3 Material und Methoden
3.4 In-vivo-Versuche zur allergischen Kontaktdermatitis
3.4.1 TDI-Kontaktallergiemodell
Eine Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen TDI (Toluen-2,4-diisocyanat) erfolgte über eine topische Applikation von TDI (in Aceton gelöst) auf die rasierte Bauchhaut an 4 aneinanderfolgenden Tagen (s. Abb. 3-3). An Tag 1 wurden 100 µl der 5% TDI-Lösung topisch appliziert, an den Tagen 2-4 jeweils 50 µl.
Zusätzlich wurde an den Tagen 1-3 die Hornschicht der Epidermis der rasierten Bauchhaut vor TDI-Applikation mittels Adhäsiv-Klebestreifen abgestrippt, um ein besseres Eindringen des TDI in die Haut zu gewährleisten.
An Tag 21 erfolgte die Challenge der sensibilisierten Mäuse; hierfür wurden 20 µl einer 0,5% TDI-Lösung auf die äußere und innere Ohrseite appliziert. Die Mäuse wurden dann in Abhängigkeit von der Stärke der inflammatorischen Reaktion des Ohres in low-und high-responder gleichmäßig aufgeteilt, so daß in jeder Versuchsgruppe die Anzahl der low-und high-responder-Tiere identisch war. Die Challenge des kontralateralen Ohres erfolgte an Tag 28. Parallel wurde eine Vehikelkontrolle durchgeführt.
Tage 1-4:Sensibilisierung
Tag 21: Challenge I; MEST I
Tag 27: Challenge II; Behandlung I
Tag 28: Behandlung II; MEST II; Organkultur
Entnahme der Lnn. Auriculares für LLNA
Abb. 3-3: Schematische Darstellung des TDI-Modells
3.4.2 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im allergischen Entzündungsgeschehen
Durch die Sensibilisierung gegenüber dem Kontaktallergen TDI und Challenge der allergischen Reaktion wurde eine allergische, aseptische Entzündungsreaktion der Ohren hervorgerufen.
In Vorversuchen wurden Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf den Applikationswegen topisch, intraperitoneal und per os vergleichend verabreicht (Tabellen 5-, 6-, 7-, 8-3). In den darauf folgenden Hauptversuchen wurde Cilomilast topisch, Takrolimus topisch und intraperitoneal verabreicht (Tabellen 9- und 10-3).
Um zu untersuchen, welchen Einfluß der Immunstatus der Versuchstiere auf die Wirksamkeit der Pharmaka ausübt, wurden für den 1. Hauptversuch bereits aus vorherigen TDI-Versuchen die Versuchstiere geboostert, während für den 2.
Hauptversuch die Versuchstiere erstmalig mit TDI sensibilisiert wurden.
Die Behandlung der Tiere erfolgte an den Tagen 27 und 28 des Allergiemodells;
die Behandlung an Tag 28 erfolgte 2 Stunden vor der TDI-Challenge (Ausnahme:
Applikation von ProtopicR 30 Minuten nach TDI-Challenge, da die Salbe sonst die TDI-Penetration verhindert). 16 Stunden nach der letzten Behandlung der Mäuse wurden die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert.
Tab. 5-3: Übersicht über die Lösungsvermittlung von Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus;
Vehikelkontrolle entspricht der jeweiligen Lösungsvermittlung ohne Zusatz von Pharmaka 1)Bäumer et al. (2003a) ; 2)Carlson et al. (1993) ;3)Duncan (1994) ; 4)Hackstein et al. (2003) ; 5)Salerno et al. (1998)
Cilomilast Rapamycin Takrolimus per os Miglyol (10 ml/kg)1 Ethanol/Olivenöl
(1:9)2
Ethanol/Olivenöl (1:9)3
intraperitoneal 10% PEG 300, 0,5%
Tab. 6-3: Behandlungsschema Vorversuch, perorale Applikation
Vehikelkontrolle Cilomilast Rapamycin Takrolimus Tag 27 Vehikel 20 mg/kg p.o. 20 mg/kg p.o. 2,5 mg/kg p.o.
Tag 28 Vehikel 20 mg/kg p.o 20 mg/kg p.o 2,5 mg/kg p.o
Tab. 7-3: Behandlungsschema Vorversuch, intraperitoneale Applikation
Vehikelkontrolle Cilomilast Rapamycin Takrolimus Tag 27 Vehikel 20 mg/kg i.p. 20 mg/kg i.p. 2,5 mg/kg i.p.
Tag 28 Vehikel 20 mg/kg i.p. 20 mg/kg pi.p. 2,5 mg/kg i.p.
Tab. 8-3: Behandlungsschema Vorversuch, topische Applikation
Vehikelkontrolle Rapamycin Takrolimus
Tag 27 Vehikel 3% Lösung topisch
Tag 28 Vehikel 1% Lösung topisch ProtopicR 0,1%
Tab. 9-3: Behandlungsschema Hauptversuch 1
Vehikelkontrolle Cilomilast Takrolimus Tag 27 Vehikel 3% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p.
Tag 28 Vehikel 3% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p.
0,5% Lösung topisch
Tab. 10-3: Behandlungsschema Hauptversuch 2
Vehikelkontrolle Cilomilast Takrolimus Tag 27 Vehikel 5% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p.
Tag 28 Vehikel 5% Lösung topisch 2,5 mg/kg i.p. und 0,5% Lösung topisch;
ProtopicR 0,1%;
2 h nach TDI-Challenge vor Kultivierung Vehikel 5% Lösung topisch
3.4.3 Versuche zur Migration von dermalen/epidermalen DCs im nicht-inflammatorischen Modell
In diesem Versuchsansatz wurden Mausohren mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung behandelt, auf die Innen- und Außenfläche der Ohren der Kontrolltiere wurden jeweils 10 µl Vehikel-Lösung (Aceton/DMSO 9:1) appliziert. 2 Stunden später wurden die Tiere getötet und die Ohren im Skin-Migration-Assay kultiviert. Unmittelbar vor der Organkultur wurden die Ohren nochmals mit 20 µl 3%iger Cilomilast-Lösung behandelt.
3.4.5 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)
Prinzip des MEST ist die Erfassung der TDI-induzierten allergischen Entzündungsreaktion am Ohr. Dabei wurde die Ohrdicke mit einem Kutimeter (Mitutoyo, Neuss) gemessen. Die Durchführung des MEST erfolgte in Anlehnung an GAD et al. (1986).
Zunächst erfolgte eine Messung an Tag 21 vor und nach TDI-Challenge, um die Mäuse einzuteilen: high-responder-Tiere waren solche, die eine starke Entzündungsreaktion (gemessen an der Ohrschwellung) aufwiesen, low-responder-Tiere solche mit einer entsprechend geringeren Ohrschwellung. Low- und
High-responder-Tiere wurden somit erfaßt und anschließend gleichmäßig auf die Versuchsgruppen aufgeteilt.
Die nächste Messung erfolgte an Tag 28, 16 Stunden nach der 2. TDI-Challenge, um einen Effekt der verwendeten Pharmaka hinsichtlich der Inhibition der Ohrschwellung und somit der Entzündungsreaktion zu zeigen.
3.4.6 Skin-Migration-Assay
Prinzip dieses Assays ist es, dermale und epidermale DCs der Maushaut zu gewinnen und ihr Migrationsverhalten unter Einfluss von Immunmodulatoren zu untersuchen. Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an ORTNER et al. (1996).
Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet, die Ohren abgetrennt und für ca. 10 min. in 70% Ethanol-Lösung desinfiziert und anschließend luftgetrocknet.
Mittels zweier Pinzetten wurden die dorsale und ventrale Ohrhälfte voneinander getrennt. Die dorsale, knorpelfreie Ohrhälfte wurde - mit der Epidermis nach oben zeigend - auf ein dreibeiniges Edelstahlnetz in eine 24-well Platte gelegt und das well mit 1,3 ml Kulturmedium (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS 10%, Pen-Strep und 50 ng/ml MIP-3β) gefüllt (s. Abb. 4-3).
Diese Organkultur wurde über 3 Tage im Brutschank bei 37°C inkubiert. Die Ohrexplantate wurden täglich in eine neue Platte mit frischem Medium umgesetzt.
Am 3. Tag wurden die Medien von Tag 2 und 3 gepoolt und zentrifugiert (1000 g, 4°C, 10Minuten), die Überstände verworfen und die ausgewanderten Zellen in der Neubauer-Kammer ausgezählt. Die Mausohren wurden anschließend gewogen und bei –80°C eingefroren.
Die Anzahl ausgewanderter Zellen bzw. ausgewanderte Zellen/mg Ohrgewebe errechnete sich nach folgenden Formeln:
Anzahl ausgewanderter Zellen = gez. Zellen/4 x 3 x 10.000 x (Restvolumen/1000) Anzahl ausgewanderter Zellen/mg Ohrgewebe = ausgewanderte Zellen/Ohrgewicht
Abb. 4-3: Schematische Darstellung des Skin-Migration-Assays
3.4.7 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA)
Der LLNA ist eine Methode, um die Proliferationsrate von T-Lymphozyten eines regionalen Lymphknotens nach Stimulation durch antigenpräsentierende dendritische Zellen post mortem zu messen. Die Durchführung dieser Methode erfolgte in Anlehnung an KIMBER und WEISENBERGER (1989). Funktioneller Parameter ist hier das gemessene Lymphknotengewicht, welches ein Maß für die durch DCs induzierte stattgefundene T-Zellproliferation ist. Die zu untersuchenden regionalen Lymphknoten wurden entnommen und anschließend deren Gewicht bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lnn. auriculares der TDI-sensibilisierten Mäuse verwendet.
Langerhans-Zelle/DCs der Haut Haut-Explantat
Medium Metall-Tisch Epidermis
3.4.8 Aufbereitung der Zymographie-Proben
Die tiefgefrorenen Mausohren (s. 3.4.6) wurden in einer Keramikreibschale mit flüssigen Stickstoff überschichtet und zerrieben; das Ohrhomogenat wurde anschließend in Eppendorfgefäße überführt, in 150 µl PBS aufgenommen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden anschließend durchmischt und zentrifugiert (3000 x g, 10 Minuten, 4°C). Die Überstände wurden entnommen und eine Proteinbestimmung durchgeführt. Alle Proben wurden auf die gleiche Proteinkonzentration eingestellt.
3.4.9 Biorad-Proteinbestimmung
Prinzip der verwendeten Protein-Bestimmung ist eine Farbänderung der Proteinlösung nach Zugabe eines Farbstoffes: Gelöstes Protein wurde in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und mit der Reaktionsreagenz vermischt. Die Wellenlänge des Absorbtionsmaximum des sauren Farbstoffs verschiebt sich von 465 nm nach 595 nm, wenn der Farbstoff an vorhandenes Protein bindet. Nach fünfminütiger Inkubation auf einem Horizontalschüttler wurden die Proben photometrisch bei 595 nm Wellenlänge ausgewertet. Der Vergleich zu einer angelegten Kalibrationsreihe erlaubt eine Berechnung der absoluten Proteinkonzentration der Proben.
Durchführung des Biorad-Assay:
• Ansetzen einer Kalibrationsreihe in 1:2 Verdünnungsschritten aus Protein-Standard (1 mg Protein/ml), ausgehend von 80 µg Protein/ml; je 160 µl Proteinlösung wurden in die Mikroititerplatte pipettiert
• 1 µl der Probenlösung wurden in die Mikrotiterplatte pipettiert, 159 µl RPMI-Medium zugeben und mit der Pipette gemischt
• zu jeder Probe bzw. Kalibrationspunkt wurden 40 µl Biorad-Reagenz hinzugeben und mit der Pipette gemischt
• die Platte wurde für 5-10 Minuten inkubiert und danach im Microplate-Reader bei 570 nm Wellenlänge ausgelesen
3.4.10 Zymographie
Zum Nachweis der proteolytischer Aktivität von Matrix-Metalloproteinasen in den Überständen der Mausohr-Homogenate wurde in Anlehnung an KLEINER und STELER-STEVENSON (1993) eine Zymographie mit Gelatine als Substrat im SDS-Polyacrylamid-Gel durchgeführt Die Zymographie entspricht einer Elektrophorese unter nicht–reduzierenden Bedingungen mit Zusatz von 1 mg/ml Gelatine zum 7,5%-Acrylamid haltigen Gel.
Das Zymographie-Gel wurde im Gradienten-Gießstand gegossen und bei Raumtemperatur bis zur Polymerisation inkubiert. Anschließend wurde das Gel in die Elektrophoresekammer eingespannt und die Kammer mit Elektrodenpuffer gefüllt.
Die Probentaschen des Gels wurden mit jeweils 20 µl Probe und 20 µl Probenpuffer gefüllt. Zur Darstellung des Molekulargewichts der aufgetrennten Proben wurde zusätzlich zu den Proben ein Molekulargewichtsstandard auf das Gel aufgetragen.
Die Proben wurden anschließend bei einer Spannung von 200 mV in 2 Stunden aufgetrennt.
Nach Beenden der Elektrophorese wurde das Gel 30 Minuten in Triton X (2,5 %) auf einem Schüttler zur Entfernung des SDS aus dem Gel gewaschen. Anschließend wurde das Gel für weitere 30 Minuten auf dem Schüttler mit dem Entwicklungspuffer inkubiert und danach mit frischem Entwicklungspuffer 16 Stunden bei 37°C im Hybridisierungsofen inkubiert, wobei die als Proteolyse-Substrat angebotene Gelatine verdaut wurde. Das Gel wurde nun mit Coomassie-Brillantblau (5 %) 30 Minuten auf dem Schüttler gefärbt und viermal für 30 Minuten mit Entfärbelösung gewaschen, bis sich weiße Banden gegen den blauen Hintergrund des Gels abzeichneten. Das Gel wurde für 10 Minuten in Geltrocknungslösung gelegt und zwischen 2 Streifen Einmachhaut in einem Kunstoffrahmen 3 Tage unter dem Abzug getrocknet. Zur quantitativen, densitometrischen Auswertung wurden die Zymographie–Gele eingescannt und in einem Fotoverarbeitungsprogramm gespeichert. Anschließend erfolgte mit einer Auswertungssoftware eine Grauwertbestimmung der gelatinolytischen Banden des Gels und des Gelhintergrundes. Die ermittelten Grauwerte wurden schließlich in optische Dichte (OD) umgerechnet (OD = log10 [255/Grauwerte]) und als Grauwertdichte dargestellt.
Die Subtraktion der OD des Hintergrundes von der OD der gelatinolytischen Banden ergab die Netto-OD und war somit ein Maß für die gelatinolytische Aktivität der MMP-9.