1.2 Stromazellen der Lymphknoten
3.2.4 Splitten, Ernten und Versorgen der Stromazellkultur
Protokoll:
Um Stromazellen des mesenterischen Lymphknotens (engl. mesenteric lymph node stromal cells, mLNSC) zu ernten oder auszudünnen und umzusetzen, werden die Zellen mit PBS unter ständigem Absaugen gründlich gespült. Anschließend werden 0,5 ml HUVEC T/E pro Well einer 6 Well-Zellkulturplatte gegeben. Das Abrunden und Lösen der Zellen vom Zellkulturboden muss unter dem Mikroskop (10 x Objektiv) beobachtet werden, um zeitgerecht eingreifen zu können und somit eine zu lange oder zu kurze Einwirkung des HUVEC T/E zu vermeiden. Haben sich die meisten Zellen abgerundet, werden sie vorsichtig abgeschlagen und anschließend mit dem HUVEC T/E, das sich in der Schale befindet kurz gespült. Nachfolgend wird zusätzlich 1 ml SC-Medium in die Schale gegeben, um den enzymatischen Prozess zu stoppen. Die Zellsuspension wird in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert, auf 15 ml mit SC-Medium aufgefüllt und bei 1200 U/min für 8 Minuten zentrifugiert. Zur Zellzahlbestimmung mit einer Neubauer-Zählkammer wird ein kleiner Teil der Zellsuspension vor dem Zentrifugieren entnommen. Der Überstand wird nach dem Zentrifugieren vorsichtig abgesaugt und das mLNSC-Pellet in SC-Medium aufgenommen.
Nun können die Zellen in ausgedünnter Zahl wieder in eine Zellkulturschale ausplattiert oder für Experimente eingesetzt werden. Für das Umsetzen der SC hat sich eine Ausdünnung von 1:2 oder 1:3 als optimal erwiesen. Abbildung 5A zeigt die phasenkontrastmikroskopische Aufnahme (20x Objektiv) einer mLNSC-Kultur vor dem nötigen Ausdünnen. Im Vergleich dazu zeigt Abbildung 5B eine Aufnahme der mLNSC-Kultur wenige Stunden nach dem Umsetzen.
Die Versorgung der Zellkultur richtet sich nach dem Grad der Zellbesiedelung und der
3.2.6 Behandlung von dendritischen Zellen mit C3-Toxin des Clostridium botulinum Um DC in ihrer Migration einzuschränken, wurden sie mit dem Zytotoxin C3 des anaeroben Bakteriums Clostridium botulinum behandelt. Das Toxin, welches in den beschriebenen Experimenten eingesetzt wurde, erhielten wir freundlicherweise von Prof.
Dr. Harald Genth, Mitarbeiter am Institut für Toxikologie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Protokoll:
Um das C3-Toxin einsetzen zu können, muss es zuvor von seiner Ausgangskonzentration (370 nM) mit dem Medium für Migrationsexperimente auf 1 nM verdünnt werden. Im Anschluss werden die DC mit diesem toxinhaltigen Medium aufgenommen, in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und für 2 Stunden in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen für 8 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert und mit dem Medium für Migrationsexperimente auf die endgültige Konzentration eingestellt.
3.2.7 Einfrieren und Auftauen von Knochenmarkszellen und mLNSC
Zum Einfrieren und somit Konservieren der gewonnenen Knochenmarkszellen wurde ein standardisiertes Protokoll genutzt. Zudem konnte dieses Verfahren auf das Einfrieren der SC übertragen werden, wobei statt eines Gefriermediums basierend auf DC-Medium eines basierend auf SC-Medium eingesetzt wurde. Mehrere Probeläufe zeigten keinerlei Einfluss des Verfahrens auf die SC.
Protokoll:
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konfluent bewachsenen Zellkulturtestplatte (alle 6 Wells) in 1 ml des Gefriermediums aufgenommen und eingefroren werden.
Beim Auftauen muss, ebenso wie beim Einfrieren, auf zügiges Arbeiten geachtet werden, da das Gefriermedium bei Raumtemperatur zelltoxisch wirkt. Das Cryotube mit den 10x 106 Zellen wird vom -150 °C UltraLow-Gefrierschrank in den 37 °C warmen Inkubator überführt, dabei ist darauf zu achten, dass die Zellsuspension, sobald sie aufgetaut ist, in 10 ml DC-Medium gegeben und abzentrifugiert wird. Die Zellen werden im Anschluss mit 16 ml DC-Medium und 4 ml GM-CSF auf 5x 106/10 ml eingestellt und auf zwei Petrischalen ausplattiert. Im weiteren Verlauf wird mit den DC-Progenitoren wie unter Kapitel 3.2.2 beschrieben verfahren. Der Inhalt eines SC enthaltenden Cryotubes wird mit dem gleichen Verfahren aufgetaut und auf eine komplette Zellkulturtestplatte ausgesät.
3.2.8 Durchflusszytometrie
Zur Phänotypbestimmung wurden die Zellen aus der Zellkultur geerntet, einige ihrer Oberflächenmoleküle mit Antikörpern markiert und mittels Durchflusszytometrie die Dichte der Expression dieser Moleküle auf den Zellen analysiert. Es wurde sowohl direkte als auch indirekte Immunfluoreszenz eingesetzt. Bei dem Verfahren der indirekten Immunfluoreszenz werden zunächst antigenspezifische Primärantikörper eingesetzt und im zweiten Schritt diese primären Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Sekundärantikörper markiert.
Alle Antikörperfärbungen werden in 96 Well-Mikrotiterplatten durchgeführt, wobei die Inkubation der Zellen mit dem Antikörper auf Eis stattfindet. Das Waschen zwischen den einzelnen Inkubationen beinhaltet das Abzentrifugieren der Zellen (1200 U/min bei 4 °C), das rasche Abschlagen der Überstände und das Wiederaufnehmen der Zellen in Suspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren. Das standardmäßige Protokoll für indirekte Immunfluoreszenz wurde durchgeführt bei der Antikörperfärbung von CD106, MHC-II, ELC und gp38 als Primärantikörper und mit Streptavidin-PacO (Pacific Orange), goat anti-human IgG-PE (Phycoerythrin) sowie goat anti-hamster IgG-APC (Allophycocyanin) als Sekundärantikörper. Zur direkten Immunfluoreszenzfärbung, bei welcher der zweite Färbe- und anschließende Waschschritt wegfällt, wurden CD54-PE, CD80-PE, CD40-PE und CD86-APC eingesetzt.
Protokoll für die indirekte Immunfluoreszenz:
Im ersten Schritt werden die zu analysierenden Zellen geerntet und für 30 min in Blockierungspuffer auf Eis inkubiert. Somit werden unspezifische Bindungen vermieden.
Nach dem ersten Waschen mit PBS/FCS folgt für eine Stunde die Inkubation auf Eis mit dem Primärantikörper. Im Anschluss an einen weiteren Waschdurchgang werden die Zellen mit dem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper für weitere 45 Minuten ebenfalls auf Eis inkubiert. Dem dritten und letzten Waschschritt folgt die Resuspension des Zellpellet in PBS/FCS und das Überführen in ein FACS-Röhrchen. Kurz vor der Analyse mit dem Durchflusszytometer wird 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) hinzugegeben. Die von DAPI gefärbten toten Zellen können somit bei der Analyse ausgeschlossen werden.
3.2.9 Ermittlung des Migrationsindex mit einer Boyden-Kammer
Um die Reaktion von reifen DC auf ansteigende Konzentrationen der CCR7-Liganden CCL19 und CCL21 zu untersuchen, nutzten wir das Boyden-Kammer-Experiment. Der Boyden-Kammer-Assay ist ein häufig verwendetes Verfahren für chemotaktische Studien, da es durch seine Einfachheit besticht. Die Boyden-Kammer wurde von Stephen Boyden 1962 an der Australian National University in Canberra entwickelt und besteht aus zwei Kammern, die durch einen mikroporösen Filter bzw. Membran getrennt sind (69).
Es wird eine 48-Well Boyden-Kammer und eine kommerziell erhältliche Polycarbonatmembran mit 5 µm großen Poren (NeuroProbe) verwendet. Die Membran wird zuvor über Nacht mit 20 µg/ml Mauskollagen Typ IV (BD Biosciences) in PBS beschichtet. Während des Migrationsexperimentes werden 1-1.5x 105 reife DC in RPMI 1640/20 mM HEPES (pH 7.4) in die oberen Wells gegeben und das Chemokin in die korrespondierenden darunterliegenden Wells. Durch Diffusion entsteht in den Poren des
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Chemotaxis unter steigender Chemokinkonzentration im Vergleich zur Migration ohne chemotaktischen Einfluss an. Die Wells, welche nicht mit Chemokin gefüllt sind, dienen als Kontrollgruppe, bzw. die Farbdichte ihrer Membran als Referenzwerte. Zur Berechnung des Index wird die Differenz der Farbdichte zwischen zwei aufeinander folgenden Chemokinkonzentrationen ermittelt und mit der Farbdichte aus der Kontrollgruppe ins Verhältnis gesetzt. Ein Migrationsindex von 1 steht für eine Migration ohne Einfluss eines Chemokins.
3.2.10 Migrationsexperimente in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix
Bei der Herstellung der Migrationskammer und des Kollagengels für diese in vitro Migrationsversuche wurde entsprechend eines modifizierten Protokolls von Reichardt et al. (70) vorgegangen.
3.2.10.1 Konstruktion der Migrationskammer
Für das in vitro Migrationsexperiment wurde eine spezielle Kammer (Abb. 6) zum einmaligen Gebrauch angefertigt. Hierzu wird auf einem einfachen Objektträger (76 x 26 mm) mit einem Pinsel (Größe 4) ein U-förmiger Rahmen aus einem Paraffin-Vaseline-Gemisch (70:30) aufgetragen. Um dabei ein reproduzierbares Ergebnis zu erreichen, müssen die Bedingungen möglichst gleich gehalten werden. Dabei haben sich folgende Parameter als optimal erwiesen: Die Temperatur des Gemisches beträgt 150 °C. Jede Seite des Rahmens wird einzeln aufgemalt, wobei die zweite Schicht in entgegengesetzter Richtung aufgetragen wird. Es ist dabei auf eine gleichmäßige Höhe des Rahmens zu achten. Anschließend lässt man den Rahmen aushärten, sodass ein Deckglas (18 x 18 mm) auf ihm platziert werden kann. Dieses wird im nächsten Schritt mit dem Paraffin-Vaseline-Gemisch wasserdicht fixiert. Nur eine Seite der Kammer bleibt zur Befüllung offen. Bei einer Rahmengröße von 1,5 x 1,5 cm und einem gleichmäßigen Rahmen hat die Kammer ein Füllvolumen von ca. 100 µl.
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42 3.2.11 Auswertung der Time Lapse-Aufnahmen
Die Zeitrafferaufnahmen (engl.: Time Lapse) wurden unter dem Zeiss Mikroskop Axiovert 200M (5x Objektiv) mit Inkubatoraufbau (37 °C) angefertigt. Das Programm AxioVision diente zur Anfertigung der Datensätze, welche nach ihrem Export entweder mit dem Programm CellTracker oder mit der Imaris (Bitplane) Software ausgewertet wurden.
3.2.11.1 Auswertung mit CellTracker
Das Programm CellTracker skizziert den Migrationspfad auf der Basis einer manuellen Verfolgung der Zellen (71). Zu Beginn der Analyse werden 30 Zellen randomisiert ausgewählt. Diese stellen eine repräsentative Gruppe der gesamten Zellen im Experiment dar. Dann wird die Zeitrafferaufnahme abgespielt, wobei jede einzelne der ausgewählten Zellen mit dem Cursor auf dem Display verfolgt wird. Das Programm speichert die Koordinaten des Cursors, wodurch der Migrationspfad rekonstruiert und die Durchschnittsgeschwindigkeit (engl.: velocity) der Migration berechnet werden kann. Die in Abbildung 10 aufgezeigten Darstellungen von Migrationspfaden wurden mit CellTracker erstellt. Zur weiteren Analyse wurden die Daten in Microsoft Excel importiert und mit Hilfe eines von Dr. rer. nat. Matthias Gunzer (Institute for Cell biology University of Münster) erstellten Makros ausgewertet.
3.2.11.2 Auswertung mit Imaris
Das Programm Imaris ist in der Lage, die Zellen automatisch zu verfolgen (engl.: tracking).
Die korrekte Ausführung der automatischen Analyse wurde anschließend manuell kontrolliert, und nur die Tracks (dt.: Verfolgungsspur der Zellbewegung), die über 6 Minuten erfasst werden konnten, wurden auch in die Analyse einbezogen. Zudem muss man beachten, dass einige Zellen den Transfer in das Kollagengel nicht überlebten oder auf dem Boden der Kammer adhärent festsaßen. Um die Durchschnittsgeschwindigkeit der lebenden Zellen zu analysieren und eine fälschliche Senkung der Durchschnittswerte durch tote, sich nicht bewegende Zellen zu vermeiden, wurden die Tracks dieser Zellen durch den Einsatz der Filterfunktionen von Imaris aus den Gesamtanalysen ausgeschlossen. Die Kalkulation der Durchschnittsgeschwindigkeit der Zellen erfolgte ebenfalls durch Imaris. Die X- und Y-Koordinaten der Track-Startpunkte und -Endpunkte
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3.2.13 Zur Analyse und Auswertung genutzte Programme
Tabelle 17: Liste der verwendeten Programme
Name Hersteller
CellTracker Dr. rer. nat. Matthias Gunzer
Institute for Cell Biology, University of Münster
Axio Vision Carl Zeiss Microscopy GmbH
Jena, Deutschland
Imaris Bitplane AG
Zürich, Schweiz
ImageJ National Institutes of Health
Bethesda (Maryland), USA
GraphPad Prism 4 GraphPad Software, Inc.
San Diego (Kalifornien), USA
FreeHand MX Macromedia/ Adobe Systems Software Ireland
Limited Dublin, Irland
GeneTools-Software Syngene
Cambridge, UK
Microsoft Office Excel Microsoft Corporation Seattle (Washington), USA
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CCL21 (Abb. 10F-H) bei gleicher Konzentration. Mit zunehmenden Konzentrationen der Chemokine steigt auch die Geradlinigkeit der Zellwanderung deutlich.
Abbildung 10: CCL19 und CCL21 induzieren konzentrationsabhängig Chemotaxis
Die Migration von reifen DC in einer 3D-Kollagenmatrix wurde mittels Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet.
Einzelne Zellen wurden anschließend mit Hilfe des Programmes Celltracker manuell verfolgt. A, B) Ohne jeglichen chemotaktischen Stimulus zeigen die DC eine ungerichtete Migration im Kollagengel. Die einzelnen Tracks der Kontrollgruppe werden in A und B dargestellt. Zur besseren Veranschaulichung zeigt B die gleichen Tracks unter Positionierung alle Startpunkte auf einen gemeinsamen zentralen Punkt. C-H) Es wurden Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen von CCL19 oder CCL21 erstellt. Durch das Auffüllen der Kammer mit dem CCR7-Liganden enthaltenden Zellmedium wurde eine konzentrationsabhängige positive chemotaktische Migration ausgelöst. Die in einem Startpunkt positionierten Migrationstracks zeigen eine gerichtete Bewegung in Richtung CCL19 (C-E) und CCL21 (F-H). Der chemotaktische Stimulus befindet sich jeweils auf der linken Seite der Rechtecke. In Abbildung 10 wird repräsentativ ein Experiment von drei unabhängig durchgeführten Experimenten dargestellt.
Durch die Visualisierung der chemotaktischen Migration (Abb. 10C-H) wird deutlich erkennbar, dass mit zunehmender Chemokinkonzentration auch die Geradlinigkeit bzw.
Direktionalität der Migration steigt. Zur Objektivierung der Befunde wurde der Geradlinigkeitsindex (GI) als Messwerkzeug generiert (Kapitel 3.2.12). Der Index „0“ steht dabei für eine ungerichtete und der Index „1“ für eine linear, direkt gerichtete Bewegung.
Es konnte mit Hilfe des Geradlinigkeitsindex bestätigt werden, dass mit steigender
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4.4 Der Einfluss der CCR7-Liganden auf die Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen in der dreidimensionalen Kollagenmatrix
Nach der Untersuchung der Direktionalität chemotaktischer Migration unter dem Einfluss von CCL19 und CCL21 wurde der Frage nachgegangen, ob die beiden Chemokine eine unterschiedliche Wirkung auf die Migrationsgeschwindigkeit ausüben.
Die Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit durch CCR7-Liganden wurde bereits in vorhergehenden Analyseverfahren, unter anderem von Worbs et al. (2007) und Riol-blanco et al. (2005), untersucht (39,40). Daher sollte zunächst geprüft werden, ob sich diese Ergebnisse auf die Migration in der dreidimensionalen Kollagenmatrix übertragen lassen. Es zeigte sich, dass die Migrationsgeschwindigkeit in dem von uns angewendeten System in Abwesenheit von Chemokinen 1,5 ± 0,1 µm/min beträgt (Abb. 12A, grauer Balken). Durch die Zugabe von CCR7-Liganden wurde eine signifikante Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit beobachtet. Die DC migrieren unter dem Einfluss von 200 nM CCL21 mit einer Geschwindigkeit von 1,8 ± 0,2 µm/min. Im Vergleich weisen 200 nM CCL19 eine deutlich potentere Wirkung auf, da hierbei eine Migrationsgeschwindigkeit von 2,3 ± 0,2 µm/min ermittelt wird (Abb. 12A).
Um auszuschließen, dass die Grundgeschwindigkeit der ungerichteten Migration von CCR7 abhängig ist, wurden anstatt der sonst verwendeten Wildtyp-DC (wt DC) solche eingesetzt, die aus dem Knochenmark CCR7-defizienter Mäuse generiert worden sind (CCR7-/-DC). Sie exprimieren durch zielgerichtete Gendeletion kein CCR7 auf ihrer Zelloberfläche und können somit auch nicht auf CCL19 oder CCL21 reagieren. Wie in Abbildung 12B dargestellt, wurde gezeigt, dass wt DC und CCR7-/-DC keinen signifikanten Unterschied in ihrer Grundgeschwindigkeit aufweisen. Die Migrationsgeschwindigkeit der CCR7-/-DC von 1,7 ± 0,2 µm/min blieb auch unter der Substitution von CCL19 mit 1,6 ± 0,1 µm/min ohne signifikante Veränderung. Es konnte somit eine Abhängigkeit zwischen der Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit und der Expression von CCR7 nachgewiesen werden. Weiterhin wurde ein direkter Zusammenhang zwischen CCR7 und der Grundgeschwindigkeit der ungerichteten Migration ausgeschlossen.
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54 Abbildung 15: Netzwerkbildung der mLNSC
In vitro kultivierte, adhärente GFP-exprimierende mLNSC wurden mit Trypsin von der Zellkulturplatte gelöst, in das Kollagengel transferiert und anschließend mit der Zeitraffermikroskopie analysiert. Hierbei wird durch die grün fluoreszierenden mLNSC eine besser differenzierte Darstellung der Zellmembranausstülpungen erzielt. Die initial abgerundeten mLNSC (A: 0h) beginnen sich zu strecken und Ausstülpungen zu bilden. Im Verlauf der Inkubation (B: 5h; C: 10h) entsteht so ein dreidimensionales Netzwerk mit stabilen Zell-Zell-Kontakten (C: Pfeil). Die Abbildung zeigt repräsentativ das in den folgenden Experimenten eingesetzte dreidimensionale Netzwerk der mLNSC.
Der vorliegenden Arbeit wurde ein USB-Speicherstick beigefügt. Das auf dem USB-Stick befindliche Video 1 zeigt deutlich, dass Ausstülpungen der Zellmembran gebildet werden und ein Netzwerk entsteht. Die Anzahl der Membranausstülpungen variierten stark zwischen den einzelnen Zellen. Auffällig in Video 1 ist die Interaktion bzw. die ausgeprägte Kontaktsuche der mLNSC zu deren Nachbarzellen. Die dreidimensionale Struktur des mLNSC-Netzwerkes konnte mit Hilfe der Konfokalmikroskopie dargestellt werden (Video 2). Die mLNSC bildeten zu Beginn der Netzwerkentstehung in alle Richtungen zumeist stark verzweigte Membranausstülpungen. Im weiteren Verlauf dieses dynamischen Prozesses bildeten sich viele der zarten und dünnen Zellmembranausstülpungen zurück.
Gleichzeitig stabilisieren sich andere und bleiben auf Dauer erhalten. Letztere sind vorwiegend Membranausstülpungen, die einen direkten Zell-Zell-Kontakt herstellen (Abb.
15C, Pfeil).
4.7 Die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und mLNSC
Um die Wirkung der mLNSC auf das Migrationsverhalten der reifen DC zu untersuchen, wurden, wie unter Punkt 3.2.5 beschrieben, fluoreszenzmarkierte DC gemeinsam mit GFP-exprimierenden mLNSC in die 3D-Kollagenmatrix transferiert, mittels Zeitraffermikroskopie aufgenommen und anschließend analysiert. Es zeigte sich in den Aufnahmen, dass die beiden Zelltypen Interaktionen eingehen und miteinander in Kontakt treten (siehe Video 3). Um diese Beobachtung zu objektivieren, wurden die DC über 2 Stunden mit dem C3-Toxin des Clostridium botulinum, einem selektiven Inhibitor der kleinen GTPasen, behandelt (vgl. Kapitel 1.1.8). Durch die Hemmung der Rho-GTPase wird die Senkung der DC-Migrationsgeschwindigkeit induziert (40). Durch die Inhibition der Rho-GTPase kommt es zu einer indirekten Beeinflussung des Aktinnetzwerks und der Zellmorphologie (52,53,72). Allerdings zeigt sich eine geringe Wirkung auf die chemotaktische Reaktion und keine Auswirkung auf die Adhäsionsfähigkeit der DC (40,54).
Die mit C3-Toxin behandelten DC und die unbehandelten Kontroll-DC wurden mit mLNSC in die Kollagenmatrix appliziert. Nach 4 - 6 Stunden wurde mittels der Konfokalmikroskopie eine dreidimensionale Aufnahme angefertigt (Abb. 16). Die Aufbereitung der Aufnahme sowie die Auswertung erfolgten anschließend mit dem Programm Imaris, was es ermöglichte, die Zellkontakte zwischen mLNSC und DC in allen drei Dimensionen zu erkennen (Abb. 16A-C). In Abbildung 16C werden die mLNSC in grün und die DC in rot dargestellt, und die X-Y-Ebene, X-Z-Ebene sowie die Y-Z-Ebene sind gleichzeitig einsehbar. Somit ist es möglich, die Kontaktstellen zwischen den Zellen klar zu identifizieren. Deutlich mehr als die Hälfte (73,7 ± 7 %) der unbehandelten DC standen im Zellkontakt mit den mLNSC (Abb. 16E). Die behandelten und somit in ihrer Migration eingeschränkten DC stellten zu 48,9 ± 11 % einen Zellkontakt mit den mLNSC her und
Mit Hilfe der Imaris Sofware kann aus den konfokalen Aufnahmen ein dreidimensionales Modell erstellt werden (Abb. 17). Bei der Analyse dieser dreidimensionalen Darstellung wird deutlich, dass die DC eine ausgeprägte Verbindung mit den mLNSC und ihren Ausläufern eingehen. Dabei befindet sich ein Großteil der Zelloberfläche in einem direkten Zell-Zell-Kontakt mit der Stromazelle.
Abbildung 17: Zell-Zell-Kontakt zwischen DC und mLNSC in 3D Darstellung
Die rot markierten, unbehandelten DC sitzen breitbasig auf den grün fluoreszierenden mLNSC. Die Abbildung zeigt zwei Positionen einer Rotationsdarstellung (ca. 180°).
4.8 Der synergistische Einfluss von Stromazellen und CCL19 auf die Migrationsgeschwindigkeit von dendritischen Zellen
Es konnte in Kapitel 4.7 gezeigt werden, dass DC einen engen Zell-Zell-Kontakt mit mLNSC eingehen. In den folgenden Versuchsanordnungen wurde untersucht, in welchem Maße dies Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit und auf den Geradlinigkeitsindex
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In Abwesenheit von mLNSC und CCL19 migrierten die DC mit einer Grundgeschwindigkeit von 1,40 ± 0,26 µm/min in der Kollagenmatrix. Wie in Kapitel 4.4 beschrieben, kommt es durch das Hinzufügen von 200 nM CCL19 zu einem signifikanten Anstieg der Migrationsgeschwindigkeit auf 2,04 ± 0,40 µm/min. Durch das Integrieren von mLNSC in die Kollagenmatrix konnte ebenfalls eine statistisch signifikante Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit beobachtet werden (Abb. 18A). Diese Geschwindigkeits-erhöhung auf ca. 1,95 ± 0,27 µm/min kann mit dem Effekt von CCL19 verglichen werden.
Zwischen der Migrationsgeschwindigkeit, die durch 200 nM CCL19 ausgelöst wird, und der Migrationsgeschwindigkeit, die durch mLNSC hervorgerufen wird, kann kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden.
Darüber hinaus wurde festgestellt, dass durch die gemeinsame Anwesenheit beider Einflussfaktoren ein additiver Effekt auftritt. Bei gleichzeitigem Einsatz von CCL19 und mLNSC steigt die Migrationsgeschwindigkeit der DC auf 2,42 ± 0,41 µm/min. Diese liegt damit signifikant über der Migrationsgeschwindigkeit, welche durch die alleinige Präsenz von CCR7-Liganden oder mLNSC erreicht werden konnte (Abb. 18A).
Es ist bekannt, dass SC CCR7-Liganden exprimieren (73). Weiterhin wurde in Kapitel 4.4 (Abb. 13) gezeigt, dass bei steigender Chemokinkonzentration die Migrationsgeschwindigkeit zunimmt. Um zu überprüfen, ob die beobachtete Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit durch eine Konzentrationserhöhung von Chemokinen verursacht wird oder ob ein anderer, CCR7-Liganden-unabhängiger, Mechanismus verantwortlich ist, wurden CCR7-/-DC eingesetzt.
In Kapitel 4.4 (Abb. 12B) wurde bereits dargestellt, dass die Migrationsgeschwindigkeit ohne Einflussfaktoren (mLNSC und CCL19) kein signifikanter Unterschied zwischen CCR7-/-DC und wt DC aufweist. Die CCR7-/-DC erreichen im Durchschnitt eine Migrationsgeschwindigkeit von 1,70 ± 0,20 µm/min, wobei sie eine ungerichtete Migration aufweisen. Diese Grundgeschwindigkeit, mit der sich die CCR7-/-DC bewegen, blieb auch nach Hinzufügen von 200 nM CCL19 unverändert. Durch das Implementieren von mLNSC in die Kollagenmatrix konnte eine Steigerung der Migrationsgeschwindigkeit von CCR7-/ -DC auf 1,98 ± 0,32 µm/min gemessen werden. Das zusätzliche Hinzufügen von CCL19 hatte keinen weiteren Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit der CCR7-/-DC (Abb.
18B).
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repräsentiert den Geradlinigkeitsindex unter dem Einfluss von CCR7-Liganden, mit oder ohne mLNSC. Die gezeigten Daten repräsentieren 20 mit CCL19 und 4 mit CCL21 durchgeführte, unabhängige Experimente.
repräsentiert den Geradlinigkeitsindex unter dem Einfluss von CCR7-Liganden, mit oder ohne mLNSC. Die gezeigten Daten repräsentieren 20 mit CCL19 und 4 mit CCL21 durchgeführte, unabhängige Experimente.