1.2 Stromazellen der Lymphknoten
1.2.1 Reifung der Stromazellen im Rahmen der Lymphknoten-Entwicklung
SC spielen eine wichtige Rolle in den adulten Lymphknoten, sind aber auch für die Entwicklung der Lymphknoten von entscheidender Bedeutung. Im Zuge dieser Entwicklung, welche in zwei wesentliche Schritte unterteilt wird, unterziehen sich die Lymphgewebestromazellen einem allmählichen Reifungsprozess (Abb. 3) (59).
Die embryonale Lymphgewebsanlage wird durch eine sackartige Endothelaussprossung gebildet, in die mesenchymale Vorläuferzellen einwandern. Diese Vorläufer der Stromazellen werden auch Lymphgewebe organisierende-Zellen (engl.: lymphoid tissue organizer; LTo-Zellen) genannt. Sie exprimieren an ihrer Zelloberfläche weder ICAM-1 (CD54) noch VCAM-1 (CD106). In eine durch LTo-Zellen geschaffene Umgebung werden die hämatopoetischen Lymphgewebe induzierenden-Zellen (engl.: lymphoid tissue inducer; LTi-Zellen) rekrutiert und im Verlauf die spezifischen B- und T-Zell-Areale des reifen Organs gebildet. Unter dem Einfluss des durch LTi-Zellen gebildeten Zytokins Lymphotoxin-α1β2 (LTα1β2) reifen die LTo-Zellen zu ICAM-1intVCAM-1intZellen (59,60).
Nach einem weiteren Schritt im Reifungsprozess exprimieren sie zusätzlichen MAdCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1) (59). Unter der weiteren Stimulation durch LTα1β2 präsentieren schließlich die reifen ICAM-1highVCAM-1highMAdCAM-1+ Stromazellen zusätzlich homöostatische Chemokine wie CXCL13, CCL19 und CCL21 (59). Diese Chemokine wiederum unterstützen die Sekretion des Lymphotoxins durch Lymphozyten und LTi-Zellen. Somit herrscht ein positiver Feedback-Kreislauf zwischen der Bildung von homöostatischen Chemokinen und Lymphotoxin im Lymphknoten (61).
Die reifen SC definieren sich durch hohe Konzentrationen der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1, zudem exprimieren sie MAdCAM-1, das membranständige Glykoprotein 38 (gp38, Podoplanin) und Rezeptoren für Wachstumsfaktoren wie den Thrombozyten-Wachstumsfaktor (engl.: Platelet-derived growth factor, PDGF) (59).
strukturelles Netzwerk im Bereich der späteren B-Zellfolikel (63). Hier werden sie allerdings im Laufe der weiteren Lymphknotenentwicklung, ca. 21 Tagen nach der Geburt des Fetus, fast vollständig durch follikuläre dendritische Zellen (engl.: follicular dendritic cells; FDC) ersetzt (64). Die FDC stellen eine wichtige Subpopulation der SC im B-Zellfollikel der reifen Lymphknoten dar. Sie exprimieren das Chemokin CXCL13, welches die Migration der CXCR5-exprimierenden B-Zellen in die Lymphknotenfollikel induziert.
Zudem sind die FDC durch die Expression von Komplementkomponenten sowie Komplement- und Fc-Rezeptoren in der Lage, nicht-prozessierte Antigene in Form von Immunkomplexen aufzunehmen und diese zu präsentieren. Die B-Zellfolikel werden zum subkapsulären Randsinus hin durch eine weitere SC-Subpopulation abgegrenzt (63). Sie nehmen Antigene aus der Lymphe auf, bilden wie die FRC ein Conduit-Netzwerk und exprimieren ebenso wie die FDC das Chemokin CXCL13 sowie das Adhäsionsmolekül MAdCAM-1. Diese randständigen Retikulumzellen (engl.: marginal reticular cells; MRC) sind die einzigen Stromazellen, die den Rezeptor aktivierenden nucleus Faktor-κB-Liganden (RANK-L) exprimieren (58,60,63). Die Abbildung 4 verdeutlicht die lokale Anordnung der drei oben aufgeführten SC-Subpopulationen im Lymphknoten.
Neben den oben genannten SC-Subtypen gibt es noch weitere Zellpopulationen, die ebenfalls nicht-hämatopoetischen Ursprungs sind und im Lymphknoten spezifische Funktionen erfüllen sowie strukturelle Formen darstellen. Hierzu zählen die vaskulären und lymphatischen Endothelzellen. Im Mark der Lymphknoten bildet ein enges Netzwerk an medullären Fibroblasten im Zusammenspiel mit retikulären Fasern das in Strängen angelegte Grundgerüst der Medulla. Ein lockeres Geflecht von Fibroblasten bildet ebenfalls die Struktur des medullären Sinus (63).
E inle itung und Hinte rgrund
22 Abbildung 4: Position der SC-Subtypen im Lymphknoten.
Die FDC sind ausschließlich in den B-Zellfollikeln lokalisiert, wohingegen die FRC hauptsächlich in der T-Zellzone aber auch vereinzelt in der B-T-Zellzone vorkommen. Die MRC bilden ein schichtartiges Netzwerk am Rand des subkapsulären Randsinus. FRC: fibroblastische Retikulumzellen; FDC: follikuläre dendritische Zellen; MRC: randständige Retikulumzellen (Abbildung wurde modifiziert mit Erlaubnis des Verlages;
Copyright 2010: Elsevier (58)).
1.2.3 Stromazellinteraktionen
Wie bereits unter Punkt 1.2.1 beschrieben, stehen die SC mit den LTi-Zellen in einer stätigen Interaktion, die über einen Rückkopplungskreislauf durch Chemokin- bzw.
Lymphotoxinproduktion kontrolliert wird. Darüber hinaus dienen die von den SC exprimierten Chemokine nicht nur dem Erhalt der Homöostase, sondern auch der Interaktion mit Lymphozyten. CXCL13 fördert die Expression von LTα1β2 durch reife B-Zellen. Den gleichen Effekt lösen CCL21 und CCL19 auf reife CD4+ T-Zellen aus (61).
CXCL13, CCL19 und CCL21 steuern die Migration und Anordnung von B- und T-Zellen innerhalb des Lymphknotens. Außerdem produzieren FRC IL-6, IL-7 sowie Wachstumsfaktoren für Gefäßendothel (engl.: vascular endothelial growth factor, VEGF), wobei die Wachstumsfaktoren, IL-7 und CCL19 positiv auf die Überlebenszeit der naiven T-Zellen wirken. Zudem hat VEGF Einfluss auf die Endothelzellproliferation von HEV und lymphatischen Gefäßen. Des Weiteren sind FRC in der Lage, Antigen mittels MHC-I den CD8+ Lymphozyten zu präsentieren (58). Die FDC interagieren hauptsächlich mit B-Zellen, treten aber auch mit follikulären TH-Zellen in Kontakt. Sie beeinflussen die lokale Anordnung der B-Zellen durch die Sekretion von CXCL13. Darüber hinaus produzieren FDC auch für die Proliferation sowie für das Überleben der B-Zellen wichtige Faktoren und
sind in der Lage, den Lymphozyten Antigen im Form von Immunkomplexen zu präsentieren (58). Die Lymphozyten bewegen sich gesteuert durch Chemokine ständig entlang der Zellkörper bzw. Zellausläufer der SC. Diese ermöglichen den Lymphozyten durch die Produktion von Adhäsionsmolekülen, Integrinen und Glykoproteinen zusätzlich eine gute Traktion. Auf diese Art und Weise bestimmen die SC die Migration der Lymphozyten im Lymphknoten (63). Außerdem werden das morphodynamische Verhalten und die Beweglichkeit von DC durch FRC beeinflusst. Dies erfolgt durch die Expression von Podoplanin, einem membranständigen Glykoprotein. Podoplanin aktiviert den C-Typ-Lektin-Rezeptor, CLEC-2, was zu einer Modulation des Aktin-Zytoskeletts der DC führt und so eine effiziente Motilität entlang der FRC fördert (66).
Zie l de r Arbe it
24 2 Ziel der Arbeit
Der homöostatische Chemokinrezeptor CCR7 wird auf der Zelloberfläche von Leukozyten einschließlich reifer, aktivierter DC, exprimiert (47). Er spielt eine tragende Rolle in der Organisation und Funktion der lymphatischen Organe. Im Zusammenspiel mit seinen zwei Liganden CCL19 und CCL21 nimmt er eine Schlüsselfunktion bei der Migration der DC von den peripheren Geweben in die drainierenden Lymphknoten ein (38,67). Er reguliert weiterhin die Motilität, die Migrationsgeschwindigkeit (40), die Morphologie der reifen DC (52) sowie die Positionierung der stationären DC innerhalb der lymphatischen Gewebe (9).
Das wesentliche Ziel dieser Arbeit ist es, mehr über die Beeinflussung des Migrationsverhaltens reifer DC durch die zwei Chemokine CCL19 und CCL21 zu erfahren.
Speziell soll der Frage nachgegangen werden, ob die beiden Chemokine eine unterschiedliche Wirkung auf die Migrationsgeschwindigkeit sowie auf die direktionale Migration haben und, wenn dem so ist, in welchem Ausmaß bzw. in welcher unterschiedlichen Qualität dies passiert. Zusätzlich soll geklärt werden, inwieweit die SC des Lymphknotens, auch im Zusammenspiel mit den CCR7-Liganden, Einfluss auf die Migration reifer DC haben. Besonderes Augenmerk liegt auch hier auf Direktionalität und Geschwindigkeit der Migration.
Um diese Fragen zu beantworten, wurden verschiedene In-vitro-Analysen mit Hilfe einer dreidimensionalen Kollagenmatrix durchgeführt. Die in den Untersuchungen eingesetzten dendritischen Zellen wurden aus Vorläuferzellen des Knochenmarkes und die Stromazellen aus dem mesenterischen Lymphknoten der Maus kultiviert.
3 Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Geräte und Einwegartikel
In Tabellen 2 und 3 sind die verwendeten Geräte und Einwegartikel aufgelistet.
Tabelle 2: Liste der verwendeten Geräte
Gerät Typenbezeichnung/ Hersteller
Boyden Kammer 48-Well Micro Chemotaxis Chamber (NeuroProbe, USA) Cryo 1°C Freezing Container Nalgene
Durchflusszytometer LSR II (BD Biosciences)
Feinwaage BP 310 s (Sartorius AG)
Heizplatte Safetycontrol (Scientific Ind., USA)
Inkubatoren MCO-20AIC (Sanyo)
Multitron II (Infors) Kühlschränke/
Gefrierschränke
Premium (Liebherr) UltraLow -152°C (Sanyo) UltraLow -80°C (Sanyo) Kühlzentrifuge Heraeus Multifuge 3 S-R
Mikroskope Axiovert 200M (Zeiss)
Axiovert 25 (Zeiss)
LSM 510 META (Konfokalmikroskop) (Zeiss) + Digitalkamera ORCA-ER (Hamamatsu, Japan)
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Eismaschine Ziegra
Präparationsbesteck Aesculap/Dumont
Pinsel (Größe 4) Figueras
Wasserbad GFL 1002
Gelscanner GeneGenius System, BioIMAGING System
Zählkammer Neubauer improved Marienfeld
Tabelle 3: Liste der verwendeten Einwegartikel
Einwegartikel Hersteller
Deckgläser 18x18mm Roth
Einmal-Kanülen Braun
Einwegskalpelle Feather
Einwegspritzen Braun
FACS-Röhrchen Greiner bio-one
Cryotube (1,5ml, PP) Cryovial von Simport
Micro Tubes, Safe-Seal Reagiergefäße Sarstedt
Objektträger 76x26mm Menzel GmbH
Petrischalen (ø94x16mm) Greiner bio-one
Pipetten Diverse (Eppendorf)
Steril Filter-System (150ml) Corning
Zellkultur-Schalen (ø100x20mm) TPP (Schweiz)
6-well Zellkulturtestplatten TPP (Schweiz)
96-well Mikrotiterplatten (mit Spitzböden) Greiner bio-one
Zentrifugenröhrchen (15ml/ 50ml) Greiner bio-one
3.1.2 Medien, Seren und Lösungen
In den Tabellen 4 bis 7 sind die verwendeten Seren und Medien aufgelistet, darunter auch die für SC und DC benötigten Zellkulturmedien, sowie das für die Migrationsexperimente eingesetzte Medium. Zudem befinden sich in Tabelle 8 bis 12 die verwendeten Puffer, Lösungen sowie das Gefrier- und Verdauungsmedium.
Tabelle 4: Liste der verwendeten Seren und Medien
Serum/Medium Hersteller
Fetal Calf Serum (FCS) PAA
MEM 10x (Minimum Essential Medium) Gibco (Invitrogen)
Rattenserum Sigma-Aldrich
RPMI 1640 Medium (ohne Glutamin) Gibco (Invitrogen)
Tabelle 5: Verwendetes Zellkulturmedium für dendritische Zellen (DC-Medium)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
FCS 10% 50ml PAA
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Gibco
Tabelle 6: Verwendetes Zellkulturmedium für mesenterische Lymphknoten Stromazellen (SC-Medium)
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Tabelle 7: Verwendetes Medium für Migrationsexperimente im Kollagengel
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/ Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Sigma-Aldrich
HEPES 2,5mM 20nM 4ml Roth
Tabelle 8: Verwendetes Gefriermedium
Inhaltsstoffe Menge Hersteller
Dimethylsulfoxid (DMSO) 5ml Sigma-Aldrich
Fetal Calf Serum (FCS) 15ml PAA
DC-Medium 30ml Institut für Immunologie
Tabelle 9: Verwendete HEPES-BSS-Puffer
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
Aqua dest. (ddH2O) 500ml Institut für Immunologie
NaCl 137mM 4,003g Roth
HEPES (2,5mM) 20mM 2,5ml Roth
NaOH bis pH 7,4 … Roth
Tabelle 10: Verwendete Lösung zur SC-Lösung aus der Zellkultur (HUVEC-T/E)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
HEPES-BSS 500ml Institut für Immunologie
EDTA (Dinatriumsalz) 0,03% 150mg Roth
Trypsin 0,04% 200mg Roth
Tabelle 11: Verwendetes Verdaumedium
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
SC-Medium 5ml Institut für Immunologie
Kollagenase A 0,5mg/ml + Dnase1 50U/ml
10% 500µl Roche
Roche
Tabelle 12: Liste weiterer verwendeter Lösungen
Lösung Inhaltsstoffe Endkonz. Hersteller
Blockierungspuffer PBS
Diff-Quik (Fixiermittellösung) Methyl Alcohol 100% Dade Behring Trypanblau-Lösung Trypanblau
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3.1.3 Zytokine, Chemokine und weitere Substanzen
In Tabellen 13 bis 16 sind Zytokine, Chemokine, Antikörper und weitere verwendete
rmCCL19 (ELC, MIP-3β) 30 ng/ml R&B Systems
rmCCL21 (SLC, 6Ckine) 10 µM R&B Systems
Tabelle 15: Liste weiterer verwendeter Substanzen
Name Hersteller
Kollagen Typ I (PureCol, Produkt vom Rind, 3 mg/mL) INAMED 5-Carboxytetramethylrhodamin (5-TAMRA) 5mM in
Tabelle 16: Liste der verwendeten Antikörper
Bindendes AG Fluorochrom Hersteller
CD54 (ICAM-1) (Klon 3E2) PE Pharmingen
CD80 (Klon 16-10A1) PE Pharmingen
CD40 (Klon MAB 89) PE Immunotech
CD86 (Klon Bu63) APC Caltag/Invitrogen
CD106 (VCAM-1) (Klon 429 (MVCAM.A)) bio Pharmingen
MHC-II (I-Ab) (Klon AF6-120.1) bio BD Biosciences
ELC (unaufgereinigter Antikörper, human) Institut für Immunologie gp38 (unaufgereinigter Antikörper, hamster) Institut für Immunologie Goat anti-human IgG (Order Nr. 109-115-098) PE Jackson
Goat anti-hamster IgG (Order Nr. 127-135-160)
APC Jackson
Streptavidin (Order Nr. S32365) PacO Molecular Probes/
Invitrogen
PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanin, PacO: Pacific-Orange, bio: Antigen ist kovalent mit Biotin verbunden
3.1.4 Versuchstiere
Für die Experimente wurden 8 bis 12 Wochen alte C57/BL6/N Mäuse verwendet, die von der Firma Charles River Laboratories bezogen wurden.
Die CCR7-defizienten Mäuse (38) (B6.129P2(C)-Ccr7tmRfor/J (CCR7-/-)) und die plt/plt-Mäuse wurden auf einen C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt und in dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Bei dem CCR7-/-Stamm wurde das Exon 3 des CCR7-Gens unterbrochen, so dass CCR7 nicht exprimiert wird.
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Die Tiere wurden unter festgelegten spezifisch pathogenfreien Bedingungen (SPF) gehalten. Die Tierhaltung, -pflege und -experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutes und den staatlichen Regeln durchgeführt. Vor Beginn der Experimente habe ich, Sebastian Schröder, an der Vorlesungsreihe „Grundlagen der Versuchstierkunde und perioperative Betreuung von Versuchstieren“ inklusive praktischem Teil am „Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium“ der MHH teilgenommen. Meine Tätigkeiten umfassten das Töten der Tiere und die Entnahme von Organen.
3.2 Methoden
3.2.1 Differenzierung dendritischer Zellen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks Die Differenzierung der DC wurde entsprechend eines modifizierten Protokolls nach Lutz et al. (1999) durchgeführt (27). Hierbei werden die DC-Progenitoren enthaltenden Knochenmarkszellen gewonnen und über 7 Tage in Kulturmedium mit dem Zusatz von GM-CSF inkubiert, wobei DC differenzieren.
Protokoll:
Nach der Betäubung und Tötung der Maus mit CO2 wird der Tod durch Reflextest gesichert und das Fell mit 70%-igem Ethanol abgewaschen. Im Anschluss werden die Hinterläufe des Spendertieres von Fell, Haut und der Muskulatur befreit. Die Beine werden im Bereich der Hüftknochen disloziert, die Füße entfernt und der Oberschenkel vom Unterschenkel getrennt. Anschließend werden die Knochen von ggf. vorhandenen Sehnen und eventuellen Verunreinigungen befreit. Hierbei wird darauf geachtet, dass die Knochen intakt bleiben, damit keine Kontaminierung mit Keimen erfolgt. Die gereinigten Knochen werden in PBS eingelegt und auf Eis gekühlt. Nach der Präparation aller Knochen wird unter der Sterilwerkbank weitergearbeitet, und es werden nur noch sterile Lösungen verwendet. Die Knochen werden in 70%-igem Ethanol für 2 Minuten desinfiziert und kurz in PBS gewaschen. Die Epiphysen werden vom Knochen mit einer Schere abgetrennt und durch die eröffneten Enden das Knochenmark aus Femur sowie Tibia mittels einer Spritze und aufgesteckter Kanüle mit 5 ml sterilem PBS ausgespült. Anschließend wird das
Knochenmark in einer Petrischale gesammelt und die Zellen mit der Spritze durch zwei- bis dreimaliges Aufnehmen und Herausspritzen vereinzelt. Im Folgenden werden 10 ml DC-Medium (siehe Tabelle 5) hinzugegeben und die Zellsuspension in einem 50 ml Röhrchen für 8 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Danach wird der Überstand abgesaugt, das Zellpellet in 10 ml DC-Medium resuspendiert, ein kleiner Teil der Zellsuspension mit Trypanblau gefärbt und in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt.
Nur die vitalen Zellen werden gezählt. Trypanblau als saurer Farbstoff durchdringt die defekte Zellmembran toter Zellen, bindet als Anion an zytosolische Proteine und erzeugt somit die Blaufärbung der avitalen Zellen. Die Suspension wird auf 5 x 106 vitale Zellen pro 8 ml DC-Medium eingestellt und 8 ml der Suspension mit 2 ml GM-CSF (5:1) komplettiert. Schließlich erfolgt die Ausplattierung der Zellen zu je 10 ml pro Petrischale (ø 94 x 16 mm).
3.2.2 Die Kultivierung der dendritischen Zellen und die Induktion ihrer Reifung
Die Zellen wurden im Brutschrank (Inkubator) bei 37 °C und 5%-igem CO2 -Atmosphärengehalt kultiviert.
Protokoll:
Wie unter Kapitel 3.2.1 beschrieben, erfolgt die Ausdifferenzierung der im Knochenmark enthaltenen Progenitoren zu DC durch den Einsatz des Zytokins GM-CSF. Am dritten Tag der Kultur werden 8 ml DC-Medium und 2 ml GM-CSF pro Petrischale hinzugegeben. An Tag 6 werden 10 ml des Überstandes vorsichtig entnommen, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und die Zellen bei 1200 U/min über 8 Minuten mit Bremse abzentrifugiert. Nachdem der Überstand abgesaugt ist, wird das Zellpellet in 8 ml
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(ø 100 x 20 mm) plattiert. Abschließend werden zur Stimulation TNF-α (30 ng/ml) und PGE2 (1 µg/ml) eingesetzt. An Tag 9 können die reifen DC durch gründliches Abspülen von der Schale geerntet und für die Experimente eingesetzt werden.
3.2.3 Die Gewinnung von Stromazellen aus mesenterischen Lymphknoten
Zur Gewinnung von Stromazellen des Lymphknotens wurden 7 Tage alte Mäuse genutzt.
Die Präparation der SC erfolgt unter sterilen Bedingungen. Hierzu wird mit sterilen Lösungen und an der Sterilwerkbank gearbeitet. Zudem wird nach jedem Arbeitsschritt das Präparationsbesteck in 70%-igem Ethanol desinfiziert.
Protokoll:
Die Maus wird mit einer Schere enthauptet, auf einer Unterlage fixiert und das Fell mit 70%-igem Ethanol abgespült. Die anschließende Inzision in das Fell erfolgt entlang der Linea alba. Das Omentum majus wird dann nach der Eröffnung des Peritoneums aufgesucht und der mesenterische Lymphknoten (mLN) entnommen. Der mLN wird in ein Well (dt.: Schale, Loch) einer 6 Well-Zellkulturplatte gegeben und mit einem sterilen Einwegskalpell zerkleinert. Im Anschluss erfolgt die 20 – 30 Minuten andauernde Inkubation mittels steril filtriertem Verdaumedium (siehe Tabelle 11) (1 ml pro Well) im Schüttelinkubator bei 37 °C. Im nächsten Schritt wird die Suspension in 10 ml SC-Medium (siehe Tabelle 6) aufgenommen und bei 1200 U/min über 8 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1,5 ml SC-Medium resuspendiert. Die so aufgenommenen Zellen werden in die Mitte einer Vertiefung der 6 Well-Zellkulturplatten platziert, um die Zellen möglichst kompakt adhärieren zu lassen. Nach ca. 1,5 - 2 Stunden im Inkubator bei 37 °C und einer feuchten 5%-igen CO2 Atmosphäre, wird das bereits vorhandene Medium in dem Well mit SC-Medium auf 1,5 ml aufgefüllt. Der Überstand wird nach 24 Stunden in der Zellkultur vorsichtig abgesaugt, die Zellen mit PBS/FCS sorgsam überspült, anschließend mit 2 ml frischem SC-Medium aufgefüllt und erneut im Inkubator platziert. Durch diesen Prozess werden die nichtadhärenten Zellen aus der Zellkultur entfernt.
3.2.4 Splitten, Ernten und Versorgen der Stromazellkultur
Protokoll:
Um Stromazellen des mesenterischen Lymphknotens (engl. mesenteric lymph node stromal cells, mLNSC) zu ernten oder auszudünnen und umzusetzen, werden die Zellen mit PBS unter ständigem Absaugen gründlich gespült. Anschließend werden 0,5 ml HUVEC T/E pro Well einer 6 Well-Zellkulturplatte gegeben. Das Abrunden und Lösen der Zellen vom Zellkulturboden muss unter dem Mikroskop (10 x Objektiv) beobachtet werden, um zeitgerecht eingreifen zu können und somit eine zu lange oder zu kurze Einwirkung des HUVEC T/E zu vermeiden. Haben sich die meisten Zellen abgerundet, werden sie vorsichtig abgeschlagen und anschließend mit dem HUVEC T/E, das sich in der Schale befindet kurz gespült. Nachfolgend wird zusätzlich 1 ml SC-Medium in die Schale gegeben, um den enzymatischen Prozess zu stoppen. Die Zellsuspension wird in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert, auf 15 ml mit SC-Medium aufgefüllt und bei 1200 U/min für 8 Minuten zentrifugiert. Zur Zellzahlbestimmung mit einer Neubauer-Zählkammer wird ein kleiner Teil der Zellsuspension vor dem Zentrifugieren entnommen. Der Überstand wird nach dem Zentrifugieren vorsichtig abgesaugt und das mLNSC-Pellet in SC-Medium aufgenommen.
Nun können die Zellen in ausgedünnter Zahl wieder in eine Zellkulturschale ausplattiert oder für Experimente eingesetzt werden. Für das Umsetzen der SC hat sich eine Ausdünnung von 1:2 oder 1:3 als optimal erwiesen. Abbildung 5A zeigt die phasenkontrastmikroskopische Aufnahme (20x Objektiv) einer mLNSC-Kultur vor dem nötigen Ausdünnen. Im Vergleich dazu zeigt Abbildung 5B eine Aufnahme der mLNSC-Kultur wenige Stunden nach dem Umsetzen.
Die Versorgung der Zellkultur richtet sich nach dem Grad der Zellbesiedelung und der
3.2.6 Behandlung von dendritischen Zellen mit C3-Toxin des Clostridium botulinum Um DC in ihrer Migration einzuschränken, wurden sie mit dem Zytotoxin C3 des anaeroben Bakteriums Clostridium botulinum behandelt. Das Toxin, welches in den beschriebenen Experimenten eingesetzt wurde, erhielten wir freundlicherweise von Prof.
Dr. Harald Genth, Mitarbeiter am Institut für Toxikologie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Protokoll:
Um das C3-Toxin einsetzen zu können, muss es zuvor von seiner Ausgangskonzentration (370 nM) mit dem Medium für Migrationsexperimente auf 1 nM verdünnt werden. Im Anschluss werden die DC mit diesem toxinhaltigen Medium aufgenommen, in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und für 2 Stunden in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen für 8 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert und mit dem Medium für Migrationsexperimente auf die endgültige Konzentration eingestellt.
3.2.7 Einfrieren und Auftauen von Knochenmarkszellen und mLNSC
Zum Einfrieren und somit Konservieren der gewonnenen Knochenmarkszellen wurde ein standardisiertes Protokoll genutzt. Zudem konnte dieses Verfahren auf das Einfrieren der SC übertragen werden, wobei statt eines Gefriermediums basierend auf DC-Medium eines basierend auf SC-Medium eingesetzt wurde. Mehrere Probeläufe zeigten keinerlei Einfluss des Verfahrens auf die SC.
Protokoll:
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konfluent bewachsenen Zellkulturtestplatte (alle 6 Wells) in 1 ml des Gefriermediums aufgenommen und eingefroren werden.
Beim Auftauen muss, ebenso wie beim Einfrieren, auf zügiges Arbeiten geachtet werden, da das Gefriermedium bei Raumtemperatur zelltoxisch wirkt. Das Cryotube mit den 10x 106 Zellen wird vom -150 °C UltraLow-Gefrierschrank in den 37 °C warmen Inkubator überführt, dabei ist darauf zu achten, dass die Zellsuspension, sobald sie aufgetaut ist, in 10 ml DC-Medium gegeben und abzentrifugiert wird. Die Zellen werden im Anschluss mit 16 ml DC-Medium und 4 ml GM-CSF auf 5x 106/10 ml eingestellt und auf zwei Petrischalen ausplattiert. Im weiteren Verlauf wird mit den DC-Progenitoren wie unter Kapitel 3.2.2 beschrieben verfahren. Der Inhalt eines SC enthaltenden Cryotubes wird mit dem gleichen Verfahren aufgetaut und auf eine komplette Zellkulturtestplatte ausgesät.
3.2.8 Durchflusszytometrie
Zur Phänotypbestimmung wurden die Zellen aus der Zellkultur geerntet, einige ihrer Oberflächenmoleküle mit Antikörpern markiert und mittels Durchflusszytometrie die Dichte der Expression dieser Moleküle auf den Zellen analysiert. Es wurde sowohl direkte als
Zur Phänotypbestimmung wurden die Zellen aus der Zellkultur geerntet, einige ihrer Oberflächenmoleküle mit Antikörpern markiert und mittels Durchflusszytometrie die Dichte der Expression dieser Moleküle auf den Zellen analysiert. Es wurde sowohl direkte als