1.2 Stromazellen der Lymphknoten
3.2.13 Zur Analyse und Auswertung genutzte Programme
Tabelle 17: Liste der verwendeten Programme
Name Hersteller
CellTracker Dr. rer. nat. Matthias Gunzer
Institute for Cell Biology, University of Münster
Axio Vision Carl Zeiss Microscopy GmbH
Jena, Deutschland
Imaris Bitplane AG
Zürich, Schweiz
ImageJ National Institutes of Health
Bethesda (Maryland), USA
GraphPad Prism 4 GraphPad Software, Inc.
San Diego (Kalifornien), USA
FreeHand MX Macromedia/ Adobe Systems Software Ireland
Limited Dublin, Irland
GeneTools-Software Syngene
Cambridge, UK
Microsoft Office Excel Microsoft Corporation Seattle (Washington), USA
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CCL21 (Abb. 10F-H) bei gleicher Konzentration. Mit zunehmenden Konzentrationen der Chemokine steigt auch die Geradlinigkeit der Zellwanderung deutlich.
Abbildung 10: CCL19 und CCL21 induzieren konzentrationsabhängig Chemotaxis
Die Migration von reifen DC in einer 3D-Kollagenmatrix wurde mittels Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet.
Einzelne Zellen wurden anschließend mit Hilfe des Programmes Celltracker manuell verfolgt. A, B) Ohne jeglichen chemotaktischen Stimulus zeigen die DC eine ungerichtete Migration im Kollagengel. Die einzelnen Tracks der Kontrollgruppe werden in A und B dargestellt. Zur besseren Veranschaulichung zeigt B die gleichen Tracks unter Positionierung alle Startpunkte auf einen gemeinsamen zentralen Punkt. C-H) Es wurden Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen von CCL19 oder CCL21 erstellt. Durch das Auffüllen der Kammer mit dem CCR7-Liganden enthaltenden Zellmedium wurde eine konzentrationsabhängige positive chemotaktische Migration ausgelöst. Die in einem Startpunkt positionierten Migrationstracks zeigen eine gerichtete Bewegung in Richtung CCL19 (C-E) und CCL21 (F-H). Der chemotaktische Stimulus befindet sich jeweils auf der linken Seite der Rechtecke. In Abbildung 10 wird repräsentativ ein Experiment von drei unabhängig durchgeführten Experimenten dargestellt.
Durch die Visualisierung der chemotaktischen Migration (Abb. 10C-H) wird deutlich erkennbar, dass mit zunehmender Chemokinkonzentration auch die Geradlinigkeit bzw.
Direktionalität der Migration steigt. Zur Objektivierung der Befunde wurde der Geradlinigkeitsindex (GI) als Messwerkzeug generiert (Kapitel 3.2.12). Der Index „0“ steht dabei für eine ungerichtete und der Index „1“ für eine linear, direkt gerichtete Bewegung.
Es konnte mit Hilfe des Geradlinigkeitsindex bestätigt werden, dass mit steigender
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4.4 Der Einfluss der CCR7-Liganden auf die Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix
Nach der Untersuchung der Direktionalität chemotaktischer Migration unter dem Einfluss von CCL19 und CCL21 wurde der Frage nachgegangen, ob die beiden Chemokine eine unterschiedliche Wirkung auf die Migrationsgeschwindigkeit ausüben.
Die Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit durch CCR7-Liganden wurde bereits in vorhergehenden Analyseverfahren, unter anderem von Worbs et al. (2007) und Riol-blanco et al. (2005), untersucht (39,40). Daher sollte zunächst geprüft werden, ob sich diese Ergebnisse auf die Migration in der dreidimensionalen Kollagenmatrix übertragen lassen. Es zeigte sich, dass die Migrationsgeschwindigkeit in dem von uns angewendeten System in Abwesenheit von Chemokinen 1,5 ± 0,1 µm/min beträgt (Abb. 12A, grauer Balken). Durch die Zugabe von CCR7-Liganden wurde eine signifikante Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit beobachtet. Die DC migrieren unter dem Einfluss von 200 nM CCL21 mit einer Geschwindigkeit von 1,8 ± 0,2 µm/min. Im Vergleich weisen 200 nM CCL19 eine deutlich potentere Wirkung auf, da hierbei eine Migrationsgeschwindigkeit von 2,3 ± 0,2 µm/min ermittelt wird (Abb. 12A).
Um auszuschließen, dass die Grundgeschwindigkeit der ungerichteten Migration von CCR7 abhängig ist, wurden anstatt der sonst verwendeten Wildtyp-DC (wt DC) solche eingesetzt, die aus dem Knochenmark CCR7-defizienter Mäuse generiert worden sind (CCR7-/-DC). Sie exprimieren durch zielgerichtete Gendeletion kein CCR7 auf ihrer Zelloberfläche und können somit auch nicht auf CCL19 oder CCL21 reagieren. Wie in Abbildung 12B dargestellt, wurde gezeigt, dass wt DC und CCR7-/-DC keinen signifikanten Unterschied in ihrer Grundgeschwindigkeit aufweisen. Die Migrationsgeschwindigkeit der CCR7-/-DC von 1,7 ± 0,2 µm/min blieb auch unter der Substitution von CCL19 mit 1,6 ± 0,1 µm/min ohne signifikante Veränderung. Es konnte somit eine Abhängigkeit zwischen der Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit und der Expression von CCR7 nachgewiesen werden. Weiterhin wurde ein direkter Zusammenhang zwischen CCR7 und der Grundgeschwindigkeit der ungerichteten Migration ausgeschlossen.
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54 Abbildung 15: Netzwerkbildung der mLNSC
In vitro kultivierte, adhärente GFP-exprimierende mLNSC wurden mit Trypsin von der Zellkulturplatte gelöst, in das Kollagengel transferiert und anschließend mit der Zeitraffermikroskopie analysiert. Hierbei wird durch die grün fluoreszierenden mLNSC eine besser differenzierte Darstellung der Zellmembranausstülpungen erzielt. Die initial abgerundeten mLNSC (A: 0h) beginnen sich zu strecken und Ausstülpungen zu bilden. Im Verlauf der Inkubation (B: 5h; C: 10h) entsteht so ein dreidimensionales Netzwerk mit stabilen Zell-Zell-Kontakten (C: Pfeil). Die Abbildung zeigt repräsentativ das in den folgenden Experimenten eingesetzte dreidimensionale Netzwerk der mLNSC.
Der vorliegenden Arbeit wurde ein USB-Speicherstick beigefügt. Das auf dem USB-Stick befindliche Video 1 zeigt deutlich, dass Ausstülpungen der Zellmembran gebildet werden und ein Netzwerk entsteht. Die Anzahl der Membranausstülpungen variierten stark zwischen den einzelnen Zellen. Auffällig in Video 1 ist die Interaktion bzw. die ausgeprägte Kontaktsuche der mLNSC zu deren Nachbarzellen. Die dreidimensionale Struktur des mLNSC-Netzwerkes konnte mit Hilfe der Konfokalmikroskopie dargestellt werden (Video 2). Die mLNSC bildeten zu Beginn der Netzwerkentstehung in alle Richtungen zumeist stark verzweigte Membranausstülpungen. Im weiteren Verlauf dieses dynamischen Prozesses bildeten sich viele der zarten und dünnen Zellmembranausstülpungen zurück.
Gleichzeitig stabilisieren sich andere und bleiben auf Dauer erhalten. Letztere sind vorwiegend Membranausstülpungen, die einen direkten Zell-Zell-Kontakt herstellen (Abb.
15C, Pfeil).
4.7 Die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und mLNSC
Um die Wirkung der mLNSC auf das Migrationsverhalten der reifen DC zu untersuchen, wurden, wie unter Punkt 3.2.5 beschrieben, fluoreszenzmarkierte DC gemeinsam mit GFP-exprimierenden mLNSC in die 3D-Kollagenmatrix transferiert, mittels Zeitraffermikroskopie aufgenommen und anschließend analysiert. Es zeigte sich in den Aufnahmen, dass die beiden Zelltypen Interaktionen eingehen und miteinander in Kontakt treten (siehe Video 3). Um diese Beobachtung zu objektivieren, wurden die DC über 2 Stunden mit dem C3-Toxin des Clostridium botulinum, einem selektiven Inhibitor der kleinen GTPasen, behandelt (vgl. Kapitel 1.1.8). Durch die Hemmung der Rho-GTPase wird die Senkung der DC-Migrationsgeschwindigkeit induziert (40). Durch die Inhibition der Rho-GTPase kommt es zu einer indirekten Beeinflussung des Aktinnetzwerks und der Zellmorphologie (52,53,72). Allerdings zeigt sich eine geringe Wirkung auf die chemotaktische Reaktion und keine Auswirkung auf die Adhäsionsfähigkeit der DC (40,54).
Die mit C3-Toxin behandelten DC und die unbehandelten Kontroll-DC wurden mit mLNSC in die Kollagenmatrix appliziert. Nach 4 - 6 Stunden wurde mittels der Konfokalmikroskopie eine dreidimensionale Aufnahme angefertigt (Abb. 16). Die Aufbereitung der Aufnahme sowie die Auswertung erfolgten anschließend mit dem Programm Imaris, was es ermöglichte, die Zellkontakte zwischen mLNSC und DC in allen drei Dimensionen zu erkennen (Abb. 16A-C). In Abbildung 16C werden die mLNSC in grün und die DC in rot dargestellt, und die X-Y-Ebene, X-Z-Ebene sowie die Y-Z-Ebene sind gleichzeitig einsehbar. Somit ist es möglich, die Kontaktstellen zwischen den Zellen klar zu identifizieren. Deutlich mehr als die Hälfte (73,7 ± 7 %) der unbehandelten DC standen im Zellkontakt mit den mLNSC (Abb. 16E). Die behandelten und somit in ihrer Migration eingeschränkten DC stellten zu 48,9 ± 11 % einen Zellkontakt mit den mLNSC her und
Mit Hilfe der Imaris Sofware kann aus den konfokalen Aufnahmen ein dreidimensionales Modell erstellt werden (Abb. 17). Bei der Analyse dieser dreidimensionalen Darstellung wird deutlich, dass die DC eine ausgeprägte Verbindung mit den mLNSC und ihren Ausläufern eingehen. Dabei befindet sich ein Großteil der Zelloberfläche in einem direkten Zell-Zell-Kontakt mit der Stromazelle.
Abbildung 17: Zell-Zell-Kontakt zwischen DC und mLNSC in 3D Darstellung
Die rot markierten, unbehandelten DC sitzen breitbasig auf den grün fluoreszierenden mLNSC. Die Abbildung zeigt zwei Positionen einer Rotationsdarstellung (ca. 180°).
4.8 Der synergistische Einfluss von Stromazellen und CCL19 auf die Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen
Es konnte in Kapitel 4.7 gezeigt werden, dass DC einen engen Zell-Zell-Kontakt mit mLNSC eingehen. In den folgenden Versuchsanordnungen wurde untersucht, in welchem Maße dies Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit und auf den Geradlinigkeitsindex
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In Abwesenheit von mLNSC und CCL19 migrierten die DC mit einer Grundgeschwindigkeit von 1,40 ± 0,26 µm/min in der Kollagenmatrix. Wie in Kapitel 4.4 beschrieben, kommt es durch das Hinzufügen von 200 nM CCL19 zu einem signifikanten Anstieg der Migrationsgeschwindigkeit auf 2,04 ± 0,40 µm/min. Durch das Integrieren von mLNSC in die Kollagenmatrix konnte ebenfalls eine statistisch signifikante Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit beobachtet werden (Abb. 18A). Diese Geschwindigkeits-erhöhung auf ca. 1,95 ± 0,27 µm/min kann mit dem Effekt von CCL19 verglichen werden.
Zwischen der Migrationsgeschwindigkeit, die durch 200 nM CCL19 ausgelöst wird, und der Migrationsgeschwindigkeit, die durch mLNSC hervorgerufen wird, kann kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
Darüber hinaus wurde festgestellt, dass durch die gemeinsame Anwesenheit beider Einflussfaktoren ein additiver Effekt auftritt. Bei gleichzeitigem Einsatz von CCL19 und mLNSC steigt die Migrationsgeschwindigkeit der DC auf 2,42 ± 0,41 µm/min. Diese liegt damit signifikant über der Migrationsgeschwindigkeit, welche durch die alleinige Präsenz von CCR7-Liganden oder mLNSC erreicht werden konnte (Abb. 18A).
Es ist bekannt, dass SC CCR7-Liganden exprimieren (73). Weiterhin wurde in Kapitel 4.4 (Abb. 13) gezeigt, dass bei steigender Chemokinkonzentration die Migrationsgeschwindigkeit zunimmt. Um zu überprüfen, ob die beobachtete Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit durch eine Konzentrationserhöhung von Chemokinen verursacht wird oder ob ein anderer, CCR7-Liganden-unabhängiger, Mechanismus verantwortlich ist, wurden CCR7-/-DC eingesetzt.
In Kapitel 4.4 (Abb. 12B) wurde bereits dargestellt, dass die Migrationsgeschwindigkeit ohne Einflussfaktoren (mLNSC und CCL19) kein signifikanter Unterschied zwischen CCR7-/-DC und wt DC aufweist. Die CCR7-/-DC erreichen im Durchschnitt eine Migrationsgeschwindigkeit von 1,70 ± 0,20 µm/min, wobei sie eine ungerichtete Migration aufweisen. Diese Grundgeschwindigkeit, mit der sich die CCR7-/-DC bewegen, blieb auch nach Hinzufügen von 200 nM CCL19 unverändert. Durch das Implementieren von mLNSC in die Kollagenmatrix konnte eine Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit von CCR7-/ -DC auf 1,98 ± 0,32 µm/min gemessen werden. Das zusätzliche Hinzufügen von CCL19 hatte keinen weiteren Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit der CCR7-/-DC (Abb.
18B).
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repräsentiert den Geradlinigkeitsindex unter dem Einfluss von CCR7-Liganden, mit oder ohne mLNSC. Die gezeigten Daten repräsentieren 20 mit CCL19 und 4 mit CCL21 durchgeführte, unabhängige Experimente.
Bei lediglich drei von insgesamt 20 Versuchen mit CCL19 konnte keine Reduktion des Geradlinigkeitsindex nachgewiesen werden (grau). Die Senkung des Geradlinigkeitsindex bei der Komplementierung der Setups mit mLNSC ist über den Mittelwert signifikant (gepaarter T-Test p= 0,0011). (*: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p <
0.001)
5 Diskussion
Migratorische DC wandern aus den nicht-lymphatischen Geweben in die drainierenden Lymphknoten, um je nach Art des Antigens, das sie präsentieren, Toleranz oder eine schützende Immunantwort zu induzieren. Das Stromazellnetzwerk der Lymphknoten, in die die DC einwandern, hat einen bedeutenden Einfluss auf die Kompartimentalisierung in T-Zell- und B-Zellzone sowie auf die Migration der Lymphozyten. Es ist allerdings noch nicht eindeutig geklärt, in welchem Umfang Stromazellen die Migration von DC in der dreidimensionalen Matrix des Lymphknotens beeinflussen.
Ziel der Arbeit war es, mehr über das Migrationsverhalten der reifen DC unter dem Einfluss der zwei CCR7-Liganden CCL19 und CCL21 und der im Lymphknoten befindlichen Stromazellen zu erfahren. Es wurde untersucht, welche unterschiedlichen Auswirkungen die Chemokine CCL19 und CCL21 auf die Migrationsgeschwindigkeit sowie auf die Direktionalität der Migration haben. Nachfolgend werden die Ergebnisse der Untersuchungen zusammengefasst und diskutiert.
5.1 Charakterisierung der GMCSF-differenzierten dendritischen Zellen
Die in den Experimenten eingesetzten DC wurden entsprechend eines modifizierten Protokolls nach Lutz et al. (1999) mittels GM-CSF Differenzierung gewonnen (27). Sie bestanden zu ca. 90 % aus Zellen mit einer hohen Expression an MHC-II-Molekülen, des Chemokinrezeptors CCR7 sowie der kostimulatorischen Moleküle CD80, CD40 und CD86 (Abb. 8). Dies entspricht den charakteristischen phänotypischen Hauptmerkmalen reifer dendritischer Zellen (74). Im Fokus der Untersuchungen stand der Chemokinrezeptor
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5.2 Vorteile der dreidimensionalen Kollagenmatrix gegenüber der Boyden-Kammer für die Analyse der Chemotaxis
Zunächst wird in den folgenden Ausführungen auf wesentliche Punkte hinsichtlich der methodischen Aufarbeitung der vorliegenden Analysen näher eingegangen.
Um die chemotaktische Wirkung der beiden Liganden mit einander zu vergleichen, wurde initial die Boyden-Kammer-Analyse eingesetzt (69). Dies ist ein häufig angewendetes Verfahren zur Analyse der Chemotaxis, aber auch mit einigen Einschränkungen behaftet
(77). Zum einen wird in der Boyden-Kammer die Integrin-abhängige Migration im
zweidimensionalen System analysiert. Damit sind die Ergebnisse nicht auf die Migration in einem dreidimensionalen System wie dem Lymphknoten übertragbar. Lämmermann et al.
(2008) demonstrierten in vivo und in vitro den wesentlichen Unterschied zwischen der Integrin-unabhängigen DC-Migration in einem 3D-System und der Integrin-abhängigen DC-Migration in einem 2D-System (55). Darüber hinaus ist es diffizil einen stabilen linearen Konzentrationsgradienten zu erreichen, so dass die Analysen nur schwer reproduzierbar sind (78). Das Einsetzen des Zellkultur-Insert in die Loch-Platte kann bereits Einfluss auf den Konzentrationsgradienten nehmen. Zusätzlich verstopfen die transmigrierenden DC die Poren der Membran, was die Diffusion des Chemokins durch die Poren beeinträchtigt. Ein weiterer Nachteil ist die mangelnde Möglichkeit der Visualisierung der Zellmigration durch den Filter. Der experimentelle Aufbau mit einer Boyden-Kammer ermöglicht somit keine weiterführenden Rückschlüsse bezüglich der DC-Migration im dreidimensionalen Raum. Aus diesen genannten Gründen wurde, entsprechend eines modifizierten Protokolls von Reichardt et al. (70), eine 3D-Kollagenmatrix genutzt, um weitere Untersuchungen durchzuführen. Der genaue experimentelle Aufbau wurde bereits ausführlich unter 3.2.10 beschrieben.
Im Gegensatz zur Boyden-Kammer, welche eine direkte Zellbeobachtung nicht ermöglicht, kann durch das durchsichtige Kollagengel bereits in der einfachen Konfokalmikroskopie eine hervorragende Visualisierung der Zellmigration erreicht werden. Die Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine noch präzisere Aussagekraft und eine vereinfachte Analyse. Somit kann die chemotaktische Migration der DC bezüglich der Geschwindigkeit sowie der Gradlinigkeit eingehend beurteilt und eine Unterscheidung zwischen gerichteter Chemotaxis und zufälliger Zellbewegung getroffen werden.
Zur Objektivierung der Ergebnisse aus den Boyden-Kammer-Analysen wurde der Migrationsindex genutzt. Dieser spiegelt lediglich die Anzahl der in die Membran chemotaktisch migrierten DC und somit proportional das Ausmaß der chemotaktischen Migration wieder. Im Gegensatz dazu ermöglichte der experimentelle Aufbau mittels 3D-Kollagenmatrix die Analyse der Migrationsgeschwindigkeit, der Geradlinigkeit der chemotaktischen Migration sowie der Zellinteraktionen. Als Maßstab der Geradlinigkeit wurde ein Geradlinigkeitsindex etabliert (Kapitel 3.2.12). Dieser Index dient der Quantifizierung der gerichteten Zellmigration, wobei ‚0‘ für eine absolut ungerichtete und
‚1‘ für eine absolut geradlinige Migration in ein und dieselbe Richtung steht. Der Index repräsentiert den Gesamtdurchschnitt der Migration aller Zellen im Experiment. Der bereits existente und in vielen Publikationen zitierte Direktheits-Index (engl.: directness index) beschreibt lediglich die Tendenz einer Zelle in einer geraden Linie zu wandern, vernachlässigt jedoch die Richtung der Migration einzelnen Zellen und wurde daher zur Analyse nicht verwendet (77,79).
5.3 Einfluss von CCL19 und CCL21 auf die Geradlinigkeit der DC-Migration in der dreidimensionalen Kollagenmatrix
Im Rahmen der Analyse unter der Zuhilfenahme der Boyden-Kammer konnte erwartungsgemäß bestätigt werden, dass mit steigender Konzentration der Chemokine der Migrationsindex ebenfalls zunimmt (Abb. 9), wobei CCL19 und CCL21, in Abhängigkeit ihrer Konzentration, unterschiedlich stark die chemotaktische Migration beeinflussen. Es zeigt sich, dass CCL19 bei entsprechend hoher Konzentration einen stärkeren chemotaktischen Einfluss auf die Migration der DC als CCL21 hat. Allerdings ist die Sensibilität des CCR7 für CCL21 bei geringen Konzentrationen höher als für CCL19. DC
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Aufgrund der o.g. begrenzten Analysemöglichkeiten mittels der Boyden-Kammer sollte für die weiteren Experimente die 3D-Kollagenmatrix eingesetzt werden. Zunächst musste hierzu die Übertragbarkeit der Ergebnisse aus dem Boyden-Kammer-Assay überprüft werden. Äquivalent zum Migrationsindex dient im experimentellen Aufbau der 3D-Kollagenmatrix der Geradlinigkeitsindex (vgl. Kapitel 3.2.12) zur Objektivierung der Chemotaxis.
Die DC zeigten in der 3D-Kollagenmatrix eine ungerichtete Migration, solange kein CCR7-Ligand im System vorlag. Wurde allerdings einer der CCR7-Liganden in den experimentellen Aufbau integriert, so setzte erwartungsgemäß eine direkte Migration entlang des Chemokingradienten in Richtung der höheren Konzentration ein (37,38,81). Interessanter war die Tatsache, dass die Migration unter dem Einfluss von CCL19 zielgerichteter war als unter CCL21. Zudem hatte die Konzentration der Chemokine ebenfalls eine deutliche Auswirkung auf die Geradlinigkeit der Migration. Im Vergleich zum Boyden-Kammer-Assay löst auch hier CCL19 eine zielgerichtetere Migration der DC aus. CCL21 ist jedoch in der 3D-Kollagenmatrix dem CCL19 auch in niedrigeren Konzentrationen unterlegen. Dies könnte ursächlich an der unterschiedlichen molekularen Struktur der beiden Chemokine liegen. Da dem CCL19 die verlängerte basische C-terminale Domäne fehlt, ist es als ungebundenes Chemokin ohne weiteres in der Lage, im 3D-Kollagengel einen Konzentrationsgradienten für die Chemotaxis zu erzeugen (32). Die unterschiedliche Rezeptorbindungskinetik der CCR7-Liganden könnte ebenfalls eine Abweichung der Geradlinigkeit der Migration verursachen (80). Die Bindungsaffinitäten zum CCR7, die G-Protein-Aktivierung und die chemotaktischen Eigenschaften von CCL19 und CCL21 sind ähnlich, aber nur CCL19 induziert eine CCR7-Internalisierung (82,83). Diese führt zu einer Abnahme der Oberflächenexpression (82) und bei massiver Reduktion des CCR7 zur Verringerung der Sensibilität gegenüber des chemotaktischen Reizes (83). Allerdings wurde festgestellt, dass der Grad der CCR7-Expression nicht direkt mit der Stärke des ausgelösten Effektes korreliert. Zudem erfolgt nach dem Recycling der Rücktransport des Rezeptors zur Plasmamembran, um dort erneut Liegenden zu binden (82). Aus diesem Grund führt die CCR7-Internalisierung nicht zwingend zu einer Verringerung der maximalen Signalwirkung (83). Zu einer Desensibilisierung des CCR7 und einer daraus folgenden Einschränkung der Migration führt lediglich eine unphysiologisch hohe Konzentration an CCL19 (300nM bei T-Zellen) (84).
Zusammenfassend wurde bestätigt, dass die Geradlinigkeit der Migration mit der Konzentration an Chemokin zunimmt. Zudem wurde gezeigt, dass ein signifikanter Unterschied in der Wirkungsstärke der zwei Chemokine auf die Geradlinigkeit der Migration besteht (Abb. 11A).
In dem, zur Analyse eingesetzten, experimentellen Aufbau wurde lediglich eine annähernde Geradlinigkeit erreicht. Dies liegt zum einen sicher an der Fortbewegung der DC, wobei die Zelle ständig ihre äußere Form aufgrund der Fließbewegung verändert (55), was bei der Analyse der Zellmigration zu kurzfristigen Richtungsänderungen führen kann.
Zum anderen macht die gegebene Matrixstruktur der Kollagenfasern eine Bewegung mit der Ausrichtung eines Migrationsindex von 1 nahezu unmöglich.
5.4 Einfluss von CCL19 und CCL21 auf die Migrations-geschwindigkeit der dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix
Die chemokinetische Wirkung der CCR7-Liganden auf T-Lymphozyten (85) und dendritischen Zellen (40,55) wurde bereits in verschiedenen Modellen untersucht und beschrieben. In zwei- sowie dreidimensionalen Systemen wurde nachgewiesen, dass CCL19 eine deutliche Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit von T-Lymphozyten (85) und dendritischen Zellen (40,55) bewirkt. Auch Worbs et al. (2007) demonstrierten in vivo eine signifikante Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit von T-Lymphozyten im Lymphknoten unter CCL21 (39).
In den o.g. Arbeiten von Riol-Blanco et al. (2005), Worbs et al. (2007) und Lämmermann et al. (2008) lassen sich grundsätzliche Gemeinsamkeiten feststellen. Sie alle haben die
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experimentelles Verfahren darstellt, mit dem Ergebnisse produziert werden, die repräsentativ und mit Resultaten anderer Publikationen vergleichbar sind.
Riol-Blanco et al. (2005) untersuchten die Migrationsgeschwindigkeit von DC im zweidimensionalen System unter dem Einfluss von CCL19 und CCL21. Diese Migrationsform ist, wie bereits in Kapitel 1.1.9 beschrieben, abhängig von Integrin-vermittelter Adhäsion. Bemerkenswert ist dabei, dass die somit ermittelte chemotaktische Migrationsgeschwindigkeit ca. viermal höher war als die in dieser Arbeit in der 3D-Kollagenmatrix beobachteten Ergebnisse.
Im zweidimensionalen System beobachtet man eine andere Migrationsform als im dreidimensionalen System, was eine Erklärung für die unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeiten bietet. Darüber hinaus bestehen noch weitere wesentliche Aspekte, die berücksichtigt werden müssen. In Kapitel 4.4 wurde bereits gezeigt, dass die Migrationsgeschwindigkeiten der DC von der Konzentration der CCR7-Liganden abhängig sind (Abb. 13). In der Arbeit von Riol-Blanco et al. wurde mit 200 ng/ml (entspricht ca. 636 nM) hohe Konzentrationen eingesetzt. Außerdem wurde in dieser Analyse keine Migration entlang eines Konzentrationsgradienten dargestellt. Die DC wurden in Zellmedium mit oder ohne CCR7-Ligand auf eine mit Fibronectin beschichteten Plastikschale gegeben und die Migrationsgeschwindigkeit über 2 Stunden mittels Videoanalyse ausgewertet (40).
Trotz des unterschiedlichen experimentellen Aufbaus und der grundsätzlich unterschiedlichen Migrationsform ist eine Parallele erkennbar. In beiden Systemen
Trotz des unterschiedlichen experimentellen Aufbaus und der grundsätzlich unterschiedlichen Migrationsform ist eine Parallele erkennbar. In beiden Systemen