1.2 Stromazellen der Lymphknoten
3.1.1 Geräte und Einwegartikel
In Tabellen 2 und 3 sind die verwendeten Geräte und Einwegartikel aufgelistet.
Tabelle 2: Liste der verwendeten Geräte
Gerät Typenbezeichnung/ Hersteller
Boyden Kammer 48-Well Micro Chemotaxis Chamber (NeuroProbe, USA) Cryo 1°C Freezing Container Nalgene
Durchflusszytometer LSR II (BD Biosciences)
Feinwaage BP 310 s (Sartorius AG)
Heizplatte Safetycontrol (Scientific Ind., USA)
Inkubatoren MCO-20AIC (Sanyo)
Multitron II (Infors) Kühlschränke/
Gefrierschränke
Premium (Liebherr) UltraLow -152°C (Sanyo) UltraLow -80°C (Sanyo) Kühlzentrifuge Heraeus Multifuge 3 S-R
Mikroskope Axiovert 200M (Zeiss)
Axiovert 25 (Zeiss)
LSM 510 META (Konfokalmikroskop) (Zeiss) + Digitalkamera ORCA-ER (Hamamatsu, Japan)
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Eismaschine Ziegra
Präparationsbesteck Aesculap/Dumont
Pinsel (Größe 4) Figueras
Wasserbad GFL 1002
Gelscanner GeneGenius System, BioIMAGING System
Zählkammer Neubauer improved Marienfeld
Tabelle 3: Liste der verwendeten Einwegartikel
Einwegartikel Hersteller
Deckgläser 18x18mm Roth
Einmal-Kanülen Braun
Einwegskalpelle Feather
Einwegspritzen Braun
FACS-Röhrchen Greiner bio-one
Cryotube (1,5ml, PP) Cryovial von Simport
Micro Tubes, Safe-Seal Reagiergefäße Sarstedt
Objektträger 76x26mm Menzel GmbH
Petrischalen (ø94x16mm) Greiner bio-one
Pipetten Diverse (Eppendorf)
Steril Filter-System (150ml) Corning
Zellkultur-Schalen (ø100x20mm) TPP (Schweiz)
6-well Zellkulturtestplatten TPP (Schweiz)
96-well Mikrotiterplatten (mit Spitzböden) Greiner bio-one
Zentrifugenröhrchen (15ml/ 50ml) Greiner bio-one
3.1.2 Medien, Seren und Lösungen
In den Tabellen 4 bis 7 sind die verwendeten Seren und Medien aufgelistet, darunter auch die für SC und DC benötigten Zellkulturmedien, sowie das für die Migrationsexperimente eingesetzte Medium. Zudem befinden sich in Tabelle 8 bis 12 die verwendeten Puffer, Lösungen sowie das Gefrier- und Verdauungsmedium.
Tabelle 4: Liste der verwendeten Seren und Medien
Serum/Medium Hersteller
Fetal Calf Serum (FCS) PAA
MEM 10x (Minimum Essential Medium) Gibco (Invitrogen)
Rattenserum Sigma-Aldrich
RPMI 1640 Medium (ohne Glutamin) Gibco (Invitrogen)
Tabelle 5: Verwendetes Zellkulturmedium für dendritische Zellen (DC-Medium)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
FCS 10% 50ml PAA
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Gibco
Tabelle 6: Verwendetes Zellkulturmedium für mesenterische Lymphknoten Stromazellen (SC-Medium)
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Tabelle 7: Verwendetes Medium für Migrationsexperimente im Kollagengel
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
RPMI-1640 500ml Gibco
L-Glutamin 1% 5ml Gibco
Penicillin/ Streptomycin 1% 5ml Gibco
Gentamycin 0,045% 250µl Gibco
ß-Mercapto-Ethanol 3x10-4% 1,8µl Sigma-Aldrich
HEPES 2,5mM 20nM 4ml Roth
Tabelle 8: Verwendetes Gefriermedium
Inhaltsstoffe Menge Hersteller
Dimethylsulfoxid (DMSO) 5ml Sigma-Aldrich
Fetal Calf Serum (FCS) 15ml PAA
DC-Medium 30ml Institut für Immunologie
Tabelle 9: Verwendete HEPES-BSS-Puffer
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
Aqua dest. (ddH2O) 500ml Institut für Immunologie
NaCl 137mM 4,003g Roth
HEPES (2,5mM) 20mM 2,5ml Roth
NaOH bis pH 7,4 … Roth
Tabelle 10: Verwendete Lösung zur SC-Lösung aus der Zellkultur (HUVEC-T/E)
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
HEPES-BSS 500ml Institut für Immunologie
EDTA (Dinatriumsalz) 0,03% 150mg Roth
Trypsin 0,04% 200mg Roth
Tabelle 11: Verwendetes Verdaumedium
Inhaltsstoffe Endkonzentration Menge Hersteller
SC-Medium 5ml Institut für Immunologie
Kollagenase A 0,5mg/ml + Dnase1 50U/ml
10% 500µl Roche
Roche
Tabelle 12: Liste weiterer verwendeter Lösungen
Lösung Inhaltsstoffe Endkonz. Hersteller
Blockierungspuffer PBS
Diff-Quik (Fixiermittellösung) Methyl Alcohol 100% Dade Behring Trypanblau-Lösung Trypanblau
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3.1.3 Zytokine, Chemokine und weitere Substanzen
In Tabellen 13 bis 16 sind Zytokine, Chemokine, Antikörper und weitere verwendete
rmCCL19 (ELC, MIP-3β) 30 ng/ml R&B Systems
rmCCL21 (SLC, 6Ckine) 10 µM R&B Systems
Tabelle 15: Liste weiterer verwendeter Substanzen
Name Hersteller
Kollagen Typ I (PureCol, Produkt vom Rind, 3 mg/mL) INAMED 5-Carboxytetramethylrhodamin (5-TAMRA) 5mM in
Tabelle 16: Liste der verwendeten Antikörper
Bindendes AG Fluorochrom Hersteller
CD54 (ICAM-1) (Klon 3E2) PE Pharmingen
CD80 (Klon 16-10A1) PE Pharmingen
CD40 (Klon MAB 89) PE Immunotech
CD86 (Klon Bu63) APC Caltag/Invitrogen
CD106 (VCAM-1) (Klon 429 (MVCAM.A)) bio Pharmingen
MHC-II (I-Ab) (Klon AF6-120.1) bio BD Biosciences
ELC (unaufgereinigter Antikörper, human) Institut für Immunologie gp38 (unaufgereinigter Antikörper, hamster) Institut für Immunologie Goat anti-human IgG (Order Nr. 109-115-098) PE Jackson
Goat anti-hamster IgG (Order Nr. 127-135-160)
APC Jackson
Streptavidin (Order Nr. S32365) PacO Molecular Probes/
Invitrogen
PE: Phycoerythrin, APC: Allophycocyanin, PacO: Pacific-Orange, bio: Antigen ist kovalent mit Biotin verbunden
3.1.4 Versuchstiere
Für die Experimente wurden 8 bis 12 Wochen alte C57/BL6/N Mäuse verwendet, die von der Firma Charles River Laboratories bezogen wurden.
Die CCR7-defizienten Mäuse (38) (B6.129P2(C)-Ccr7tmRfor/J (CCR7-/-)) und die plt/plt-Mäuse wurden auf einen C57BL/6 Hintergrund zurückgekreuzt und in dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover gehalten. Bei dem CCR7-/-Stamm wurde das Exon 3 des CCR7-Gens unterbrochen, so dass CCR7 nicht exprimiert wird.
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Die Tiere wurden unter festgelegten spezifisch pathogenfreien Bedingungen (SPF) gehalten. Die Tierhaltung, -pflege und -experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutes und den staatlichen Regeln durchgeführt. Vor Beginn der Experimente habe ich, Sebastian Schröder, an der Vorlesungsreihe „Grundlagen der Versuchstierkunde und perioperative Betreuung von Versuchstieren“ inklusive praktischem Teil am „Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium“ der MHH teilgenommen. Meine Tätigkeiten umfassten das Töten der Tiere und die Entnahme von Organen.
3.2 Methoden
3.2.1 Differenzierung dendritischer Zellen aus Vorläuferzellen des Knochenmarks Die Differenzierung der DC wurde entsprechend eines modifizierten Protokolls nach Lutz et al. (1999) durchgeführt (27). Hierbei werden die DC-Progenitoren enthaltenden Knochenmarkszellen gewonnen und über 7 Tage in Kulturmedium mit dem Zusatz von GM-CSF inkubiert, wobei DC differenzieren.
Protokoll:
Nach der Betäubung und Tötung der Maus mit CO2 wird der Tod durch Reflextest gesichert und das Fell mit 70%-igem Ethanol abgewaschen. Im Anschluss werden die Hinterläufe des Spendertieres von Fell, Haut und der Muskulatur befreit. Die Beine werden im Bereich der Hüftknochen disloziert, die Füße entfernt und der Oberschenkel vom Unterschenkel getrennt. Anschließend werden die Knochen von ggf. vorhandenen Sehnen und eventuellen Verunreinigungen befreit. Hierbei wird darauf geachtet, dass die Knochen intakt bleiben, damit keine Kontaminierung mit Keimen erfolgt. Die gereinigten Knochen werden in PBS eingelegt und auf Eis gekühlt. Nach der Präparation aller Knochen wird unter der Sterilwerkbank weitergearbeitet, und es werden nur noch sterile Lösungen verwendet. Die Knochen werden in 70%-igem Ethanol für 2 Minuten desinfiziert und kurz in PBS gewaschen. Die Epiphysen werden vom Knochen mit einer Schere abgetrennt und durch die eröffneten Enden das Knochenmark aus Femur sowie Tibia mittels einer Spritze und aufgesteckter Kanüle mit 5 ml sterilem PBS ausgespült. Anschließend wird das
Knochenmark in einer Petrischale gesammelt und die Zellen mit der Spritze durch zwei- bis dreimaliges Aufnehmen und Herausspritzen vereinzelt. Im Folgenden werden 10 ml DC-Medium (siehe Tabelle 5) hinzugegeben und die Zellsuspension in einem 50 ml Röhrchen für 8 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Danach wird der Überstand abgesaugt, das Zellpellet in 10 ml DC-Medium resuspendiert, ein kleiner Teil der Zellsuspension mit Trypanblau gefärbt und in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt.
Nur die vitalen Zellen werden gezählt. Trypanblau als saurer Farbstoff durchdringt die defekte Zellmembran toter Zellen, bindet als Anion an zytosolische Proteine und erzeugt somit die Blaufärbung der avitalen Zellen. Die Suspension wird auf 5 x 106 vitale Zellen pro 8 ml DC-Medium eingestellt und 8 ml der Suspension mit 2 ml GM-CSF (5:1) komplettiert. Schließlich erfolgt die Ausplattierung der Zellen zu je 10 ml pro Petrischale (ø 94 x 16 mm).
3.2.2 Die Kultivierung der dendritischen Zellen und die Induktion ihrer Reifung
Die Zellen wurden im Brutschrank (Inkubator) bei 37 °C und 5%-igem CO2 -Atmosphärengehalt kultiviert.
Protokoll:
Wie unter Kapitel 3.2.1 beschrieben, erfolgt die Ausdifferenzierung der im Knochenmark enthaltenen Progenitoren zu DC durch den Einsatz des Zytokins GM-CSF. Am dritten Tag der Kultur werden 8 ml DC-Medium und 2 ml GM-CSF pro Petrischale hinzugegeben. An Tag 6 werden 10 ml des Überstandes vorsichtig entnommen, in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und die Zellen bei 1200 U/min über 8 Minuten mit Bremse abzentrifugiert. Nachdem der Überstand abgesaugt ist, wird das Zellpellet in 8 ml
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(ø 100 x 20 mm) plattiert. Abschließend werden zur Stimulation TNF-α (30 ng/ml) und PGE2 (1 µg/ml) eingesetzt. An Tag 9 können die reifen DC durch gründliches Abspülen von der Schale geerntet und für die Experimente eingesetzt werden.