Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchungen zur pharmakologischen Beeinflussung dendritischer Zellen

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Boris Sülzle

aus Loose

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. W. Baumgärtner, PhD

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05. 2004

Meinen lieben Eltern

gewidmet

1. Einleitung

2. Literaturübersicht

2.1 Dendritische Zellen 2

2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer

im Knochenmark 3

2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen

DCs 5

2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs 5

2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs 7

2.2 Allergische Kontaktdermatitis 8

2.2.1 Haptene 8

2.2.2 Sensibilisierung 9

2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen 9

2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten 11

2.2.2.3 Th1- und Th2-Polarität der Immunantwort 12

2.2.3 Auslösephase 13

2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell 15

2.4 Verwendete Pharmaka 17

2.4.1 Cilomilast 17

2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo 20 2.4.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro 21

2.4.2 Takrolimus (FK506) 22

2.4.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo 24 2.4.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro 25

2.4.3 Rapamycin 27

2.4.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo 28 2.4.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro 29

3 Material und Methoden

3.1 Geräte und Reagenzien 31

3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche 31

3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche 31

3.1.4 Reagenzien für Zymographie 33

3.1.5 Geräte für TNF-α/IL-12 ELISA 34

3.1.6 Geräte für FACS-Analyse 34

3.1.7 Geräte für Densitometrie 34

3.1.8 Hergestellte Puffer und Lösungen 35

3.1.9 Versuchstiere 35

3.2. Versuchsübersicht 36

3.3. Beeinflussung der DCs in vitro 37

3.3.1 Generierung von DCs 37

3.3.2 Gewinnung von murinen T-Lymphozyten 38

3.3.3 Messung von TNF-α und IL-12 39

3.3.4 Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) 39 3.3.5 Heterologe Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) 42 3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis 44

3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell 44

3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs

im allergischen Entzündungsgeschehen 45 3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs

im nicht-inflammatorischen Modell 47

3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST) 47

3.4.6 Skin-Migration-Assay 48

3.4.7 Local-Lymphnode-Assay (LLNA) 49

3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben 50

3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung 50

3.4.10 Zymographie 51

3.5 Statistische Auswertung 52

4. Ergebnisse

4.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus

auf die Migration dendritischer Zellen 53

4.1.1 Nicht-Inflammatorisches Modell 53

4.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell 54

4.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen

Migrationsmodell 58

4.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell 59 4.3 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Vorversuche 61 4.4 Ergebnisse des Mouse-Ear-Swelling-Test der Hauptversuche 62 4.5 Ergebnisse des Local-Lymphnode-Assays der

In-vivo-Hauptversuche 63

4.6 Wirkung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus

auf die DC-induzierte T-Lymphozyten-Proliferation in der MLR 65 4.6.1 Koinkubation von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus 65 4.6.2 Konzentrationsabhängige Wirkung von Cilomilast,

Rapamycin und Takrolimus 65

4.6.3 Prä-Inkubation von Cilomilast 65

4.7 Ergebnisse der FACS-Analyse 70

4.7.1 Identifizierung der in vitro generierten

dendritischen Zellen 70

4.7.2 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Expression kostimulatorischer Oberflächenmoleküle

in vitro generierter DCs 71

4.7.2.1 Einfluß auf die CD80-Expression 71 4.7.2.2 Einfluß auf die CD86-Expression 72

4.8 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12

dendritischer Zellen 73

4.8.1 Einfluß auf die TNF-α-Produktion 73

4.8.2 Einfluß auf die IL-12-Produktion 73

5 Diskussion

5.1 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus

auf die Migration dendritischer Zellen 75

5.1.1 Nicht-inflammatorisches Modell 75

5.1.2 TDI-Kontaktallergiemodell 77

5.1.3.2 Cilomilast 78

5.1.3.3 Takrolimus 79

5.2 Densitometrische Zymographieauswertung 81 5.2.1 MMP-9-Aktivität im nicht-inflammatorischen Migrationsmodell 81 5.2.2 MMP-9-Aktivität im TDI-Kontaktallergiemodell 82 5.3 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im MEST 82 5.4 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus im LLNA 83 5.5 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus in der MLR 84 5.7 Einfluß von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus

auf die LPS-induzierte Produktion von TNF-α und IL-12

dendritischer Zellen 86

5.7.1 Einfluß auf TNF-α 86

5.7.2 Einfluß auf IL-12 86

6 Zusammenfassung

7 Summary

8 Literaturverzeichnis

9. Anhang

9.1 Anhangstabellen 118

9.2 Veröffentlichungen 134

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

bzw. beziehungsweise

c-AMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CCR Chemokine Receptor

CD Cluster of Differentiation

CLA Cutaneous Lymphocyte Antigene

CLP Common Lymphoid Progenitors

CMP Common Myeloid Progenitors

DC Dendritic Cell

ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbant-Assay

Fc Fragment Crystallizable

FLT-3 Fms-Like-Tyrosinekinase-3

g Gramm GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor

i.p. intraperitoneal

ICAM Intercellular Adhesion Molecule

IFN Interferon

IgE Immunglobulin E

IL Interleukin

LLNA Local-Lymphnode-Assay

Ln. Lymphonodus

LPS Lipopolysaccharide

MCP Monocyte-Chemoattractant-Proteins

MEST Mouse-Ear-Swelling-Test

mg Milligramm

MHC Major-Histocompatibility-Complex

MIP-3-β Macrophage-Inflammatory-Protein-3-β

ml Milliliter

MMP Matrix-Metalloproteinase

n.b. nicht bestimmt

nmol Nanomol

p.o. per os

PDE4 Phosphodiesterase 4

s. siehe

S.D. Standard Deviation

Tab. Tabelle

TDI Toluendiisocyanat

Th T-Helferzelle

TLR Toll-like-receptor

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α

top. topisch

TRANCE TNF-Related Activation-Induced Cytokine

µl Mikroliter

1. Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) nehmen in der adaptiven Immunantwort eine Schlüsselrolle ein: Nach Aufnahme und Prozessierung von Antigenen sind es alleine DCs, die nach erfolgter Migration im regionalen Lymphknoten T-Lymphozyten das spezifische Antigen präsentieren und eine zellvermittelte Immunantwort einleiten (BANCHEREAU u. STEINMAN 2000). So sind es auch im Falle der Kontaktallergie DCs, die das Allergen präsentieren und die unerwünschte allergische Immunreaktion initiieren (KRASTEVA et al. 1999a).

Ziel dieser Arbeit ist die pharmakologische Beeinflussung der DC-Funktion. Als Testsubstanzen kommen die immunmodulatorisch wirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus zum Einsatz. In vivo werden die Testsubstanzen im Toluendiisocyanat (TDI)-induzierten Kontaktallergiemodell an BALB/c-Mäusen eingesetzt. Zu untersuchende Parameter stellen hier die Inhibition der Entzündungsreaktion der Haut (gemessen an der Ohrschwellung), die Beeinflussung der DC-Migration und nachfolgende T-Lymphozyten-Proliferation im regionalen Lymphknoten (gemessen am Lymphknotengewicht) dar. In-vitro-Untersuchungen sollen dabei die In-vivo-Studien ergänzen; für diese Untersuchungen werden aus murinem Knochenmark generierte DCs verwendet. So soll in der Mixed-Leukocyte- Reaction (MLR) der proliferationssuppressive Effekt der Testsubstanzen untersucht werden. Weiterhin sollen durchflußzytometrische Untersuchungen der in vitro gewonnen DCs Aufschluß über eine Regulation kostimulatorischer Oberflächenmoleküle nach LPS-Stimulation und Inkubation der Testsubstanzen ergeben.

2 Literaturübersicht

2.1 Dendritische Zellen

Der Begriff „Dendritische Zelle“ beschreibt eine heterogene Zellfamilie leukozytären Ursprungs, deren Hauptaufgabe die Regulation des Immunsystems beinhaltet. Kurz zusammengefasst nehmen diese Zellen - in der Peripherie des Körpers sessil - Antigene auf, prozessieren diese, migrieren zum regionalen Lymphknoten und initiieren bzw. regulieren nachfolgend die Immunantwort (BANCHEREAU und STEINMAN 1998, CAUX et al. 2000).

Erstmals beschrieben wurde dieser Zelltyp von STEINMAN und COHN (1973) in der Milz einer Maus. Obwohl die Langerhans-Zelle in der Haut bereits 1868 entdeckt wurde (LANGERHANS 1868), sollte man jedoch erst 1985 zur Erkenntnis kommen, daß die Langerhans-Zelle einen epidermal lokalisierten Subtyp der DC-Familie darstellt (SCHULER und STEINMAN 1985). Bis zu diesem Zeitpunkt war die Funktion und Position dieses Zelltyps innerhalb des Systems hämapoetischer Zellen ungewiß. Zunächst dem Nervensystem zugerechnet (LANGERHANS 1868), brachten erst Untersuchungen von BIRBECK et al. (1961), WOLFF (1963), sowie BRADSHAW et al. (1963) die Langerhans-Zelle in den Fokus immunologischer Betrachtungen. SILBERBERG et al. (1976) diskutierten erstmals die herausragende Rolle der Langerhans-Zelle in der allergischen Kontaktdermatitis; KLARESKOG et al.

(1977) sowie ROWDEN et al. (1977) beschrieben erstmals das MHC-II-Molekül auf Langerhans-Zellen. Nachdem die Verbindung zwischen Langerhans-Zelle und deren Zugehörigkeit zur DC-Familie hergestellt war (SCHULER und STEINMAN 1985), stellte die Langerhans-Zelle ein bevorzugtes Modell zur Untersuchung der Biologie dendritischer Zellen dar. Nachfolgend soll nun näher auf die Ontogenese, Morphologie und die Funktion dendritischer Zellen (DCs) eingegangen werden.

2.1.1 Entwicklung immaturer DCs und DC-Vorläufer im Knochenmark

Aufgrund der ausgesprochenen Plastizität der DCs sowie der im ständigen Fluß befindlichen Entwicklung stellt die folgende Übersicht lediglich den status quo des derzeitigen Erkenntnisstands dendritischer Zellen dar.

Im Knochenmark werden von hämatopoetischen Stammzellen kontinuierlich immature DCs (imDCs) produziert; der fms-like-tyrosinekinase-3 (FLT-3)-Ligand und GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) nehmen dabei in der Proliferation und weiteren Differenzierung der DCs eine Schlüsselrolle ein (BJORCK 2001, PULENDRAN et al. 2001). Ausgangspunkt der DC-Entwicklung sind CD34⁺ hämatopoetische Stammzellen (s. Abb. 1-2). Die weitere Entwicklung erfolgt dichotom, so bilden sich aus den CD34⁺ Stammzellen zum Einen common lymphoid progenitors (CLP), zum Anderen common myeloid progenitors (CMP). Die myeloiden DC-Vorläuferzellen differenzieren sich weiter in Abhängigkeit von den erworbenen Oberflächenantigenen: So bildet ein Teil der Zellpopulation als skin-homing-receptor das cutaneous lymphocyte antigen (CLA) aus und differenziert sich weiter in eine CD11c⁺ CD1a⁺ immature DC-Population, während die CD34⁺ CLA^- imDCs sich zu CD11c⁺ CD1a^- immaturen DCs weiterentwickeln (STRUNK et al. 1997). CD11c⁺ CD1a⁺ imDCs migrieren in die Epidermis und bilden dort schließlich immature Langerhans-Zellen, während die CD11c⁺ CD1a^- imDCs in die Dermis und weitere Gewebe migrieren; man bezeichnet sie dort auch als immature interstitielle DCs (CAUX et al. 2000).

Neben den immaturen Langerhanszellen und immaturen interstitiellen DCs existieren zwei weitere DC-Vorläuferformen, Monozyten (pre-DC1) und plasmazytoide DCs (pre-DC2). CMPs dienen dabei den Monozyten als Vorläuferzellen, die sich unter dem Einfluß von GM-CSF und IL-4 reversibel in immature myeloide DCs (imDC1) differenzieren (AKAGAWA et el. 1996). Diese Gruppe der DCs wird auch als monocyte-derived-DCs bezeichnet. Im Gegensatz zu den drei beschriebenen DC-Gruppen entwickeln sich die plasmazytoiden DCs aus den lymphoiden Vorläuferzellen im Knochenmark. Die Vorläuferzellen der plasmazytoiden DCs entwickeln sich unter Einfluß von IL-3 zu immaturen DCs (im DC2). Die beiden beschriebenen DC-Subtypen verlassen schließlich als immature DCs das Knochenmark und migrieren über die Blutbahn in die lymphatischen Organe

CD34⁺ Stammzelle

CMP CLP

CD34⁺CLA⁺ CD34⁺CLA^-

CD11c⁺CD1a⁺ CD11c⁺CD1a^- pre-DC1 pre-DC2

Antigen-abhängige Differenzierung:

Langerhans-Zelle Interstitielle DC

Bakterien Viren

Steady state Antigen Inflammation

Phagozytose IFN-Produktion Keine Maturation Maturation Maturation

Migration in regionalen Lymphknoten

immature DCs mature DCs Myeloide DC1 Lymphoide DC2

(plasmazytoide DCs)

Toleranz Immunität Adaptive Immunantwort

2.1.2 Phänotyp und Funktion der unterschiedlichen DCs

Allen vier DC-Subtypen gemeinsam ist die charakteristische Morphologie der Zellen im maturen Zustand, woher schließlich die Bezeichnung „dendritisch“ (gr.

δενδροs, Baum) rührt. In situ, so z. B. in der Haut und den lymphatischen Organen, besitzen DCs eine sternenförmige Morphologie. Typisch und namensgebend sind die langen (> 10 µm) und dünnen, „dendritiformen“ zytoplasmatischen Zellfortsätze. Die so beschaffene Morphologie gewährt den DCs eine effiziente Antigenaufnahme und Interaktion mit weiteren Zellen des Immunsystems, insbesondere T-Lymphozyten (BANCHEREAU und STEINMAN 2000).

Die unterschiedlichen DC-Typen unterscheiden sich, und zwar besonders in ihrem Immunphänotyp und in der Funktion, die sie im Organismus ausüben. Neben generellen Unterschiede zwischen immaturen und maturen DCs bestehen spezielle Unterschiede zwischen den einzelnen DC-Typen.

2.1.2.1 Langerhans-Zellen und interstitielle DCs

Ein Charakteristikum immaturer DCs stellt die Unfähigkeit dar, T-Zellen zu stimulieren. Dies geht einher mit der Tatsache, daß immature DCs auf ihrer Zelloberfläche kaum antigenpräsentierende MHC-Molküle sowie wenig kostimulatorische Oberflächenmoleküle wie CD25, CD40, CD54, CD80 und CD86 exprimieren. Immature DCs exprimieren in diesem Stadium jedoch zahlreiche Rezeptoren zur Antigenaufnahme wie Fcγ-, Fcε- und im Fall der Langerhans-Zellen, Langerinrezeptoren (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994, CAUX et al. 1995, CAUX und BANCHEREAU 1996, FIGDOR 2002). Im Gegensatz zu den myeloiden und plasmazytoiden DC-Vorläufern sind immature Langerhans-Zellen und immature interstitielle DCs fähig, antigenunabhängig zu migrieren (steady state) und immunregulatorische Funktionen wahrzunehmen. Während der Migration nehmen diese nur kurzlebigen DCs (3-4 Tage) Selbstantigene und apoptotische Zellen auf und präsentieren diese T-Zellen, ohne dabei Maturationsvorgängen zu unterlaufen und T-Zellen zu aktivieren (SHORTMAN 2000, STEINMAN et al. 2000). Bei diesem Vorgang differenzieren sich naive CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen in IL-10 produzierende T- Suppressorzellen, so daß eine Immunantwort gegenüber Selbstantigenen ausbleibt;

dies wird weithin als periphere Toleranz bezeichnet (JONULEIT et al. 2000, DHODAPKAR et al. 2001).

Im Entzündungsgeschehen bzw. nach Aufnahme und Prozessierung von Antigenen unterlaufen immature DCs zügigen Veränderungen ihres Immunphänotyps und ihrer Funktion. Dieser als Maturation bezeichnete Vorgang induziert eine Heraufregulation von Adhäsions- und kostimulatorischen Molekülen (CD40, CD54, CD80, CD86), Expression antigenpräsentierender MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche sowie eine Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-12 und IL-18. Gleichzeitig verlieren die maturen DCs die Fähigkeit zur Antigenaufnahme durch die Herrunteregulation der Fcγ-, Fcε- bzw.

Langerinrezeptoren (CAUX et al. 1994, INABA et al. 1994). Ausgelöst durch die Expression des Chemokinrezeptors 7 (CCR7) auf der Zelloberfläche der DCs und die Bildung der CCR7-Liganden MIP-3β (macrophage-inflammatory-protein-3-beta) und SLC (secondary-lymphoid-tissue-chemokine) seitens der lymphatischen Endothelzellen migrieren die DCs chemotaktisch in den regionalen Lymphknoten und initiieren dort nach Aktivierung der T-Lymphozyten die Immunantwort (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 2000). Im Vergleich zur steady-state-migration ist die Migrationsrate bzw. der turn-over dendritischer Zellen unter inflammatorischen Bedingungen stark erhöht, da die von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine CD40L und TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine) den Efflux dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten verstärken und zudem der Influx an DC-Vorläuferzellen in das Entzündungsgebiet zunimmt (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1999). In der Haut vermitteln die von Keratinozyten produzierten monocyte-chemoattractant-proteins 1 und 3 (MCP-1, MCP-3) sowie TNF-α und IL-1β diesen Vorgang (KRASTEVA et al. 1999a, LUCAS und MACPHERSON 2002).

2.1.2.2 Myeloide und lymphoide DCs

Die Vorläuferzellen dieser DC-Subtypen unterscheiden sich morphologisch und funktionell von den oben bereits beschriebenen DCs: Weder pre-DCs1 und pre-DCs2 weisen dendritische Zellausläufer aus, noch sind sie unter steady-state Bedingungen fähig, zu migrieren (LIU et al. 2001). Myeloide pre-DCs exprimieren typische myeloide Oberflächenantigene wie CD11b, CD11c, CD13, CD14 und CD33; pre- DCs2 hingegen exprimieren lymphozytenassoziierte Antigene wie den Transkriptionsfaktor Spi-B und das T-Zell-Rezeptor-Glykoprotein pre-Tα.

Beide Zelltypen nehmen wichtige Aufgaben innerhalb der unspezifischen sowie adaptiven Immunantwort bei bakteriellen bzw. viralen Infektionen wahr. So übernehmen pre-DCs1 den Part der Immunabwehr gegenüber Bakterien und Pilzen, indem sie diese Antigene Mannoserezeptor-vermittelt phagozytieren und abtöten;

dieser Vorgang und der Einfluß von IL-4 induzieren die weitere Differenzierung über immature DC1 in schließlich mature DC1, die in der nachfolgenden adaptiven Immunantwort eine Th1-Polarisation bewirken. Dies geht einher mit der Beobachtung, daß DCs1 große Mengen an IL-12 produzieren und so geprimte T- Zellen sich zu zytotoxischen und IFN-γ produzierenden T-Zellen ausdifferenzieren (RISSOAN et al. 1999, ITO et al. 2001).

Plasmazytoide DCs dagegen stellen das Bindeglied zwischen der unspezifischen und spezifischen Immunabwehr bei viralen Infektionen dar. Pre-DCs2 produzieren nach viraler Infektion große Mengen der antiviral wirksamen IFN-α und IFN-β und differenzieren sich dabei unter dem Einfluß der Interferone und autokriner TNF-α Produktion weiter in mature DCs2 (LIU et al. 2001). Diese maturen DCs2 induzieren nun eine ebenso wie die DCs1 eine adaptive Th1-Immunantwort, die jedoch IL-12 unabhängig erfolgt und zu IFN-γ und IL-10 produzierenden T-Zellen führt (RISSOAN et al. 1999, ITO et al. 2001).

2.2 Allergische Kontaktdermatitis

In Abhängigkeit vom Allergen manifestiert sich eine allergische Kontaktdermatitis entweder als IgE-vermittelte Hypersensibilitätsreaktion vom Typ I oder zellvermittelte Reaktion vom Spättyp (Typ IV Reaktion). Beide Überempfindlichkeitsreaktionen setzten eine spezifische Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen voraus.

Nachfolgend soll nun die Pathophysiologie der allergischen Kontaktdermatitis und besonders die Bedeutung der dendritischen Zellen erläutert werden.

2.2.1 Haptene

Für die Auslösung einer Kontaktallergie sind bestimmte stoffliche Eigenschaften des potentiellen Allergens Vorraussetzung (BASKETTER et al. 1995): Bei Kontaktallergenen handelt es sich meist um niedermolekulare, organische Verbindungen mit Molekulargewichten zwischen 100 und 1000 Dalton, die ausreichend lipophil sind, die Haut zu penetrieren. Herkunft und Struktur der Allergene sind dabei vielfältig, so handelt es sich um Pflanzenstoffe, Kunststoffe, Farbstoffe, Detergentien und Arzneimittel. Diese Stoffe fungieren lediglich als nicht- immunogene Haptene und müssen mit Proteinen erst zu einem Vollantigen bzw.

Hapten-Carrier-Komplex reagieren. So sind z. B viele pflanzliche Kontaktallergene elektrophile Substanzen, die mit Amino- und SH-Gruppen der Hautproteine reagieren und kovalente Bindungen eingehen, so daß sich ein Vollantigen bildet (LEPOITTEVIN und LEBLOND 1997). Von nicht-elektrophilen Stoffen – so genannten Prohaptenen - nimmt man an, daß diese in vivo zunächst in elektrophile Substanzen konvertiert werden müssen, an Hautproteine binden und schließlich allergenisierend wirksam sind (KALERGIS et al. 1997, MERK 1997). Dies ist der Fall z. B bei aromatischen Derivaten und photosensibilisierenden Substanzen, die durch UV-Strahlung aktiviert werden und schließlich an Hautproteine binden können (BASKETTER et al. 1995). Metalle hingegen wie zum Beispiel Nickel gehen keine kovalente Verbindung mit Hautproteinen ein, sondern formieren sich zu Metall- Protein-Komplexen, deren Bindungskräfte schwächer ausgeprägt sind (SALOGA et al. 1988).

Nicht alle Haptene jedoch sind zwingend immunogen: Neben den aufgeführten stofflichen Voraussetzungen zur Ausbildung einer Kontaktallergie spielt auch der metabolische Status des Organismus eine wichtige Rolle; unterbleibt so zum Beispiel die Konvertierung der Prohaptene in Haptene, entwickelt sich keine Kontaktallergie.

Hierin liegt einer der Gründe, warum die Ausbildung einer Kontaktallergie individuell unterschiedlich ist (KRASTEVA et al. 1999a).

Hinsichtlich ihres Sensibilisierungspotentials lassen sich die Haptene in stark und schwach immunogen wirksame Haptene einteilen; so löst der Kontakt mit starken Haptenen (z. B. Oxazolon, Dinitrofluorbenzen) fast immer eine Kontaktallergie aus, schwache Haptene hingegen führen nur bei einem kleinem Prozentsatz der Individuen (z. B. 5% bei Metallsalzen) zu Kontaktallergien (KRASTEVA et al. 1999a).

2.2.2 Sensibilisierung

Ätiopathogenetisch unterscheidet man bei der Kontaktallergie zwischen der Sensibilisierung gegenüber dem Antigen und der Auslösephase bei erneutem Antigenkontakt (SCHULER 1993).

2.2.2.1 Rolle der Langerhans-Zellen

Während der Sensibilisierungsphase penetriert ein lipidlösliches Allergen nach Hautkontakt die Epidermis, wo es sich mit Hautproteinen zu einem Hapten-Carrier- Komplex verbindet. Eine Schlüsselrolle nehmen hier immature Langerhans-Zellen ein: In den suprabasalen Schichten der Epidermis gelegen, formen sie ein dreidimensionales Netzwerk. Dabei wird die Adhäsion der Langerhans-Zellen untereinander sowie die Adhäsion zwischen Langerhans-Zellen und umliegenden Keratinozyten durch das Adhäsionsmolekül E-Cadherin vermittelt (RIEDL et al.

2000a, RYAN et al. 2000,). In diesem Geflecht werden eingedrungene Antigene

„aufgefangen“ und von Langerhans-Zellen per rezeptorvermittelter Endozytose internalisiert (FIGDOR et al. 2002).

Nach erfolgter Antigenaufnahme finden immunphänotypische, funktionelle und morphologische Veränderungen der Langerhans-Zellen statt; dies wird weithin als Maturation bezeichnet.

Immunphänotypisch weisen immature Langerhans-Zellen nur eine geringe Anzahl von MHC- sowie kostimulatorischen Moleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) (NIJMAN et al. 1995, PIERRE et al. 1997), jedoch eine große Anzahl an Antigen-Rezeptoren (Fcγ-, Fcε-, Langerin-Rezeptor) und intrazellulär lokalisierten MHC-II-Molekülen auf (BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Ebenso ist das Adhäsionsmolekül E- Cadherin auf der Zelloberfläche stark exprimiert (RIEDL et al. 2000b). Die Aufnahme von Antigenen - speziell die von Haptenen – sowie die Freisetzung pro- inflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten - induziert bei Langerhans-Zellen folgende Veränderungen: Antigenpräsentierende MHC-II- Moleküle, kostimulatorische Oberflächenmoleküle (CD25, CD40, CD80, CD86) sowie der CCR7-Rezeptor werden heraufreguliert (AIBA und KATZ 1990, AIBA et al. 1997, CAUX et al. 2000); Endozytose-Rezeptoren und das Adhäsions-Molekül E-Cadherin werden herrunterreguliert (RIEDL et al. 2000a).

Die Veränderungen des Immunphänotyps von Langerhans-Zellen gehen einher mit funktionellen Alterationen: Zeichnet sich die immature Langerhans-Zelle vornehmlich durch Antigenaufnahme und Immobilität aus, so prozessieren mature Langerhans-Zellen das aufgenommene Antigen. Sie sind fähig, in den regionalen Lymphknoten zu migrieren und naiven T-Lymphozyten das Antigen via MHC zu präsentieren (BANCHEREAU und STEINMAN 1998). Die Initiierung der Migration wird einerseits von den Langerhans-Zellen selbst, andererseits durch die Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, TNF-α) aus Keratinozyten nach Antigen- kontakt gesteuert (WANG et al. 1997, CAUX 1998). Die Freisetzung dieser Zytokine bewirkt eine Modulation der interzellulären Adhäsionsmoleküle, insbesondere von E- Cadherin. Während der Maturation wird dieses Adhäsionsmolekül herunterreguliert, so daß die Langerhans-Zellen sich von den sie umgebenen Keratinozyten lösen; α6- Integrine vermitteln anschließend die Adhäsion der Langerhans-Zellen an der epidermalen Basalmembran. Die Überquerung der Basalmembran geht mit dem Abbau extrazellulärer Matrix einher; dieser Vorgang wird durch die vermehrte Ausschüttung des Enzyms Matrix-Metalloproteinase-9 seitens der Langerhans-Zellen gesteuert (KOBAYASHI 1997, KIMBER et al. 1999, KIMBER et al. 2000, RIEDL et al.

2000a, JAKOB et al. 2001). Die weitere Migration über Lymphgefäße zum regionalen

Lymphknoten reguliert der exprimierte Rezeptor CCR7. Die Expression dieses Oberflächenmoleküls führt zu einer Chemotaxis der Langerhans-Zellen gegenüber den Chemokinen SLC und MIP-3β, die in der T-Zell-Region des regionalen Lymphknotens produziert werden (GUNN et al. 1998, DIEU-NOSJEAN et al. 1999, KELLERMANN et al. 1999).

2.2.2.2 Priming der T-Lymphozyten

Im regionalen Lymphknoten präsentieren Langerhans-Zellen in der paracorticalen Region naiven T-Zellen das Antigen; diesen Vorgang bezeichnet man als priming.

Die Antigen-Erkennung stellt hierbei die Interaktion zwischen spezifischem T-Zell- Rezeptor von CD8⁺ bzw. CD4⁺ T-Zellen und dem prozessiertem Antigen-Peptid – assoziiert mit MHC-I bzw. MHC-II-Molekülen – dar. Dabei konnte im Trinitrophenyl (TNP)-Kontaktallergiemodell bei der Maus gezeigt werden, daß der T-Zell-Rezeptor das Hapten samt des kovalent gebundenen Peptids als strukturelle Einheit in der Grube des MHC-Moleküls erkennt (CAVANI et al. 1995, WELTZIEN et al. 1996).

Naive T-Lymphozyten zirkulieren kontinuierlich vom Blut in die lymphatischen Organe und wieder zurück. Die fortdauernde Passage der naiven T-Zellen vorbei an den dendritischen Zellen ist essentiell für die Initiierung der primären Immunantwort.

Besteht eine spezifische Kohärenz zwischen T-Zell-Rezeptor und präsentiertem Antigen, beenden die T-Zellen ihre Wanderung und beginnen, mit den dendritischen Zellen zu interagieren. Den ersten Schritt dieser Wechselwirkung stellt hierbei die Zell zu Zell-Bindung dar, die durch Leukozytenintegrine auf der Zelloberfläche vermittelt wird (TILNEY und GOWANS 1971, HOGG und LANDIS 1993) Die nun folgende Aktivierung der T-Zelle erfordert zwei unabhängige Signale: Das erste Signal wird durch die Interaktion von T-Zell-Rezeptor und antigenpräsentierendem MHC-Molekül vermittelt, das zweite Signal durch die Wechselwirkung von kostimulatorischen Oberflächenmolekülen der dendritischen Zellen (CD80 und CD86) sowie deren Rezeptoren auf der T-Zell-Seite (CD28 und CTLA-4)(LIU und JANEWAY 1992, RUDD 1996). Letztlich führen beide Signale zu einer IL-2- Produktion und Sekretion seitens der T-Zellen, welches durch die autokrine Wirkung auf den hochaffinen IL-2 Rezeptor zu einer hapten-spezifischen, klonalen Proliferation führt. Dabei bewirkt das erste stimulierende Signal die Aktivierung des

IL-2-Transkriptionsfaktors NF-AT (nuclear factor of activation in T cells), dies allein führt jedoch nicht zu einer IL-2-Produktion; erst im Zusammenwirken mit dem kostimulatorischen Signal kommt es zu einer Stabilisierung der IL-2 mRNA und zu einer wirkungsvollen IL-2-Synthese (LINDSTEN et al. 1989).

Die klonale Expansion der T-Zellen mündet schließlich in der Ausbildung zweier T-Zell-Typen: Zum Einen werden T-Effektorzellen gebildet, zum Anderen T- Gedächtniszellen. Im Gegensatz zu naiven T-Zellen benötigen diese Zellen bei spezifischer Antigen-Erkennung keine Kostimulation (WONG et al. 1996). Die haptenspezifischen T-Zellen verlassen schließlich den Lymphknoten und treten in den Blutstrom ein. Im Falle der Kontaktallergie erlangen die T-Zellen das CLA- Antigen (cutaneous lymphocyte antigen). Das CLA-Antigen fungiert als skin-homing- receptor für haptenspezifische T-Zellen, so daß CLA⁺-T-Zellen nach trans- endothelialer Migration nun vornehmlich die Dermis besiedeln (PICKER et al. 1993).

2.2.2.3 Th1-und Th2-Polarität der Immunantwort

In Abhängigkeit vom Allergen und vom jeweilig dominierenden Zytokinmilieu wird während der Sensibilisierungsphase entweder eine Th1-oder Th2-vermittelte Immunantwort ausgelöst.

Eine Th1-vermittelte zelluläre Immunantwort entsteht, wenn das Hapten MHC-I- restringiert naiven CD8⁺ T-Zellen in Abwesenheit von T-Helferzellen präsentiert wird.

In der Folge werden CD8⁺ Effektor- und Gedächtniszellen produziert. Dabei ist von dendritischen Zellen produziertes IL-12 das dominierende Zytokin, welches für das priming naiver CD8⁺ T-Zellen und somit Entwicklung des Th1-Phänotyps verantwortlich zeichnet (CARTER und DUTTON 1996 ). Beispiele für Th1-assoziierte Kontaktallergene sind Oxazolon, Dinitrofluorbenzen (DNFB), Trinitrophenyl (TNP) sowie Nickel (KRASTEVA et al. 1999a).

Wird hingegen das Allergen via MHC-II präsentiert und wird das Zytokinmilieu während der Antigenpräsentation von IL-4, Histamin und PGE2 dominiert, so werden vornehmlich CD4⁺ T-Zellen geprimt und eine Th2-mediierte, humorale Immunantwort eingeleitet (HILKENS et al. 1996, KAPSENBERG et al. 1998, VIEIRA et al. 2000, CARON et al. 2001, LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2001). Dies hat zur Folge, daß Th2–Effektor-Zellen mit antigenspezifischen B-Lymphozyten interagieren und

diese unter dem Einfluß von IL-4 und Stimulation durch CD40L zur IgE-Produktion anregen. Sobald die IgE-Produktion eingeleitet ist, wird diese durch basophile und eosinophile Granulozyten sowie Mastzellen weiter verstärkt. Alle drei Zelltypen exprimieren den Rezeptor FcεRI, an den sich nun das gebildete IgE bindet (GAUCHAT et al. 1993, YOSHIMOTO et al. 1995). Beispiele für Kontaktallergene, die eine Th2-Antwort induzieren, sind Trimellitanhydrid (TMA) und Toluendiisocyanat (TDI) (DEARMAN et al. 1996). Die oben beschriebenen Vorgänge während der Sensibilisierungsphase verlaufen ohne klinische Symptome. Der Zeitraum der Sensibilisierung beträgt beim Menschen, ca. 8-15 Tage bei der Maus 5-7 Tage (KRASTEVA et al. 1999a).

CUMBERBATCH et al. (2003) sehen als eine mögliche Erklärung der Th1-/Th2- Polarisation die unterschiedliche Migrationskinetik von Langerhanszellen in Abhängigkeit vom Allergen mit nachfolgender Beeinflussung der Zytokinproduktion der Langerhans-Zellen. So können sie zeigen, daß das Th1-assoziierte Kontaktallergen DNFB schneller in den regionalen Lymphknoten transportiert wurde als das Th2-assoziierte Kontaktallergen TMA. Da bekannt ist, daß die Antigen- induzierte IL-12-Produktion von DCs zeitlich limitiert ist (LANGENKAMP et al. 2000, LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000), wird in diesem Zusammenhang diskutiert, daß mit unterschiedlicher Migrationsgeschwindigkeit der Langerhans-Zellen nur ein begrenztes Zeitfenster zur IL-12-abhängigen Th1-Polarisierung naiver T-Zellen im Lymphknoten besteht.

2.2.3 Auslösephase

Die Auslöse- oder Challenge-Phase beschreibt den erneuten Antigenkontakt nach abgeschlossener Sensibilisierungsphase und ist von den klinischen Symptomen der Kontaktdermatitis gekennzeichnet. Beim Menschen kommt es etwa 3 Tage (Maus: 1-2 Tage) nach Exposition am Ort des Allergenkontaktes zur Ausbildung von erythematösen Papeln, Ödemen und Bläschen in der Epidermis des Menschen bzw. der Dermis der Maus. Im weiteren Verlauf geht die akute allergische Kontaktdermatitis in ein chronisches Stadium über, das durch synchrone Polymorphie der klinischen Symptomatik, insbesondere einer ausgesprochenen

Lichenifikation der Haut, gekennzeichnet ist (KRASTEVA et al. 1999b). Die Pathophysiologie der allergisch-entzündlichen Reaktion unterscheidet sich hier in Abhängigkeit der jeweils initiierten T-Zell-Polarisation (Th1 versus Th2) während der Sensibilisierungsphase.

Im Th1-dominierten Geschehen nehmen CD8⁺ CLA⁺ T-Gedächtniszellen der Dermis eine zentrale Rolle ein: Nach erneutem Antigenkontakt der Haut wird diesen Zellen das Hapten via Langerhans-Zellen und/oder dermalen dendritischen Zellen präsentiert, was zu einer Aktivierung der T-Zellen und Zytokinproduktion, insbesondere IL-1, IL-2, IFN-γ und TNF-α, führt (KASPENBERG et al. 1992, CAVANI et al. 1997). Durch die Produktion und Sekretion dieser inflammatorischen Zytokine werden speziell Keratinozyten und Endothelzellen aktiviert; Keratinozyten werden zusätzlich direkt durch den Antigenkontakt aktiviert. Aktivierte Keratinozyten produzieren ihrerseits pro-inflammatorische Zytokine und regulieren zusammen mit dem aktivierten Endothel den Influx haptenspezifischer T-Zellen aus dem Blut in die Haut. Die Aktivierung des Endothels geht mit einer Alteration der endothelialen Adhäsionsmoleküle für Leukozyten (Selektine, Integrine) einher und dient der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten und Monozyten aus dem Blut in die Haut, um das Entzündungsgeschen zu initiieren (SMITH und BARKER 1993). Außerdem üben CD8⁺ T-Zellen einen direkten zytotoxischen Effekt in der Haut aus (KEHREN et al.

1999).

Im Th2-vermittelten Allergiegeschehen läuft das Entzündungsgeschen nach wiederholtem Antigenkontakt in zwei Phasen ab: Man unterscheidet die Sofortreaktion von der Spätreaktion. Die allergische Sofortreaktion wird durch die Antigen-induzierte IgE-Quervernetzung auf kutanen Mastzellen initiiert. Die nachfolgende Mastzelldegranulation löst eine Entzündungskaskade aus, zu deren Vermittlern Histamin, Prostaglandine, IL-1β sowie TNF-α gehören (AUSTEN 1995).

Die Spätreaktion hingegen ist von einem Influx inflammatorischer Leukozyten und antigenspezifischen CD4⁺ T-Zellen gekennzeichnet. Aktivierte CD4⁺ T- Gedächtniszellen der Haut zeichnen hierbei für das Aufrechterhalten der Entzündungsreaktion verantwortlich: Nach Aktivierung produzieren und sezernieren sie IL-4, IL-5 und IL-10, wodurch die IgE-Produktion vorangetrieben sowie ein

fortdauernder Influx inflammatorischer Leukozyten aus dem Blut in die Haut reguliert wird (FINKELMAN et al. 1988, WERFEL et al 1995).

2.3 Untersuchungen im TDI-Kontaktallergiemodell

Toluendiisocyanat (TDI) zählt zur Stoffgruppe der Diisocyanate und hat ein Molekulargewicht von 174,16 Dalton. Diisocyanate sind hochreaktive Stoffe, die bei der industriellen Herstellung von Elastomeren, Farben und Klebstoffen verwendet werden. Sie stellen eine der häufigsten Ursachen des berufsbedingten Asthmas dar.

In Tierversuchen mit Diisocyanaten wurden in Kurzzeittests Genmutationen und Chromosomenschädigungen beobachtet, weshalb Diisocyanate möglicherweise als potentiell kanzerogen einzustufen sind (BOLOGNESI et al. 2001).

YASUDA et al. (1980) beschreiben erstmals das Auftreten der dermalen Kontaktallergie nach TDI-Sensibilisierung im Mausmodell. Seither wurden eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt, die dieses Modell charakterisieren und den Einfluß verschiedener Pharmaka in diesem Entzündungsmodell untersuchen.

TOMINAGA et al. (1985) benutzen das TDI-Kontaktallergiemodell für pharmakologische Untersuchungen zur Beeinflussung des Entzündungsgeschehens.

Sie berichten von einer Inhibition der TDI-induzierten Ohrschwellung nach Gabe von Dexamethason und Indometacin. DEARMAN et al. (1991, 1996) führen Charakterisierungsstudien mit Kontaktallergenen durch und berichten von der Th2- dominierenden Immunantwort im TDI-Kontaktallergiemodell: So messen sie erhöhte IgE-Serumspiegel im Blut TDI-sensibilisierter Mäuse sowie eine erhöhte IL-4 und IL- 10 Zytokinproduktion TDI-aktivierter Lymphknotenzellen. Ebenso berichten SCHEERENS et al. (1999) von einer Produktion TDI-spezifischer IgE-Antikörper- Produktion bei Mäusen nach einer sechswöchigen Sensibilisierungsphase.

EHINGER et al. (2000) untersuchen den Einfluß des PDE4-Inhibitors Piclamilast im TDI-Kontaktallergiemodell; dabei zeigt sich eine wirksame Inhibition der allergischen Ohrschwellung nach topischer und intraperitonealer Verabreichung von Piclamilast.

Weitere Untersuchungen zur Wirksamkeit von PDE4-Inhibitoren bei allergischen Dermatitiden an BALB/c-Mäusen schließen sich an. Die topischer Applikation von

Cilomilast und AWD 12-281 kann die an den Ohren durch TDI geboosterte allergische Entzündungsreaktion wirkungsvoll inhibieren; zudem weisen die behandelten Ohren einen verminderten Gehalt des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1β sowie einen drastisch reduzierten Influx neutrophiler Granulozyten auf. Nach präventiver topischer Applikation von Cilomilast und AWD 12-281 können BÄUMER et al. (2002, 2003a) 24 Stunden nach TDI-Challenge eine Reduktion der TDI- induzierten Produktion von IL-4, IL-6 sowie des Makrophagen-Inflammatorischen- Proteins-2 (MIP-2) im Ohrhomogenat messen.

In eigenen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit soll der Fragestellung nachgegangen werden, welchen Einfluß die Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf das allergische Entzündungsgeschehen im TDI-Kontaktallergiemodell nehmen.

2.4. Verwendete Pharmaka

2.4.1 Cilomilast

Cilomilast (cis-4-cyano-4-[3-cyclopentoxyl-4-methoxphenyl]-Cyclohexa-Carbon- säure) ist ein Phosphodiesterase-4 (PDE4)-Inhibitor der 2. Generation; zur Zeit befindet sich der Stoff in der klinischen Phase III der Arzneimittelzulassung als Humanpräparat für die Asthma-Therapie (GRISWOLD et. al. 1998) bzw. in Phase II zur Therapie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, COPD (GIEMBYCZ 2000).

Die Phosphodiesterase (PDE) ist ein intrazellulär lokalisiertes, ubiquitär vorkommendes Enzym, welches second-messenger-Nukleotide der Zelle (cAMP und cGMP) hydrolytisch spaltet (SUTHERLAND und RALL 1958). Heute sind mehr als 11 PDE-Enzyme bekannt, wobei die unterschiedlichen Gewebe und Zellen ein differierendes Muster der Enzymausstattung aufweisen; so sind z.B. die PDE3 und besonders PDE4 charakteristisch für Immun- bzw. Entzündungszellen (DCs, T- Zellen, neutrophile Granulozyten) (GIEMBYCZ et al. 1997). Sie nehmen dort im cAMP-Abbau die zentrale Rolle ein.

Genetisch codiert wird die PDE4 von vier unterschiedlichen Gen-Loci, so daß die PDE4 vier Subtypen (PDE4A, PDE4B, PDE4C und PDE4D) aufweist (GIEMBYCZ 2000). Die jeweilige Expression des PDE4-Isoenzyms entspricht unterschiedlichen mRNA splicing-Varianten, die der Feinregulierung des intrazellulären cAMP- Haushalts dienen (HOUSLAY et al. 1997). Die Verteilung dieser Isoenzyme differiert dabei in Abhängigkeit von Körpergewebe und Zelltypus; PDE4A ist ubiquitär verteilt und der dominierende Subtyp in DCs (HEYSTEK et al. 2003), wohingegen PDE4C vornehmlich in Nervengewebe vorkommt und in Entzündungszellen fehlt; PDEB wird in der Lunge, Herz und Skelettmuskulatur exprimiert.

Die Wirkung von Cilomilast auf die Funktion von Immun- und Entzündungszellen basiert auf der spezifischen Hemmung der PDE4 (Abb. 2-2): Hieraus resultiert ein intrazellulärer Anstieg von cAMP. Dieses bindet und aktiviert die Proteinkinase A (PKA). Die PKA phosphoryliert Transkriptionsfaktoren, die für die Inflammations- kaskade eine Schlüsselrolle spielen. Durch den pleiotropen Effekt der intrazellulären

cAMP-Akkumulation wechselt der Funktionszustand der Zellen vom pro- inflammatorischen zum anti-inflammatorischen Zustand.

Beim Menschen erfolgt die Absorption von Cilomilast nach oraler Verabreichung zügig, mit einer maximalen Plasmakonzentration (Cmax) eine Stunde nach Verabreichung. Die Bioverfügbarkeit nach oraler Gabe beträgt 96%. Als Halbwertzeit (t 0,5) werden sieben Stunden angegeben (ZUSSMAN et al. 2000).

Die Nebenwirkungen der PDE4-Inhibitoren sind im Zusammenhang mit der Molekularstruktur des PDE4-Enzyms zu betrachten. Die PDE4 existiert sterisch gesehen in zwei unterschiedlichen Konformationen, PDE4-H und PDE4-L. Für diese besitzt der PDE4-Inhibitor der 1. Generation, Rolipram, eine hohe (High) bzw.

niedrige (Low) Bindungsaffinität (SCHNEIDER et al. 1986). PDE4-H wird bereits durch geringe Konzentrationen von Rolipram inhibiert, PDE4-L erst durch hohe Konzentrationen von Rolipram. Anti-inflammatorische Effekte werden der PDE4-L Bindung zugeschrieben (BARNETTE et al. 1996), wohingegen Nebenwirkungen wie Vomitus, Nausea und Dyspepsie (gastrische H⁺-Hypersekretion) durch eine Bindung an PDE4-H verursacht werden (GIEMBYCZ 2000). Die PDE4-H/PDE4-L-Ratio von Rolipram liegt bei 0,1; durch die damit verbundene höhere Affinität zu PDE4L überwiegen die Nebenwirkungen, bzw. werden therapeutische Effekte erst in höheren Dosierungen erreicht. Im Vergleich hierzu beträgt die PDE4-H/PDE4-L-Ratio von Cilomilast 1,1 (BARNETTE et al. 1998): Trotz des im Vergleich zu Rolipram höheren therapeutischen Index kommt es auch bei Cilomilast zu Nebenwirkungen.

So berichten CHOMPTON und NIEMAN (1999) von Emesis als häufigster Nebenwirkung nach Behandlung mit Cilomilast (15 mg/kg), gefolgt von Nausea und Dyspepsie.

PDE4-Inhibitor

ATP cAMP 5`-AMP

PKA inaktiv PKA aktiv

Protein-PO4 Protein

Inflammatorische Zellaktivität ↓

Abb. 2-2: Wirkmechanismus von PDE4-Inhibitoren (nach TORPHY 1998)

Abb. 3-2: Strukturformel von Cilomilast N

OH O

O O

2.4.1.1 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vivo

Über die In-vivo-Effekte von Cilomilast geben die Ergebnisse aus klinischen Untersuchungen sowie aus verschiedenen tierexperimentellen Allergiestudien Aufschluß (s. Tab. 1-2).

In Phase-II-Studien zu asthmatischen Atemwegserkrankungen des Menschen wird Cilomilast (15 mg/kg) erfolgreich eingesetzt. COMPTON et al. (2000) beschreiben eine Reduktion der typischen Asthma-Symptome wie Husten, Atemnot und Brustschmerzen. In einem Bericht zur Phase-III-Studie der klinischen Wirksamkeit von Cilomilast bei COPD des Menschen beschreiben EDELSON et al.

(2001) positive Effekte hinsichtlich einer Lungenfunktionsbesserung und des allgemeinen Gesundheitszustands.

Im Dinitrochlorobenzen (DNCB)- und Toluendiisocyanat (TDI)-induzierten Kontaktallergiemodell zeigen EHINGER et al. (2000) an BALB/c-Mäusen die Wirksamkeit eines weiteren PDE4-Inhibitors, Piclamilast (RPR 73401). Nach intraperitonealer und topischer Applikation von Piclamilast kann die mit Ohrschwellung einhergehende Entzündungsreaktion signifikant gehemmt werden.

BÄUMER et al. (2002) zeigen weiterhin im gleichen Tier- und Allergiemodell (TDI) eine entsprechende Wirksamkeit von Cilomilast; zudem berichten sie von einer signifikanten Reduktion der TDI- induzierten Produktion von Interleukin-1β (IL-1β), welches in den behandelten Ohren gemessen wird. In den beiden zitierten Versuchen wurden die Tiere aktiv sensibilisiert. Von einer passiven Sensibilisierung der BALB/c-Mäuse mittels Injektion TDI-„gepulster“ - also mit TDI beladenen – DCs berichten BÄUMER et al. (2003b); hier wird der Effekt von Cilomilast auf die DCs untersucht, indem die DCs vor der Injektion mit Cilomilast prä-inkubiert wurden. Es zeigt sich kein Effekt hinsichtlich einer Inhibition der durch TDI-beladene DCs hervorgerufenen Ohrschwellung. Die systemische Gabe von Cilomilast vermag jedoch die Ohrschwellung zu inhibieren.

BELLGUIC et al. (2000) berichten, daß die MMP-9-Expression - im Ovalbumin- induzierten Entzündungsmodell der Lunge an BALB/-Mäusen – in der Broncho- alveolären Lavage durch Gabe von Rolipram reduziert wird. Hier werden als Quelle der MMP-9 neutrophile Granulozyten und Alveolarmakrophagen angesehen.

2.4.3.1.2 Wirkung von Cilomilast auf Immunzellen in vitro

Ein häufig angewendetes In-vitro-Modell, um die pharmakologische Beeinflussung von DCs zu untersuchen, ist die Stimulation von DCs mit Lipopolysacchariden (LPS) und anschließender Messung proinflammatorischer Zytokine. Zusätzlich stellt die Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR) stellt ein In-vitro- Modell dar, in dem die DC-Eigenschaft, T-Zellen zu stimulieren und zur Proliferation anzuregen, näher untersucht wird; durch FACS-Analysen von DCs lassen sich Aussagen über die Modulation von Zelloberflächenmolekülen treffen.

HATZELMANN und SCHUDT (2000) zeigen an LPS-stimulierten, humanen, monocyte-derived DCs eine wirkungsvolle Inhibition der TNF-α-Synthese durch Cilomilast. Weiterhin beschreiben sie den Einfluß von Cilomilast auf humane CD4⁺ T- Lymphozyten. Nach Proliferationsstimulation der T-Zellen mit anti-CD3/anti-CD28 monoklonalen Antikörpern kann die Proliferation der T-Zellen und Synthese von IL-2, IL-4, IL-5 und Interferon-γ durch Inkubation mit Cilomilast inhibiert werden.

BARNETTE et al. (1998) erhalten ähnliche Ergebnisse an humanen Monozyten und T-Zellen.

BILLAH et al. (2002) zeigen an humanen, peripheral blood monocytes (PBMCs) einen hemmenden Effekt des PDE4-Inhibitors SCH 351591 auf die Produktion von IL-12 nach Stimulation der Zellen mit Pansorbin.

HEYSTEK et al. (2003) beschreiben in FACS-Analysen eine Heraufregulation des chemotaktisch bedeutsamen Oberflächenmoleküls CXCR4 auf monocyte-derived DCs durch Cilomilastgabe während der LPS-induzierten DC-Maturation.

Untersuchungen zur Beeinflussung des Immunphänotyps antigenpräsentierender Zellen (APCs; Monozyten, B-Lymphozyten) durch Rolipram – ein PDE4-Inhibitor der 1. Generation – zeigen eine Modulation der Oberflächenmoleküle CD80 und CD86 sowie von MHC-I und MHC-II. So wird CD86 heraufreguliert, CD80, MHC-I und MHC-II jedoch herunterreguliert (BIELEKOVA et al. 2000).

Tab. 1-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Cilomilast. Literatur s. Text.

Zelltyp in vivo in vitro DCs Inhibition der Kontakt- IL-1β u. TNF-α↓

allergie im TDI-Modell CXCR4↑

epidermale DCs Migration↓ (eigene Untersuchungen)

Inhibition der Kontakt- Proliferation↓

T-Zellen allergie im TDI-Modell IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ↓

Ohrhomogenat IL-1β↓ im TDI-Modell MMP-9 Aktivität↓

(eigene Untersuchungen)

Asthma-u. COPD-Therapie

2.4.2 Takrolimus (FK 506)

Takrolimus wurde 1984 aus der Kulturbouillon einer in Tsukuba (Japan) entdeckten Streptomyces-Spezies isoliert. Der Name Takrolimus ist ein Kunstwort, zusammengesetzt aus den Bestandteilen Tsukuba, Makrolid und Immunosupressant (KINO et al. 1987). Strukturell zählt FK506 zur Gruppe der Makrolid-Laktone mit einem Molekulargewicht von 822,05 Dalton, pharmakologisch zählt es zur Gruppe der Calcineurin-Inhibitoren. Es gilt neben dem Peptid Cyclosporin A als Leitsubstanz immunsuppressiv wirksamer Arzneimittel.

Takrolimus findet seine klinische Anwendung in der Transplantationsmedizin zur Prophylaxe und Therapie der manifesten Transplantatabstoßung nach Leber- und Nierentransplantationen (Prograf^R) sowie in der Dermatologie als Therapeutikum (Protopic^R-Salbe) der atopischen Dermatitis des Menschen. Gute Wirksamkeit kann bei topischer Applikation auch beim allergischen Kontaktekzem im Meerschweinchenmodell (ALAITI et al. 1998) sowie beim Menschen gezeigt werden (BOGNIEWIECZ et al. 1998).

Abb. 4-2: Strukturformel von Takrolimus (FK 506)

Takrolimus übt seine biologischen Effekte nach Bindung an zytoplasmatische Makrophiline aus; diese auch als FK506-bindende Proteine (FKBP-12) bezeichnete Substanzen sind den Immunophilinen zuzurechnen. Nach erfolgter Bindung von Takrolimus an FKBP-12 entsteht ein Komplex, der nun die Funktion der Ca²⁺- abhängigen Serin-/Threonin-Phosphatase Calcineurin hemmt (LIU et. al. 1991). Dies führt über eine Translokationshemmung des Nuklearfaktors NF-ATp letztlich zu einer Transkriptionshemmung NF-ATp-abhängiger Zytokine, insbesondere IL-2, TNF-α, GM-CSF. Hierdurch lassen sich die beschriebenen Effekte auf verschiedene Zelltypen der Haut und des Immunsystems erklären (siehe 2.2.3, Abb. 6-2 und Tab.

2-2).

Takrolimus kann oral, parenteral und topisch appliziert werden. Aufgrund einer nur mäßigen Absorptionsrate nach oraler Applikation beträgt die durchschnittliche orale Bioverfügbarkeit beim Menschen ca. 27% (PETERS et al. 1993). Topisch aufgetragenes Takrolimus penetriert die Haut in Abhängigkeit von der verwendeten Konzentration, der ausgewählten Grundlage und der Integrität der epidermalen Barriere in unterschiedlichem Maß. Hierin liegt die Basis für die Anwendbarkeit in dermatologischen Externa zur gezielten topischen, immunsuppressiven Behandlung

HO

O

O

O O

O

OCH3

H3CO

CH3

CH3 CH3

OH

OH

O

CH3

OCH3

CH2

H3C

entzündlicher Dermatitiden. Bei Einarbeitung von Takrolimus in eine sehr lipophile Salbengrundlage können somit auch bei äußerlicher Anwendung therapeutische Konzentrationen in befallenen Hautarealen ohne systemische Akkumulation des Wirkstoffes erreicht werden (WOLLENBERG und BIEBER 1997; RUZICKA et al.

1997; BIEBER 1998).

Als Nebenwirkungen nach systemischer Verabreichung stehen die stark ausgeprägte Nephrotoxozität und allgemeine Immunsuppression im Vordergrund, gefolgt von gastrointestinalen (Vomitus, Nausea) und neurologischen Effekte (Tremor) (BORNHÖVD et al. 2000).

Die wichtigste unerwünschte Nebenwirkung nach topischer Takrolimus- Anwendung ist ein von Patienten als „Brennen“ oder „Hitzegefühl“ beschriebene transientes Mißempfinden am Applikationsort (RUZICKA et al. 1997). Diese Erscheinungen klingen jedoch nach 30-90 Minuten von selbst ab. Dauer und Intensität des Brennens nehmen nach 5-10 tägiger Behandlung ab und verlieren sich schließlich. Topisch angewendetes Takrolimus beeinflußt weder die Kollagensynthese der Haut, noch kommt es zu einer Hautatrophie (REITAMO et al.

1998).

2.4.3.2.1 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vivo

In entzündlich veränderten Hautarealen werden Keratinozyten, Langerhans- Zellen, inflammatorische dendritische Zellen und T-Lymphozyten in ihrer biologischen Funktion und im Immunphänotyp verändert; nachfolgend sind die Effekte von Takrolimus auf diese Zellen aufgeführt.

Untersuchungen zur Takrolimuswirkung in psoriatisch veränderten Hautarealen des Menschen ergeben, daß der Interleukin-8 (IL-8)-Rezeptor von Keratinozyten dosisabhängig herunterreguliert wird (SCHULZ et al. 1993). Untersuchungen von WOLLENBERG et al. (1996) zum atopischen Ekzem ergeben, daß Langerhans- Zellen durch topische Takrolimus-Behandlung beeinflußt werden: So berichten sie von einer Herunterregulation des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) auf dendritischen Zellen der Haut. Der Anteil von dendritischen Zellen fällt unter die

Nachweisgrenze und deren Stimulationskapazität gegenüber autologen T- Lymphozyten wird reduziert (WOLLENBERG et al. 1996).

Häufig verwendete und gut studierte In-vivo-Modelle zur zellmediierten Immunantwort sind Kontaktallergie-Modelle bei der Maus.

In einem Trinitrochlorobenzen (TNCB)- vermittelten Kontaktallergie-Modell untersuchen SALERNO et al. (1998) Effekte von Takrolimus: Nach Injektion von Lymphknotenzellen TNCB-sensibilisierter und Takrolimus behandelter Tiere in naive Empfängertiere entwickeln diese im Vergleich zur Kontrolle keine Kontaktallergie, gemessen an der Ohrschwellung. Ferner arbeiten SALERNO et al. (1998) den Einfluß von Takrolimus auf bestimmte T-Zell-Subpopulationen heraus: αβ⁺ und γδ⁺ T- Lymphozyten sind für die Etablierung einer Kontaktsensitivität essentiell; unter dem Einfluß von Takrolimus vermögen diese Zellen jedoch keine Kontaktsensitivität im Vergleich zu Kontrolltieren zu induzieren. Des weiteren werden die Produktion von IL-2 und die T-Zell-Proliferation nach DC-vermittelter Antigenstimulation (TNBC) durch systemische Behandlung der Tiere verhindert.

Im Oxazolon induzierten Kontaktallergiemodell untersuchen HOMEY et al. (1998) die Zytokinexpression epidermaler Zellen und von Lymphknotenzellen sowie deren Immunphänotyp: Durch Behandlung mit Takrolimus wird die Lymphknotenproliferation inhibiert und eine Abnahme der inflammatorischen Zytokine IL-1β, TNF-α und IFN-γ in der Haut erreicht. FACS-Analysen epidermaler Zellen behandelter Tiere ergeben eine Abnahme von CD4⁺ T-Zellen in der Haut.

2.4.3.2.2 Wirkung von Takrolimus auf Immunzellen in vitro

Die DC-vermittelte Antigenpräsentation gegenüber T-Lymphozyten verläuft unter dem Einfluß zahlreicher Zytokine und exprimierter Zelloberflächenmoleküle. Murine, in vitro generierte DCs und T-Lymphozyten werden bei der bidirektionalen Interaktion während der Antigenpräsentation durch Takrolimus in unterschiedlicher Art und Weise beeinflußt. MATSUE et al. (2002) finden bei DCs eine Herunterregulation der von DCs produzierten Interleukine 6 und 12, sowie der T-Zell-Zytokine IL-2, IL-4 und IFN-γ. TIEFENTHALER et al. (2004) berichten von einer Inhibition der IL-12- Produktion durch Takrolimus bei humanen monocyte-derived DCs. Zudem weisen

mit Takrolimus generierte DCs eine verminderte Allostimulationsfähigkeit gegenüber T-Lymphozyten in der MLR auf (SZABO et al 2001). WOLTMAN et al. (2000) berichten von einer lediglich partiellen TNF-α Inhibition durch Takrolimus bei CD40L stimulierten DCs.

Untersuchungen des DC-Immunphänotyp ergeben eine Herunterregulation von CD69 nach LPS-Stimulation und Takrolimus-Inkubation der Zellen während der DC/T-Zell-Interaktion (MATSUE et al. 2002). In vitro unter Takrolimus-Einfluß generierte DCs zeichnen sich im Immunphänotyp durch eine Abnahme der CD1a⁺, CD40 und CD86 Oberflächenmoleküle aus. Gegensätzliches zur Beeinflussung des Immunphänotyps von DCs berichten COS et al. (2002) und WOLTMAN et al. (2000).

So finden sie keine Unterschiede nach Takrolimus-Behandlung im Vergleich zu Kontrollzellen nach LPS- bzw. CD40L-Stimulation der DCs. Ebenso finden SZABO et al. keinen Einfluß von Takrolimus auf die Expression von CD80, CD86, MHC-I und MHC-II Oberflächenmolekülen. Untersuchungen zum Immunphänotyp isolierter epidermaler Langerhanszellen wiederum ergeben eine Alteration der Oberflächenmoleküle: Während der Maturation zu DCs inhibiert Takrolimus die Expression von CD25, CD40 und CD80 ebenso wie die von MHC-I und MHC-II.

Tab. 2-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Takrolimus. Literatur s. Text Zelltyp in vivo in vitro Keratinozyten Down-Regulation

IL-8 Rezeptor

Langerhans-Zellen Down-Regulation FcεRI CD25, CD40, CD80, MHC-I, MHC-II↓

DCs Down-Regulation FcεRI T-Zell Allostimulation↓ IL-6 und IL-12↓

T-Zell Allostimulation↓

T-Lymphozyten Lymphknotengewichte IL-2, IL-4, IFN-γ↓

(eigene Untersuchungen) Proliferation↓

αβ⁺/γδ⁺T-Zellen Inhibition der Kontaktallergie

im TNCB-Modell

CD4⁺ T -Zellen Reduktion der Zellzahl in

der Haut im TNCB-Modell

2.4.3.3 Rapamycin

Rapamycin ist ein natürliches Fermentationsprodukt der Actinomyces-Art Streptomyces hygroscopicus, das vor 25 Jahren aus einer Bodenprobe der Osterinsel Rapa Nui isoliert wurde und als putatives Fungizid den Namen Rapamycin erhielt. Bei Rapamycin handelt es sich um ein weiteres Immunsuppressivum aus der Gruppe der Makrolide mit einem Molekulargewicht von 914 Dalton; es zählt pharmakologisch zur Gruppe der mTOR (mammalian target of rapamycin)-Kinase- Inhibitoren (ABRAHAM und WIEDERRECHT 1996). Rapamycin (Rapamune^R) ist zugelassen zur Prophylaxe der Organabstoßung bei Patienten, die ein Nierentransplantat erhalten.

Nach Aufnahme in die Zelle erfolgt – analog zu Takrolimus – eine Bindung an FKBP-12; der entstandene Komplex hemmt dann allerdings nicht die Phosphatase Calcineurin und damit die Ca²⁺ -abhängige Transkription der Gene für die Synthese von IL-2. Angriffspunkt dieses Komplexes ist die Kinase mTOR (siehe Abb. 2-2).

Durch die Inhibition dieser Kinase wird der Zellzyklus in einer späten Phase (G1 zu S) blockiert. Im Gegensatz zu Takrolimus, welches den Zellzyklus in einer frühen Phase moduliert und die IL-2 Synthese hemmt (frühe G1-Phase), wird also durch Rapamycin die Zellantwort auf produzierte Zytokine unterdrückt (VASQUEZ 2000).

Maximale Blutspiegel werden beim Menschen nach einer Stunde erreicht, die Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme beträgt nur 15%. Die mittlere Halbwertzeit wird mit 62 ± 16 Stunden angegeben.

Als klinisch bedeutsame Nebenwirkungen werden für Rapamycin Hyperlipidämien, eine höhere Infektanfälligkeit (verursacht durch die Immunsuppression) und ein erhöhtes Risiko für maligne Syndrome, insbesondere Lymphome und Hautkrebs angegeben.

Abb. 5-2: Strukturformel von Rapamycin

2.4.3.3.1 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vivo

Den Einfluß Rapamycin auf die Funktion dendritischer Zellen untersuchen HACKSTEIN et al. (2002): In vitro generierte und in vivo injizierte murine DCs weisen eine herabgesetzte Antigenaufnahme auf; dies äußert sich in einer Reduktion der Makropinozytose und Mannose-Rezeptor-vermittelten Endozytose von Fluorescinisothicyanat (FITC)-Albumin bzw. FITC-Dextran. Die Hemmung der Endozytose wird dabei nicht durch Apoptose verursacht. In weiteren Untersuchungen berichten HACKSTEIN et al. (2003) von einer beeinträchtigten Generierung und Mobilisation von DCs unter dem Einfluß von Rapamycin sowie einer Modulation ko- stimulatorischer Oberflächenmoleküle (CD80 und CD86), pro-inflammatorischer Zytokine (TNF-α) und der T-Zell Allostimulation (s. Tab. 3-2).

Analog zur Takrolimuswirkung im TNCB-Modell berichten SALERNO et al. (1998) über eine wirkungsvolle Hemmung der Kontaktsensitivität durch systemische

CH3

CH3

CH3

OCH3

OCH3

H3CO H3C H3C

H3C O

O

O O

O

H3C OH OH

HO

O

O N

Verabreichung von Rapamycin; auch hierfür wird ein direkter Einfluß auf αβ⁺ und γδ⁺ T-Lymphozyten diskutiert. Allerdings wurde die IL-2 Synthese nicht gehemmt.

Abb. 6-2: Wirkmechanismen der Makrolid-Immunsuppressiva Takrolimus und Rapamycin (RAPA) nach BORNHÖVD et al. (2000)

2.4.3.3.2 Wirkung von Rapamycin auf Immunzellen in vitro

In-vitro- Untersuchungen von MONTI et al. (2003) können die In-vivo-Ergebnisse (HACKSTEIN et al. 2002) hinsichtlich einer Beeinflussung der DC-Antigen-Aufnahme bestätigen. Durch Inkubation mit Rapamycin weisen humane monocyte-derived DCs eine verminderte FITC-Dextran Endozytose auf. Weiterhin werden die Oberflächenmoleküle CD1a, MHC-I, MHC-II, CD80, CD86 und CD40

FK 506

FK 506 RAPA

RAPA

Zellkern Transkription:

IL-2, TNF-α Mitogenese GM-CSF

FKBP-12 FKBP-12

mTOR NF-ATp

herunterreguliert. Anders als In-vivo-Untersuchungen gezeigt, induziert Rapamycin jedoch die Apoptose von DCs (WOLTMAN et al. 2001, MONTI et al. 2003). Die apoptotische Wirkung von Rapamycin wirkt sich dabei exklusiv auf DCs aus, was WOLTMAN et al. (2003) in Untersuchungen an monocyte-derived DCs zeigen.

Diskutiert wird eine Interruption der GM-CSF-Signalkaskade mit nachfolgender Überexpression des pro-apoptotischen Zellzyklus-Inhibitors p27, vermittelt durch die mTOR-Inhibition durch Rapamycin.

Den suppressiven Einfluß von Rapamycin auf die DC-Aktivierung untersuchen (HACKSTEIN et al. 2003); Rapamycin hemmt danach die IL-4 abhängige Maturation der DCs und deren Fähigkeit zur T-Zell-Allostimulation sowie die Produktion von TNF-α. Posttranskriptional sind die beobachteten Effekte bei DCs mit einer Down- Regulation der zwei IL-4 Rezeptor-Untereinheiten CD124 und CD132 verbunden.

Den Effekt von Rapamycin auf die DC/T-Zell Interaktion untersuchen MATSUE et al. (2002). Rapamycin inhibiert wirkungsvoll die DC-vermittelte T-Zell Proliferation, hat jedoch keinen Einfluß auf die Zytokinproduktion der DCs (IL-6 und IL-12 p40) und der T-Lymphozyten (IL-2, IL-4, IFN-γ). Das DC-Oberflächenmolekül CD40 wird durch Rapamycin in seiner Expression während der Antigenpräsentation gehemmt.

Tab. 3-2: Zusammenfassung der In-vivo/In-vitro-Wirkungen von Rapamycin. Literatur s. Text Zelltyp in vivo in vitro DCs Antigen-Aufnahme↓ Antigen-Aufnahme↓

Generierung, Mobilisation↓ CD1a, CD40, CD80, CD86, CD80, CD86, TNF-α↓ MHC-I, MHC-II↓

T-Zell-Allostimulation↓ Apoptose-Induktion T-Zell-Allostimulation↓

IL-4 abhängige Maturation,

IL-4 Rezeptor-Komplex

(CD124, CD123)↓

TNF-α↓

T-Zellen Inhibition der Kontaktallergie Proliferation↓

(αβ⁺ + γδ⁺T-Zellen)

3 Material und Methoden

3.1 Geräte und Reagenzien

3.1.1 Geräte für Zellkulturversuche

Kühlzentrifuge Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg

Brutschrank US AutoFlow, Zapf, Sarstedt Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen Polypropylen-Röhrchen,

15 ml/50 ml Greiner, Frickenhausen Petrischalen, tissue culture dish cell+, Sarstedt 100mm x 20mm

6-,12-,24,-96-well-plates Greiner, Frickenhausen Pipettenspitzen, 10 ml Greiner, Frickenhausen 96-well-plates, round-bottom Greiner, Frickenhausen Einmalspritzen, 2/10 ml Omnifix, Braun, Melsungen Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 14 Terumo, Leuven, Belgien

Einmal-Injektions-Kanüle, Nr 20 Omnifix, Braun, Melsungen Feinwaage Sartorius 2002 MP1, Sartorius, Göttingen

Digitalkamera PowerShot A70, Canon Inc., Malaysia

3.1.2 Reagenzien für Zellkulturversuche

RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin, Deutschland

Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe

10% FKS Biochrom, Berlin, Deutschland

β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim

GM-CSF R&D-Systems, Minneapolis, USA

MIP-3β R&D-Systems, Minneapolis, USA

Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen

NH4Cl Merck, Darmstadt

EDTA Aldrich, Steinheim

KHCO3 Merck, Darmstadt

LPS E. coli O127 B8, Sigma, Steinheim

Na2-EDTA Merck, Darmstadt

NaHCO3 Merck, Darmstadt

Cilomilast Elbion AG, Radebeul

Rapamycin Wyeth-Agent Research Lab.,

Princeton, USA

Takrolimus In-vivo-Versuche: freundliche Gabe

von Prof. Dr. Wozel, Dresden

In-vitro-Versuche: Calbiochem, Darmstadt

Protopic^R Fujisawa Healthcare, Japan

TDI Sigma, Steinheim

Trypan-Blau Sigma, Steinheim

3H-Thymidin (1mCi) Hartmann Analytic, Braunschweig

3.1.3 Geräte für Zymographie

Netzanschlußgerät PowerSupplyUnit 1200/200, Desaga, Heidelberg

Elektophoresekammer Penguin Water-Cooled Dual-Gel

Electrophoresis System, Peqlab,

Erlangen

Gelgießstand Multiple Gradient Caster, Peqlab, Erlangen

Hamilton-Spritze, 10 µl Microliter, Hamilton-Bonaduz, Schweiz