Weg wie zytosolische Fremdproteine verarbeitet, d.h. über Proteasome prozessiert und durch Antigenpeptid- Transporter (engl.: Transporter associated with antigen processing; TAP) in das endoplasmatische Retikulum (ER) geschleust. Dort wird es auf MHC-I-Moleküle geladen und auf der Zelloberfläche präsentiert (23).
Guermonprez et al. (2003) gehen in ihrem Model zur cross-Präsentation davon aus, dass
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MHC-Moleküle der Klasse I und II werden im rauen ER produziert. Hier ist das MHC-II- Molekül im Gegensatz zum MHC-I-Molekül nicht in der Lage, Peptide zu binden, da dies durch eine MHC-Klasse-II-assoziierte invariante Kette (=Polypeptid) verhindert wird.
Gelenkt durch dieses Polypeptid gelangt das MHC-II-Molekül über den Golgi-Apparat in Endosome und schließlich in Lysosome. Hier findet, nach einer schrittweisen Spaltung der invarianten Kette, die Beladung des Moleküls mit Peptiden statt. Diese Peptide stellen nicht ausschließlich zellfremde Pathogene dar. Es sind ebenfalls zelleigene zytosolische Peptide vertreten, die an MHC-II-Molekülen gebunden werden und somit, über den physiologischen Stoffwechselweg der Autophagie, in das saure Milieu dieser spezifischen Organellen gelangen. Der gebildete MHC-II-Antigen-Komplex wird schlussendlich zur Präsentation an die Zelloberfläche transportiert (25).
1.1.5 In vitro Generierung von dendritischen Zellen
Nach der Erstbeschreibung der DC durch R. M. Steinman und Z. A. Cohn (1973) war es erst mit der Etablierung eines Protokolls zur in vitro Generierung von DC möglich, ausführliche Charakterisierungen und umfassende Studien zur Funktionalität dieser Immunzellpopulation durchzuführen. DC waren bis dato nur schlecht analysierbar, da sie in allen Körpergeweben selten sind und damit die Isolationsverfahren zeitaufwendig waren und die Zellausbeute niedrig blieb. Dank der in vitro Generierung von DC aus Monozyten als Vorläuferzellen, hatte man nun genügend DC zur Verfügung, um umfangreiche Analysen durchzuführen und einen Einblick in die Funktion der DC im Rahmen der Steuerung von Immunantworten zu gewinnen. Mit den aktuell etablierten Verfahren ist es möglich, aus dem Knochenmark einer Maus bis zu 108 dendritische Zellen zu gewinnen (26). Es werden hierbei DC aus isolierten multipotenten Knochenmarkszellen mit Hilfe des Granulozyten-Macrophagen-Koloniestimulierenden Faktors (GM-CSF) differenziert (27).
1.1.6 Reifung der konventionellen dendritischen Zellen
Da sich diese Arbeit inklusive der Experimente ausschließlich auf cDC der Maus beziehen, wird in diesem Teil hauptsächlich auf die cDC eingegangen.
In Abwesenheit von Entzündung oder Infektion befinden sich cDC in einem sogenannten unreifen Stadium. In diesem Zustand besitzen sie eine große Kapazität zur Antigenaufnahme (18). Sind keine pathogenen Antigene in der Umgebung vorhanden,
internalisieren, prozessieren und präsentieren die cDC körpereigene Antigene. Dabei modulieren sie die Qualität der T-Zellantwort so, dass diese tolerant ist, z.B. durch den Mechanismus der sogenannten Anergie (28). Somit dienen unreife cDC der Immuntoleranz. Unreife cDC sind vor und unmittelbar nach der Aufnahme von körperfremdem Antigen nicht in der Lage, naive T-Zellen effektiv zu stimulieren, da sie nur geringe Mengen an MHC-Proteinen und kostimulierenden B7-Molekülen (CD80, CD86) exprimieren. Durch die Aufnahme von körperfremdem Antigen sowie durch die Anwesenheit von Entzündungssignalen, wie mikrobiellen Produkten und proinflammatorischen Zytokinen, wird ein Reifungsprozess der cDC mit funktionellen und morphologischen Veränderungen initialisiert (29). Dieser Prozess wird durch die Stimulation von Toll-like-Rezeptoren sowie durch proinflammatorische Mediatoren, wie Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor (TNF), ausgelöst (30,31). Die Oberflächenexpression von MHC-II-Molekülen und kostimulatorischen Molekülen wie CD80 und CD86 wird verstärkt sowie die lysosomale Antigenprozessierung gesteigert.
Weiterhin wird die Freisetzung von Zytokinen erhöht und der Chemokinrezeptor CCR7 vermehrt exprimiert, welcher der cDC eine zielgerichtete Migration in das sekundäre lymphatische Gewebe ermöglicht, wo nun die reife cDC in der Lage ist, naive T-Zellen zu aktivieren.
Der Prozess der Reifung kann auch durch eine E-cadherin vermittelte DC-DC-Interaktion ausgelöst werden (30). Dies geschieht allerdings ohne Exposition gegenüber mikrobiellen Produkten oder entzündlichen Mediatoren. Die so induzierte DC-Reifung beinhaltet die Hochregulierung von kostimulatorischen Molekülen, MHC-II-Molekülen und Chemokinrezeptoren. Allerdings können die auf diese Weise stimulierten DC keine immunstimulatorischen Cytokine freisetzen. Diese DC lösen ein T-Zellantwort aus, infolge deren T-Zellen mit einem regulatorischen Phänotyp generiert werden (30).
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unterschiedliche Chemokinrezeptoren. Mit deren Hilfe reagieren sie auf eine Vielzahl von Liganden, die ihre Migration beeinflussen. Eine Übersicht zu den bekannten Chemokinrezeptoren und ihren Liganden ist in Tabelle 1 dargestellt.
Chemokinrezeptoren gehören zu der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und bestehen aus einem extrazellulären, Liganden bindenden N-Terminus, sieben Transmembrandomänen sowie einem intrazellulären C-Terminus (30,32). Die an diese Rezeptoren bindenden Liganden nennt man chemotaktisch wirksame Zytokine, kurz Chemokine. Durch die Bindung an ihre Rezeptoren beeinflussen Chemokine das Migrationsverhalten. Sie werden von unterschiedlichsten Arten an Leukozyten als auch von Zelltypen nicht-hämatopoetischen Ursprungs, wie beispielsweise Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, Astrozyten und Epithelzellen sezerniert (30,33).
Basierend auf der Anzahl und des Abstands der Cysteine in der N-terminalen Aminosäuresequenz werden die Chemokine in verschiedene Gruppen eingeteilt. CXC- und CC-Chemokine sowie CX3CL1 besitzen jeweils vier Cysteine, wobei die zwei N- terminalen Cysteine bei den CXC-Chemokinen durch eine Aminosäure, bei CX3CL1 durch drei Aminosäuren und bei den CC-Chemokinen durch keine Aminosäure getrennt werden.
Die Chemokine XCL1 und XCL2 besitzen nur zwei N-terminale Cysteine (33).
Einige Chemokine, wie zum Beispiel CCL2, CCL3, CCL4 und CCL5 sind induzierbare Chemokine. Sie werden bei Entzündungsprozessen ausgeschüttet, daher nennt man sie auch inflammatorische Chemokine. Demgegenüber stehen die konstitutiven Chemokine, oder auch homöostatischen Chemokine genannt, die kontinuierlich gebildet werden (34,35).
Zudem gibt es eine Sondergruppe der Chemokinrezeptoren, die nach der Bindung eines Chemokins einen Arrestin-abhängigen Signalweg initialisieren. Sie weisen strukturelle Gemeinsamkeiten mit den klassischen Rezeptoren auf und binden ihre Liganden auch mit hoher Affinität, lösen in der Regel aber keine Migration aus. Sie sind auch nicht zur Signalweiterleitung über G-Proteine befähigt, sondern führen scheinbar eher zu einer Modulierung der Chemokin-Gradienten und Dämpfung der Entzündungsreaktionen durch das Abfangen von Chemokinen (36). Aus diesem Grund werden diese Rezeptoren unter anderem „Scavenger“ oder „Chemokin bindende Proteine“ genannt. Zu dieser Gruppe der atypischen Chemokinrezeptoren werden bisher sechs Rezeptoren gezählt (32).
Jede DC-Subpopulation exprimiert je nach Umgebung, Funktion und Reifestadium ein spezifisches Spektrum an Chemokinrezeptoren (34). Unreife cDC und Vorläuferzellen nutzen Chemokinrezeptoren, wie z.B. CCR2 oder CCR6, um in nicht-lymphoide periphere Gewebe einzuwandern und dort zu navigieren (37). Durch den Prozess der DC Reifung erfolgt eine Änderung in der Expression von Chemokinrezeptoren und Adhäsionsmolekülen. Chemokinrezeptoren, welche zuvor das Migrationsverhalten der unreifen cDC steuerten, werden herunter reguliert und CCR7 verstärkt exprimiert (37). Die zwei Chemokine CCL19 und CCL21 binden an CCR7 und bilden einen Gradienten, der die gezielte Migration der cDC aus dem peripheren Gewebe bis in die T-Zellzone der Lymphknoten steuert (36,38). Ferner konnte gezeigt werden, dass die Motilität und Migrationsgeschwindigkeit der DC abhängig von CCR7-Liganden stimuliert wird (39,40).
Auch die Lokalisierung der stationären cDC innerhalb der lymphatischen Gewebe ist scheinbar an CCR7 gebunden (9).
Tabelle 1: Chemokinrezeptoren und ihre Chemokine
Rezeptoren Chemokine mit ihren Synonymen Zelltypen
CC-Chemokine
CCR1 CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL 8 (MCP-2), CCL 13 (MCP-4), CCL14 (HCC-1), CCL16 (LEC), CCL15(HCC-2), CCL23 (MPIF-1)
DC, Monozyten, Makrophagen, neutrophile & basophile Granulozyten, TH1-Lymphozyten, T-Gedächtniszellen,
nicht-hämatopoetische Zellen
CCR2 CCL2 (MCP-1), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2), CCL13 (MCP-4), CCL16 (LEC)
unreife DC, Monozyten, Makrophagen, basophile Granulozyten, TH1-Lymphozyten, natürliche Killerzellen
CCR3 CCL11 (Eotaxin), CCL7 (MCP-3), CCL5 (RANTES), CCL13 (MCP-4), CCL4 (MIP-1β), CCL15 (HCC-2), CCL24 (Eotaxin-2), CCL26 (Eotaxin-3), CCL28 (MEC)
DC, Mastzellen, TH2-Lymphozyten, Mikrogliazellen, Plasmazellen, nicht-hämatopoetische Zellen, eosinophile
& basophile Granulozyten
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CCR7 CCL19 (ELC), CCL21 (SLC) reife DC, Thymozyten, B-Lymphozyten, zentrale Gedächtnis-T-Zellen, naive T-Zellen,
CCR8 CCL1 (I-309), CCL18 (PARC) DC, TH2-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Haut ansässige CD4 Gedächtnis-T-Zellen, Thymozyten, CD8- &
γδ-T-Lymphozyten, regulatorische T-Zellen, nicht- hämatopoetische Zellen
CCR9 CCL25 (TECK) Thymozyten, Darm ansässige T-, B-Lymphozyten & DC,
pDC
CCR10 CCL27 (ILC), CCL28 (MEC) Haut ansässige T-Zellen, IgA+ Plasmablasten,
Fibroblasten sowie Endothelzellen und Melanozyten der Haut, Karzinom
CXC-Chemokine
CXCR1 CXCL5 (ENA78), CXCL8 (IL-8), CXCL6 (GCP2) DC, Monozyten, neutrophile & basophile Granulozyten, natürliche Killerzellen, Mastzellen, CD8T-Lymphozyten, regulatorische T-Zellen, Endothelzellen, Karzinom
CXCR2 CXCL8 (IL-8), CXCL1 (GROα), CXCL2 (GROβ), CXCL3, (GROγ), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GLP2), CXCL7 (PPBP)
DC, neutrophile & basophile Granulozyten, Monozyten, natürliche Killerzellen, Mastzellen, T-Lymphozyten, Endothelzellen, Karzinom
CXCR3 CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC), CXCL4 (PF4), CXCL4L1 (PF4V1)
pDC, TH1-Lymphozyten, basophile Granulozyten, regulatorische T-Zellen, CD8T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen, natürliche Killer-T-Zellen
CXCR4 CXCL12 (SDF-1) nicht-hämatopoetische Zellen und die meisten Leukozyten
CXCR5 CXCL13 (BLC) B-Lymphozyten, CD8T-Lymphozyten, follikulärer T-
Helferzellen
CXCR6 CXCL16 (SR-PSOX) TH1- & TH17-Lymphozyten, γδ-T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen, natürliche Killer-T-Zellen, Plasmazellen, Karzinom
? CXCL14 (BRAK) und CXCL17 (DMC)
CX3C-Chemokin
CX3CR1 CX3CL1 (Fraktalkin) DC, residente Monozyten, Makrophagen, TH1-
Lymphozyten, γδ-T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen, zytotoxische T-Zellen, Mikrogliazellen, Nervenzellen
XC-Chemokin
XCR1 XCL1 (Lymphotactin), XCL2 (SCM-1β) „Cross-präsentierende“ CD8+ DC, DC des Thymus
Atypische Chemokinrezeptoren ACKR1
(DARC)
CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL11,
CCL2, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL14, CCL17
Erythrozyten, Purkinjezellen des Kleinhirns, Endothelzellen von Venolen und kleine Venen, Nervenzellen,
lymphatische Endothelzellen,
ACKR2 (D6)
CCL8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL14, CCL17, CCL22
Gewebe die eine "Barriere" bilden wie Haut, Darm, Lunge und Plazenta; DC, einige Leukozyten, B-Lymphozyten, lymphatische Endothelzellen
ACKR3 (CXCR7)
CXCL11, CXCL12 B-Lymphozyten, AV Endothelzellen, SC, Karzinom,
Nervenzellen, hämatopoetische Zellen, Mesenchymzellen
ACKR4 (CCRL1)
CCL19, CCL21, CCL25 Lunge, Darm, Lymphknoten
CCRL2 (ACKR5)
CCL19 viele Leukozyten
PITPNM3 (ACKR6)
CCL18 DC, Monozyten, Makrophagen
Dargestellt sind die aktuell bekannten Chemokinrezeptoren, inklusive der atypischen Rezeptoren, mit ihren Liganden und den Rezeptoren exprimierenden Zellen. CXCL14 (BRAK) und CXCL17 (DMC) sind Liganden, deren bindender Rezeptor noch nicht eindeutig identifiziert werden konnte. Die endgültige Bestätigung, dass PITPNM3 der sechste atypische Chemokinrezeptor ist, steht bis dato noch aus (32,41).
Abkürzungen: TH1: T-Helferzellen vom Typ1; TH2: T-Helferzellen vom Typ2; MIP: Makrophagen-inflammatorische Protein (macrophage inflammatory protein); MCP: Monozyten anziehendes Protein (monocyte chemoattractant protein); HCC: Hemofiltrate CC-Chemokine; TARC: Thymus und Aktivierung regulierendes Chemokin (thymus and activation-regulated chemokine); MDC:
Makrophagen abstammendes Chemokin (macrophage-derived chemokine); LARC: Leber und Aktivierung regulierendes Chemokin (liver and activation-regulated chemokine); ELC: Epstein-Barr 1-Ligand Chemokin; SLC: sekundäres Lymphgewebs-Chemokin (secondary lymphoid-tissue chemokine); TECK: im Thymus exprimiertes Chemokin (thymus-expressed chemokine); CTACK:
kutanes T-Zell anziehendes Chemokin (cutaneous T-cell-attracting chemokine); MEC: Schleimhaut assoziierte epitheliale Chemokine (mucosae associated epithelial chemokine); GCP: Granulozyten-Chemotaxis-Protein (granulocyte chemotactic protein);
GRO: wachstumsregulatorisches Onkogen (growth-regulated oncogene); ENA: von Epithelialzellen abstammendes neutrophiele Granulozyten aktivierendes Protein (epithelial-cell-derived neutrophil-activating peptide); MIG: durch Interferon-γ induziertes Monokin (monokine induced by interferon-γ); IP-10: Interferon induzierbares Protein 10 (interferon-inducible protein 10); I-TAC: Interferon induzierbarer α-T-Zell-Lockstoff (interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant); PF: Thrombozyten-Faktor (platelet factor); SDF:
von Sromazellen abstammender Faktor (stromal-cell-derived factor);SR-PSOX: spezieller Rezeptor für Phosphatidylserin beladene oxidierte Lipide (scavenger receptor for phosphatidylserine-containing oxidized lipids); ACKR: atypische Chemokinrezeptoren (atypical chemokine receptor); RANTES: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted; MPIF-1: myeloische Progenitorinhibitorfaktor-1 (myeloid progenitor inhibitory factor 1); LEC: Leber-Chemokin (liver-expressed chemokine); Eotaxin:
spezifisch auf eosinophile Zellen wirkendes C-Chemokin; PARC: pulmonary and activation-regulated chemokine; IL: Interleukin; ILC:
interleukin-11 receptor alpha-locus chemokine; ENA78: epitheliales Neutrophilen-aktivierendes Protein 78; GLP2: Glucagon-like Peptid 2; PPBP: Pro-Platelet Basic Protein; BLC: B-Zellen rekrutierendes Chemokin (B lymphocyte chemoattractant); BRAK: "Brust- und Nieren-" Chemokin („Breast and kidney“-Chemokine); DMC: dendritische Zellen und Monozyten anziehendes Chemokin-
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14
1.1.8 CCR7 und seine Liganden CCL19 und CCL21
Analog zu den Chemokinen können die Chemokinrezeptoren in homöostatische und inflammatorische Chemokinrezeptoren unterteilt werden. Inflammatorische Chemokin- rezeptoren binden induzierbare Chemokine, die homöostatischen Chemokinrezeptoren hingegen konstitutive Chemokine. Die homöostatischen Chemokinrezeptoren, wie CCR7, CXCR4 und CXCR5 steuern die Migration und Rezirkulation von Leukozyten in sekundäre und primäre lymphatische Organe. CCR7 nimmt hierbei eine besondere Rolle ein, da er ein ausschlaggebendes Element in Bezug auf die Organisation der primären Immunantwort darstellt, zum anderen die adaptive Antwort des Immunsystems reguliert (38) und außerdem auch einen bedeutender Faktor für die Induktion und den Erhalt der Immuntoleranz darstellt (42). Maßgeblich hierfür sind die umfangreichen und essenziellen Funktionen des CCR7 und seiner Liganden. Hierzu zählt die Regulation des „Homing“ der T-Zellen über die hochendothelialen Venolen in den Lymphknoten (43,44), die funktionelle Organisation der sekundären lymphatischen Organe (45), die Steuerung des Aufbaus und der Funktion des Thymus (46), sowie die Regulierung der DC-Migration über afferente Lymphgefäße in den Lymphknoten unter inflamatorischen Bedingungen als auch in Abwesenheit von entzündlichen oder infektiösen Prozessen (46). CCR7 wird von allen naiven T-Zellen, einigen T-Gedächtniszellen, B-Zellen und reifen, aktivierten DC exprimiert (47).
Nur die zwei konstitutiven Chemokine CCL19 und CCL21 binden am CCR7. CCL19 wird von fibroblastischen Retikulumzellen (engl.: fibroblastic reticular cells; FRC) der T-Zellzone in Lymphknoten, der Milz und den Peyer-Plaques sowie von Endothelzellen der afferenten Lymphgefäße exprimiert (32,44).
Von CCL21 kommen zwei funktionale Varianten in der Maus vor, die sich durch eine Aminosäure an Position 65 des CCL21-Proteins unterscheiden (48). CCL21-Leu enthält Leucin, während CCL21-Ser Serin enthält. Die beiden Varianten des CCL21 werden an unterschiedlichen Orten exprimiert, wobei man CCL21-Ser in lymphatischen Organen wie Thymus, Milz oder Lymphknoten vorfindet und CCL21-Leu in lymphatischen Gefäßen von nicht-lymphatischen Organen wie Darm, Haut oder Lunge. In den sekundären lymphatischen Organen wird CCL21 von FRC und hochendothelialen Venolen (HEV) exprimiert (46).
CCL21 kann mit seiner erweiterten C-terminalen Domäne an Glykosaminoglykane binden, die auf Zelloberflächen oder in der extrazellulären Matrix vorkommen. Dies ist entscheidend, um lokal hohe Konzentrationen zu erreichen und somit die Haptotaxis zu steuern. CCL19 fehlt diese verlängerte basische C-terminale Domäne und erzeugt somit als freies bzw. ungebundenes Chemokin einen Konzentrationsgradienten für die Chemotaxis (32).
Die G-Protein-abhängige Signalübertragung infolge der Bindung von CCL19 oder CCL21 an CCR7 wird durch die Dissoziation des heterotrimeren G-Proteins in seine Untereinheiten, dem α-Monomer und dem βγ-Dimer, initialisiert (49). CCR7 ist in der Lage, auch G-Protein-unabhängige Mechanismen zu nutzen, um ein intrazelluläres Signal zu vermitteln. Bei dieser Art der Signaltransduktion sind β-Arrestine maßgeblich beteiligt. Sie dienen in diesem Kontext als multifunktionelle Adapterproteine und rekrutieren Signalmoleküle zum Rezeptor (50). CCR7 steuert durch drei voneinander unabhängige Signalwege die Überlebenszeit, die Migrationsgeschwindigkeit und die Chemotaxis (Abb.
2). Diese Signalwege werden über das Gi- sowie das G12-Proteinreguliert (49).
Die Steuerung der Chemotaxis erfolgt über eine Gi-Protein-abhängige Signalkaskade im Zusammenspiel mit Signalmolekülen, die zur Familie der mitogenaktivierten Proteinkinasen gezählt werden. Dazu gehören die extrazellulären Signalbezogenen Kinasen 1 und 2 (Erk1/2), die c-Jun-N-terminale Kinase (JNK) und p38-mitogenaktivierte Proteinkinase (p38). Die Überlebenszeit der Zelle wird über den Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) /Proteinkinase B (Akt) -Signalweg und in dessen Folge über den nukleären Transkriptionsfaktor κB (NF-κB) reguliert. Das Kinasepaar PI3K/Akt wird wiederum durch das dissoziierte βγ-Dimer des Gi-Proteins induziert. Die Migrationsgeschwindigkeit wird durch eine Signalachse ausgehend vom G12-Protein gesteuert. Zu den intrazellulären Signalmolekülen, die auf diesen Weg über CCR7 aktiviert werden, gehören neben den
und der Überlebenszeit erfolgt über eine Gi-Protein-abhängige, die der Migrationsgeschwindigkeit über eine G12-Protein-ahängige Signalkaskade. Über diese Wege werden weitere intrazelluläre Signalmolekülen aktiviert. Erk1/2: extrazelluläre Signalbezogene Kinasen 1 und 2; JNK: c-Jun-N-terminale Kinase; p38: p38- mitogenaktivierte Proteinkinase; PI3K: Phosphoinositid-3-Kinase; Akt: Proteinkinase B; NF-κB: nukleärer Transkriptionsfaktor κB; Rho (Ras homolog), Cdc42 und Rac = kleine GTPasen; Src (sarcoma):
Tyrosinkinase Src; Pyk2: prolinreiche Tyrosinkinase 2. (Abbildung wurde modifiziert mit Erlaubnis des Verlages; Copyright 2006: The American Association of Immunologists, Inc.) Quelle: (49,50)
1.1.9 Migrationsformen der dendritischen Zellen
Die Annahme, dass sich DC ausschließlich mit Hilfe Integrin-vermittelter Adhäsion fortbewegen, wurde durch Lämmermann et al. (2008) widerlegt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass zwischen der Integrin-abhängigen und der Integrin-unabhängigen Migration der DC unterschieden werden muss (55).
Integrine sind Transmembranproteine, welche an gewebsspezifische Liganden, wie vaskuläres Adhäsionsmolekül (VCAM), intrazelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), Fibronectin oder Kollagen binden. DC exprimieren mehrere Integrin-Untereinheiten wie ß1, ß2, ß7 und αv. Mit Hilfe dieser Transmembranproteine besitzen die DC die Fähigkeit, an Endothelzellen zu adhärieren und durch die Gefäßwand zu wandern (56). Dies findet hauptsächlich in den postkapillaren Venolen nicht-lymphatischer Gewebe statt und erfolgt in mehreren Schritten als sogenannte Adhäsionskaskade. Zunächst exprimieren die durch IL-1 und TNFa aktivierte Endothelzellen E- und P-Selektin. An diesen endothelialen Zelladhäsionsmolekülen können DC nun mit ihren Rezeptoren wie L-Selektin, P-Selektin Glycoprotein Ligand-1, CD44, CD43 oder E-Selectin Ligand-1 einen ersten schwach affinen Kontakt herstellen (57). Aufgrund des Blutstromes herrschen hohe Scherkräfte, welche die anfängliche Bindung wiederholt lösen. Es kommt zum Tethering, ein
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bewegen und schließlich aktiv mittels transendothelialer Migration in das periphere Gewebe einwandern (57).
Die Arbeitsgruppe um Michael Sixt konnte 2008 zeigen, dass sich diese Integrin- abhängige Form der Fortbewegung auf die Migration im zweidimensionalen System beschränkt, also entlang einer Oberfläche (55). Dahingegen spielen Integrine bei der Bewegung im dreidimensionalen System keine bedeutende Rolle. Wichtiger ist hierbei das Aktinnetzwerk des Zytoskeletts, welches durch das Ausstrecken des vorderen Zellbereichs ein Vorwärtsfließen der Zelle ermöglicht. An Engstellen spielt das Myosin-II eine entscheidende Rolle, welches durch Kontraktion den eher unflexiblen Zellkern durch die Passage drängt (55).
1.2 Stromazellen der Lymphknoten
Lymphknoten zählen zu den sekundären lymphatischen Organen und nehmen eine wichtige Rolle im Immunsystem ein. Sie sind wie Schaltzentralen in das ausgedehnte lymphatische Gefäßsystem eingebunden. Lymphknoten sind in der Lage, in der Lymphe befindliche Antigene und Pathogene zu filtern und antigentragende dendritische Zellen festzuhalten. Zudem bilden sie eine optimierte Plattform für die Antigenpräsentation, was die effektive Initialisierung der adaptiven Immunantwort zur Folge hat. Lymphknoten sind hoch organisierte lymphatische Organe und beherbergen hauptsächlich Lymphozyten, dendritische Zellen und Makrophagen. Diese sind eingebunden in ein Netzwerk von Stromazellen (engl.: stromal cell; SC). Es wurde zunächst davon ausgegangen, dass SC nur eine Stützfunktion ausüben. Nach neuen Erkenntnissen ist von einer wichtigen Rolle der SC in der Organisation und Reifung, aber auch in der Entwicklung der Lymphknoten auszugehen. Zudem ist klar, dass diese nicht-hämatopoetischen Zellen auch für die B- und T-Zell-Homöostase von tragender Bedeutung sind (58). Weiterhin erleichtern sie die Organisation der spezifischen Zellareale und somit die Interaktion der Zellen (58,59).
1.2.1 Reifung der Stromazellen im Rahmen der Lymphknoten-Entwicklung
SC spielen eine wichtige Rolle in den adulten Lymphknoten, sind aber auch für die Entwicklung der Lymphknoten von entscheidender Bedeutung. Im Zuge dieser Entwicklung, welche in zwei wesentliche Schritte unterteilt wird, unterziehen sich die Lymphgewebestromazellen einem allmählichen Reifungsprozess (Abb. 3) (59).
Die embryonale Lymphgewebsanlage wird durch eine sackartige Endothelaussprossung gebildet, in die mesenchymale Vorläuferzellen einwandern. Diese Vorläufer der Stromazellen werden auch Lymphgewebe organisierende-Zellen (engl.: lymphoid tissue organizer; LTo-Zellen) genannt. Sie exprimieren an ihrer Zelloberfläche weder ICAM-1 (CD54) noch VCAM-1 (CD106). In eine durch LTo-Zellen geschaffene Umgebung werden die hämatopoetischen Lymphgewebe induzierenden-Zellen (engl.: lymphoid tissue inducer; LTi-Zellen) rekrutiert und im Verlauf die spezifischen B- und T-Zell-Areale des reifen Organs gebildet. Unter dem Einfluss des durch LTi-Zellen gebildeten Zytokins Lymphotoxin-α1β2 (LTα1β2) reifen die LTo-Zellen zu ICAM-1intVCAM-1intZellen (59,60).
Nach einem weiteren Schritt im Reifungsprozess exprimieren sie zusätzlichen MAdCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1) (59). Unter der weiteren Stimulation durch LTα1β2 präsentieren schließlich die reifen ICAM-1highVCAM-1highMAdCAM-1+ Stromazellen zusätzlich homöostatische Chemokine wie CXCL13, CCL19 und CCL21 (59). Diese Chemokine wiederum unterstützen die Sekretion des Lymphotoxins durch Lymphozyten und LTi-Zellen. Somit herrscht ein positiver Feedback-Kreislauf zwischen der Bildung von homöostatischen Chemokinen und Lymphotoxin im Lymphknoten (61).
Die reifen SC definieren sich durch hohe Konzentrationen der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1, zudem exprimieren sie MAdCAM-1, das membranständige Glykoprotein 38 (gp38, Podoplanin) und Rezeptoren für Wachstumsfaktoren wie den Thrombozyten- Wachstumsfaktor (engl.: Platelet-derived growth factor, PDGF) (59).
strukturelles Netzwerk im Bereich der späteren B-Zellfolikel (63). Hier werden sie allerdings im Laufe der weiteren Lymphknotenentwicklung, ca. 21 Tagen nach der Geburt des Fetus, fast vollständig durch follikuläre dendritische Zellen (engl.: follicular dendritic cells; FDC) ersetzt (64). Die FDC stellen eine wichtige Subpopulation der SC im B- Zellfollikel der reifen Lymphknoten dar. Sie exprimieren das Chemokin CXCL13, welches die Migration der CXCR5-exprimierenden B-Zellen in die Lymphknotenfollikel induziert.
Zudem sind die FDC durch die Expression von Komplementkomponenten sowie Komplement- und Fc-Rezeptoren in der Lage, nicht-prozessierte Antigene in Form von Immunkomplexen aufzunehmen und diese zu präsentieren. Die B-Zellfolikel werden zum subkapsulären Randsinus hin durch eine weitere SC-Subpopulation abgegrenzt (63). Sie nehmen Antigene aus der Lymphe auf, bilden wie die FRC ein Conduit-Netzwerk und exprimieren ebenso wie die FDC das Chemokin CXCL13 sowie das Adhäsionsmolekül MAdCAM-1. Diese randständigen Retikulumzellen (engl.: marginal reticular cells; MRC) sind die einzigen Stromazellen, die den Rezeptor aktivierenden nucleus Faktor-κB- Liganden (RANK-L) exprimieren (58,60,63). Die Abbildung 4 verdeutlicht die lokale Anordnung der drei oben aufgeführten SC-Subpopulationen im Lymphknoten.
Neben den oben genannten SC-Subtypen gibt es noch weitere Zellpopulationen, die ebenfalls nicht-hämatopoetischen Ursprungs sind und im Lymphknoten spezifische Funktionen erfüllen sowie strukturelle Formen darstellen. Hierzu zählen die vaskulären und lymphatischen Endothelzellen. Im Mark der Lymphknoten bildet ein enges Netzwerk an medullären Fibroblasten im Zusammenspiel mit retikulären Fasern das in Strängen angelegte Grundgerüst der Medulla. Ein lockeres Geflecht von Fibroblasten bildet ebenfalls die Struktur des medullären Sinus (63).
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22 Abbildung 4: Position der SC-Subtypen im Lymphknoten.
Die FDC sind ausschließlich in den B-Zellfollikeln lokalisiert, wohingegen die FRC hauptsächlich in der T- Zellzone aber auch vereinzelt in der B-Zellzone vorkommen. Die MRC bilden ein schichtartiges Netzwerk am Rand des subkapsulären Randsinus. FRC: fibroblastische Retikulumzellen; FDC: follikuläre dendritische Zellen; MRC: randständige Retikulumzellen (Abbildung wurde modifiziert mit Erlaubnis des Verlages;
Copyright 2010: Elsevier (58)).
1.2.3 Stromazellinteraktionen
Wie bereits unter Punkt 1.2.1 beschrieben, stehen die SC mit den LTi-Zellen in einer stätigen Interaktion, die über einen Rückkopplungskreislauf durch Chemokin- bzw.
Lymphotoxinproduktion kontrolliert wird. Darüber hinaus dienen die von den SC exprimierten Chemokine nicht nur dem Erhalt der Homöostase, sondern auch der Interaktion mit Lymphozyten. CXCL13 fördert die Expression von LTα1β2 durch reife B- Zellen. Den gleichen Effekt lösen CCL21 und CCL19 auf reife CD4+ T-Zellen aus (61).
CXCL13, CCL19 und CCL21 steuern die Migration und Anordnung von B- und T-Zellen innerhalb des Lymphknotens. Außerdem produzieren FRC IL-6, IL-7 sowie Wachstumsfaktoren für Gefäßendothel (engl.: vascular endothelial growth factor, VEGF), wobei die Wachstumsfaktoren, IL-7 und CCL19 positiv auf die Überlebenszeit der naiven T-Zellen wirken. Zudem hat VEGF Einfluss auf die Endothelzellproliferation von HEV und lymphatischen Gefäßen. Des Weiteren sind FRC in der Lage, Antigen mittels MHC-I den CD8+ Lymphozyten zu präsentieren (58). Die FDC interagieren hauptsächlich mit B-Zellen, treten aber auch mit follikulären TH-Zellen in Kontakt. Sie beeinflussen die lokale Anordnung der B-Zellen durch die Sekretion von CXCL13. Darüber hinaus produzieren FDC auch für die Proliferation sowie für das Überleben der B-Zellen wichtige Faktoren und
sind in der Lage, den Lymphozyten Antigen im Form von Immunkomplexen zu präsentieren (58). Die Lymphozyten bewegen sich gesteuert durch Chemokine ständig entlang der Zellkörper bzw. Zellausläufer der SC. Diese ermöglichen den Lymphozyten durch die Produktion von Adhäsionsmolekülen, Integrinen und Glykoproteinen zusätzlich eine gute Traktion. Auf diese Art und Weise bestimmen die SC die Migration der Lymphozyten im Lymphknoten (63). Außerdem werden das morphodynamische Verhalten und die Beweglichkeit von DC durch FRC beeinflusst. Dies erfolgt durch die Expression von Podoplanin, einem membranständigen Glykoprotein. Podoplanin aktiviert den C-Typ- Lektin-Rezeptor, CLEC-2, was zu einer Modulation des Aktin-Zytoskeletts der DC führt und so eine effiziente Motilität entlang der FRC fördert (66).
Zie l de r Arbe it
24 2 Ziel der Arbeit
Der homöostatische Chemokinrezeptor CCR7 wird auf der Zelloberfläche von Leukozyten einschließlich reifer, aktivierter DC, exprimiert (47). Er spielt eine tragende Rolle in der Organisation und Funktion der lymphatischen Organe. Im Zusammenspiel mit seinen zwei Liganden CCL19 und CCL21 nimmt er eine Schlüsselfunktion bei der Migration der DC von den peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten ein (38,67). Er reguliert weiterhin die Motilität, die Migrationsgeschwindigkeit (40), die Morphologie der reifen DC (52) sowie die Positionierung der stationären DC innerhalb der lymphatischen Gewebe (9).
Das wesentliche Ziel dieser Arbeit ist es, mehr über die Beeinflussung des Migrationsverhaltens reifer DC durch die zwei Chemokine CCL19 und CCL21 zu erfahren.
Speziell soll der Frage nachgegangen werden, ob die beiden Chemokine eine unterschiedliche Wirkung auf die Migrationsgeschwindigkeit sowie auf die direktionale Migration haben und, wenn dem so ist, in welchem Ausmaß bzw. in welcher unterschiedlichen Qualität dies passiert. Zusätzlich soll geklärt werden, inwieweit die SC des Lymphknotens, auch im Zusammenspiel mit den CCR7-Liganden, Einfluss auf die Migration reifer DC haben. Besonderes Augenmerk liegt auch hier auf Direktionalität und Geschwindigkeit der Migration.
Um diese Fragen zu beantworten, wurden verschiedene In-vitro-Analysen mit Hilfe einer dreidimensionalen Kollagenmatrix durchgeführt. Die in den Untersuchungen eingesetzten dendritischen Zellen wurden aus Vorläuferzellen des Knochenmarkes und die Stromazellen aus dem mesenterischen Lymphknoten der Maus kultiviert.
3 Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Geräte und Einwegartikel
In Tabellen 2 und 3 sind die verwendeten Geräte und Einwegartikel aufgelistet.
Tabelle 2: Liste der verwendeten Geräte
Gerät Typenbezeichnung/ Hersteller
Boyden Kammer 48-Well Micro Chemotaxis Chamber (NeuroProbe, USA) Cryo 1°C Freezing Container Nalgene
Durchflusszytometer LSR II (BD Biosciences)
Feinwaage BP 310 s (Sartorius AG)
Heizplatte Safetycontrol (Scientific Ind., USA)
Inkubatoren MCO-20AIC (Sanyo)
Multitron II (Infors) Kühlschränke/
Gefrierschränke
Premium (Liebherr) UltraLow -152°C (Sanyo) UltraLow -80°C (Sanyo) Kühlzentrifuge Heraeus Multifuge 3 S-R
Mikroskope Axiovert 200M (Zeiss)
Axiovert 25 (Zeiss)
LSM 510 META (Konfokalmikroskop) (Zeiss) + Digitalkamera ORCA-ER (Hamamatsu, Japan)
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Eismaschine Ziegra
Präparationsbesteck Aesculap/Dumont
Pinsel (Größe 4) Figueras
Wasserbad GFL 1002
Gelscanner GeneGenius System, BioIMAGING System
Zählkammer Neubauer improved Marienfeld
Tabelle 3: Liste der verwendeten Einwegartikel
Einwegartikel Hersteller
Deckgläser 18x18mm Roth
Einmal-Kanülen Braun
Einwegskalpelle Feather
Einwegspritzen Braun
FACS-Röhrchen Greiner bio-one
Cryotube (1,5ml, PP) Cryovial von Simport
Micro Tubes, Safe-Seal Reagiergefäße Sarstedt
Objektträger 76x26mm Menzel GmbH
Petrischalen (ø94x16mm) Greiner bio-one
Pipetten Diverse (Eppendorf)
Steril Filter-System (150ml) Corning
Zellkultur-Schalen (ø100x20mm) TPP (Schweiz)
6-well Zellkulturtestplatten TPP (Schweiz)
96-well Mikrotiterplatten (mit Spitzböden) Greiner bio-one
Zentrifugenröhrchen (15ml/ 50ml) Greiner bio-one
3.1.2 Medien, Seren und Lösungen
In den Tabellen 4 bis 7 sind die verwendeten Seren und Medien aufgelistet, darunter auch die für SC und DC benötigten Zellkulturmedien, sowie das für die Migrationsexperimente eingesetzte Medium. Zudem befinden sich in Tabelle 8 bis 12 die verwendeten Puffer, Lösungen sowie das Gefrier- und Verdauungsmedium.
Tabelle 4: Liste der verwendeten Seren und Medien
Serum/Medium Hersteller
Fetal Calf Serum (FCS) PAA
MEM 10x (Minimum Essential Medium) Gibco (Invitrogen)
Rattenserum Sigma-Aldrich
RPMI 1640 Medium (ohne Glutamin) Gibco (Invitrogen)
Tabelle 5: Verwendetes Zellkulturmedium für dendritische Zellen (DC-Medium)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
FCS 10% 50ml PAA
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Gibco
Tabelle 6: Verwendetes Zellkulturmedium für mesenterische Lymphknoten Stromazellen (SC- Medium)
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Tabelle 7: Verwendetes Medium für Migrationsexperimente im Kollagengel
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/ Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Sigma-Aldrich
HEPES 2,5mM 20nM 4ml Roth
Tabelle 8: Verwendetes Gefriermedium
Inhaltsstoffe Menge Hersteller
Dimethylsulfoxid (DMSO) 5ml Sigma-Aldrich
Fetal Calf Serum (FCS) 15ml PAA
DC-Medium 30ml Institut für Immunologie
Tabelle 9: Verwendete HEPES-BSS-Puffer
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
Aqua dest. (ddH2O) 500ml Institut für Immunologie
NaCl 137mM 4,003g Roth
HEPES (2,5mM) 20mM 2,5ml Roth
NaOH bis pH 7,4 … Roth
Tabelle 10: Verwendete Lösung zur SC-Lösung aus der Zellkultur (HUVEC-T/E)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
HEPES-BSS 500ml Institut für Immunologie
EDTA (Dinatriumsalz) 0,03% 150mg Roth
Trypsin 0,04% 200mg Roth
Tabelle 11: Verwendetes Verdaumedium
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
SC-Medium 5ml Institut für Immunologie
Kollagenase A 0,5mg/ml + Dnase1 50U/ml
10% 500µl Roche
Roche
Tabelle 12: Liste weiterer verwendeter Lösungen
Lösung Inhaltsstoffe Endkonz. Hersteller
Blockierungspuffer PBS
Rattenserum (Ziegenserum) FCS
5%
5%
3%
Institut für Immunologie Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich PAA
4`,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zur FACS-Färbung
DAPI (1mg/ml) H2O
2µg/ml (1:500)
Roche
Diff-Quik (Fixiermittellösung) Methyl Alcohol 100% Dade Behring Trypanblau-Lösung Trypanblau
PBS
0,4% Sigma-Aldrich
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
PBS 10x Aquadest.
+ autoklaviert
1x Gibco
PBS/FCS PBS
FCS 3%
Institut für Immunologie PAA
PBS/ Rinder-Serumalbumin (BSA)
PBS
BSA (0,02g) 0,2%
Institut für Immunologie
Ma te ria lie n und Me thode n
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3.1.3 Zytokine, Chemokine und weitere Substanzen
In Tabellen 13 bis 16 sind Zytokine, Chemokine, Antikörper und weitere verwendete Substanzen aufgelistet.
Tabelle 13: Liste der verwendeten Zytokine
Zytokin Endkonz. Hersteller
Tumornekrosefaktor-α
(TNF-α) 30 ng/ml PeproTech
Prostaglandin E2 (PGE2) 1 µg/ml Sigma-Aldrich
rekombinanter Granulozyten- Macrophagen-Kolonie-
stimulierender Faktor (GM-CSF)
100-200 ng/ml Institut für Immunologie Produziert durch eine NIH-3T3 Zelllinie
Tabelle 14: Liste der verwendeten Chemokine
Chemokine Endkonz. Hersteller
rmCCL19 (ELC, MIP-3β) 30 ng/ml R&B Systems
rmCCL21 (SLC, 6Ckine) 10 µM R&B Systems
Tabelle 15: Liste weiterer verwendeter Substanzen
Name Hersteller
Kollagen Typ I (PureCol, Produkt vom Rind, 3 mg/mL) INAMED 5-Carboxytetramethylrhodamin (5-TAMRA) 5mM in
N,N-Dimethylformamid
Invitrogen Sigma-Aldrich C3-Exoenzym aus dem Clostridium botulinum
- Bindedomäne (C2II) - katalytische Domäne
Institut für Toxikologie MH-Hannover
Prof. Dr. Harald Genth
Tabelle 16: Liste der verwendeten Antikörper
Bindendes AG Fluorochrom Hersteller
CD54 (ICAM-1) (Klon 3E2) PE Pharmingen
CD80 (Klon 16-10A1) PE Pharmingen
CD40 (Klon MAB 89) PE Immunotech
CD86 (Klon Bu63) APC Caltag/Invitrogen
CD106 (VCAM-1) (Klon 429 (MVCAM.A)) bio Pharmingen
MHC-II (I-Ab) (Klon AF6-120.1) bio BD Biosciences
ELC (unaufgereinigter Antikörper, human) Institut für Immunologie gp38 (unaufgereinigter Antikörper, hamster) Institut für Immunologie Goat anti-human IgG (Order Nr. 109-115-098) PE Jackson
Goat anti-hamster IgG (Order Nr. 127-135- 160)
APC Jackson
Streptavidin (Order Nr. S32365) PacO Molecular Probes/
Invitrogen
PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanin, PacO: Pacific-Orange, bio: Antigen ist kovalent mit Biotin verbunden
3.1.4 Versuchstiere
Für die Experimente wurden 8 bis 12 Wochen alte C57/BL6/N Mäuse verwendet, die von der Firma Charles River Laboratories bezogen wurden.
Die CCR7-defizienten Mäuse (38) (B6.129P2(C)-Ccr7tmRfor/J (CCR7-/-)) und die plt/plt- Mäuse wurden auf einen C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt und in dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Bei dem CCR7-/-Stamm wurde das Exon 3 des CCR7-Gens unterbrochen, so dass CCR7 nicht exprimiert wird.
