Nicht-inflammatorisches Modell

Bereits TURNBULL und MACPERSON (2001) beschrieben eine In-vivo-Steady-State-Migration dendritischer Zellen. Die Migrationsergebnisse an unbehandelten Ohrexplantaten aus den eigenen Untersuchungen sind mit Angaben von ORTNER et al. (1996) vergleichbar. Die während der Trennung der dorsalen und ventralen Ohrhälfte einwirkenden Scherkräfte und die damit einhergehende Mikroinflammation verursachen eine Aktivierung der im Ohrgewebe vorhandenen Immun- und Entzündungszellen. Dies bewirkt schließlich die Migration von Langerhans-Zellen und dermalen DCs (ORTNER et al. 1996, RATZINGER et al. (2002), was im nicht-inflammatorischen Migrations-Modell untersucht wurde.

Ob es sich bei den migrierten DCs überwiegend um Langerhans-Zellen aus der Epidermis oder um dermale DCs handelt, ist in der Literatur nicht beschrieben.

Versuche an humanen Haut-Explantaten jedoch zeigen, daß überwiegend Langerhanszellen und nicht dermale DCs migrieren (RATZINGER et al. 2002).

Durch die topische Applikation des PDE4-Inhibitors Cilomilast (Lösung, 3%) wird die DC-Migration im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant gehemmt. Die Gründe hierfür sind in der Inhibition der aktiven Form der MMP-9 (s. 4.2.1) und der Inhibition

der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α (BÄUMER et al. 2003b), welche die Expression der MMPs regulieren (s. 2.2.2.1), durch Cilomilast zu sehen. Dabei ist anzunehmen, daß als Quelle der MMP-9 zum einen durch Scherkräfte aktivierte Keratinozyten (MAKELA et al. 1998), zum anderen Langerhanszellen und dermale dendritische Zellen in Frage kommen (KOBAYASHI 1997, RATZINGER et al. 2002).

Die Expression und Aktivierung der MMP-9 dieser Zellen wird unter dem Einfluß von IL-1β und TNF-α heraufreguliert. Als Quelle der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α werden Keratinozyten und dendritische Zellen diskutiert (WANG et al.

1997). Somit kommen als Zielzellen zur Vermittlung der Migrationsinhibition durch Cilomilast dendritische Zellen und Keratinozyten in Betracht, da sie beide PDE4 exprimieren (TENOR et al. 1995, GANTNER et al. 1999, CHUJOR et al. 1998).

Aufgrund der beschriebenen Zusammenhänge wäre es denkbar, daß Cilomilast bereits an einem frühen Kontrollpunkt der Migration wirkt und durch Hemmung der PDE4 in aktivierten Keratinozyten (TENOR et al. 1995) deren Zytokinproduktion (TNF-α und IL-1β) inhibiert, mit der Folge, daß Adhäsionsmoleküle wie E-Cadherin nicht herunterreguliert und MMPs zur enzymatischen Proteolyse nicht heraufreguliert werden. Langerhanszellen und dermale DCs würden demnach nicht aktiviert und blieben an Ort und Stelle. Hinsichtlich der Hemmung der Zytokinproduktion und Regulation von E-Cadherin und MMPs ist für DCs ein gleichsinniger Wirkmechanismus für Cilomilast denkbar. Ob jedoch Cilomilast die Expression von MMP-9 direkt durch eine PDE4-Inhibition hemmt, kann mit den eigenen Assays nicht ausreichend untersucht werden.

Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen lassen somit darauf schließen, daß der PDE4-Inhibitor Cilomilast die Migration dendritischer Zellen der Haut bereits unter nicht-inflammatorischen Bedingungen wirksam beeinflußt.

5.1.2 TDI–Kontaktallergiemodell

In diesem Modell sollte unter inflammatorischen Bedingungen der Einfluß der immunwirksamen Pharmaka Cilomilast, Rapamycin und Takrolimus auf die Migration dendritischer Zellen der Haut untersucht werden. Mit diesem Versuchsmodell verbunden sind zudem der LLNA, der MEST sowie die densitometrische Auswertung der MMP-9-Aktivität (Zymographie); diese Assays dienen als funktionelle Parameter einer erfolgten DC-Migration und anschließend erfolgter Induktion bzw.

Auslösephase der dermalen Kontaktallergie.

In Vorversuchen werden die Testsubstanzen oral und intraperitoneal appliziert, zudem erfolgt ein Vergleich von Rapamycin und Takrolimus nach topischer Applikation. Keine der verwendeten Substanzen kann in die durch TDI induzierte Migration dendritischer Zellen inhibieren. Dies geht einher mit den Ergebnissen zymographischer Untersuchungen (s. 4.2.2), denn die densitometritische Auswertung ergibt keine sichtbare Inhibition der MMP-9-Aktivität durch die verwendeten Pharmaka. Die Ergebnisse des MEST verdeutlichen zudem, daß auch die DC-T-Zell-Interaktion nicht wirksam beeinflußt wird, da die allergische Immunreaktion in der Auslösephase durch den Einsatz der Testsubstanzen nicht verhindert wird und sich das klinische Bild der Kontaktallergie ungehindert entwickelt. Im Vergleich der Substanzen ergeben sich jedoch Unterschiede: Während Cilomilast und Rapamycin hinsichtlich einer Beeinflussung der Ohrschwellung keinen Effekt zeigen, ist bei Takrolimus ein inhibitorischer Einfluß zu erkennen, wenn auch nur tendentiell.

Vermutlich ist die ausbleibende Wirkung der Pharmaka in den Vorversuchen durch die pharmakokinetischen Eigenschaften der Testsubstanzen sowie das Behandlungsschema zu erklären. So ließe sich bei Rapamycin die fehlende Wirkung durch die schlechten Bioverfügbarkeit nach oraler Aufnahme (15%) erklären. Der ausgebliebene Effekt von Cilomilast und Takrolimus nach alleiniger systemischer Verabreichung könnte mit der verwendeten Dosis erklärt werden. Der Einsatz höherer, eventuell wirksamer Dosierungen birgt das Risiko der Arzneimittelunverträglichkeit und wurde nicht durchgeführt. Im Vergleich zum Skin-Migration-Assay unter nicht-inflammatorischen Bedingungen zeigen sich im TDI-Modell bei den unbehandelten Vehikelkontrollen höhere Migrationsraten

dendritischer Zellen. Dies bestätigt, daß die DC-Migration unter inflammatorischen Bedingungen heraufreguliert wird (KOBAYASHI 1997).

In Hauptversuchen wurden Cilomilast und Takrolimus verwendet. Da Rapamycin in den im TDI-Modell eingesetzten Dosierungen unabhängig von der Applikationsart (per os, topisch, intraperitoneal) – anders als im TNCB-Modell beschrieben (SALERNO et al. 1998) – keinen wirksamen Effekt zeigte, wurde es nicht weiter mit einbezogen.

5.1.3.1 Einfluß von MIP-3β auf die DC-Migration

KELLERMANN et al. (1999) postulieren einen chemotaktischen Effekt von MIP-3β während der Migration auf dendritische Zellen. Dies kann durch die eigenen Untersuchungen bestätigt werden: Vergleicht man die Migrationsraten der Vehikelkontrollen, so fällt auf, daß diese in den Hauptversuchen höher ausfielen als in den Vorversuchen. Vermutlich ist dieser Effekt in den Hauptversuchen auf den Zusatz von MIP-3β zur Organkultur zurückzuführen.

5.1.3.2 Cilomilast

Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays, der Zymographie, MEST sowie LLNA des 2. Hauptversuches geben Hinweise auf den Effektormechanismus von Cilomilast im TDI-Modell. Vermutlich beeinflußt Cilomilast die Funktion von Keratinozyten, DCs und T-Zellen. Die Ergebnisse der Skin-Migration-Assays lassen den Schluß zu, daß die Funktion der DCs durch Cilomilast an einem frühen Punkt der Challenge-Phase beeinflußt wird. Überträgt man die ex vivo gezeigte Inhibition der DC-Migration auf In-vivo-Verhältnisse, wird durch die ausbleibende DC-Migration (s. Abb. 6-4) in den regionalen Lymphknoten eine Aktivierung der haptenspezifischen T-Zellen und somit der allergischen Reaktion verhindert. Des weiteren wird vermutlich die Funktion von T-Lymphozyten, insbesondere die der CLA⁺ T-Gedächtniszellen in der Haut, durch Cilomilast moduliert. Diese Zellen können ohne DC-Kostimulation durch frei diffundierende Antigene aktiviert werden und tragen

somit zur allergischen Reaktion bei (KRASTEVA et al. 1999a, PIOR et al. 1999). Es ist daher möglich, daß diese Zellen durch topisch aufgetragenes Cilomilast in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Zudem lassen die In-vitro-Ergebnisse der MLR (Prä-Inkubation der Zellen, s. Abb. 26-4) einen direkten Einfluß von Cilomilast auf T-Zellen erkennen. Den hemmenden Einfluß von Cilomilast auf die Produktion des Th2-Zytokins IL-4 sowie die Hemmung von IL-6 aus aktivierten Keratinozyten beschreiben bereits BÄUMER et al. (2003a) und runden somit das Bild des pleiotropen anti-inflammatorischen Effekts von Cilomilast ab.

Im Vergleich zum 1. Hauptversuch müssen jedoch zwei Dinge berücksichtigt werden, welche die hier lediglich tendentiell zu erkennende Inhibition der Ohrschwellung durch Cilomilast erklären. Zum einen ist die verwendete Cilomilast-Konzentration im 2. Hauptversuch höher, zum anderen wurden für den 2.

Hauptversuch naive Versuchstiere sensibilisiert. Die Versuchstiere des 1.

Hauptversuchs dagegen sind aus vorherigen Versuchen bereits TDI-sensibilisiert bzw. geboostert und wurden für die Durchführung des 2. Hauptversuchs erneut sensibilisiert. Die Ergebnisse des MEST, des Skin-Migration-Assays, des LLNA sowie der Zymographie verdeutlichen den nur geringen Effekt von Cilomilast im 1.

Hauptversuch auf die Funktion der DCs. Dies läßt sich einerseits sicherlich durch die geringere Cilomilast-Konzentration erklären, andererseits ist der Immunstatus der Versuchstiere zu berücksichtigen. Da die Versuchstiere des 1. Hauptversuchs bereits in anderen TDI-Versuchen standen, erhöht sich für diese Tiere somit die Zeitdauer der Allergenexposition, verbunden mit einer zunehmenden Immunantwort – insbesondere der haptenspezifischen T-Zellen – während der Auslösephase. Es läßt sich die Hypothese aufstellen, daß T-Gedächtniszellen in der Haut nicht ausreichend supprimiert werden. Dies könnte den nur schwachen Effekt von Cilomilast im 1.

Hauptversuch erklären.

5.1.3.3 Takrolimus

Vergleicht man die Effekte von Takrolimus und Cilomilast im MEST, Skin-Migration-Assays, LLNA sowie in der Zymographie, so ergeben sich hieraus im Vergleich zu Cilomilast andere Erklärungsansätze für die Wirkung von Takrolimus im

TDI-Modell. So erfolgt durch die Applikation von Takrolimus keine Beeinflussung des Migrationsverhaltens der dendritischen Zellen (s. Abb. 5-4 und 6-4). Es ist zu folgern, daß durch die Applikation von Takrolimus auch die In-vivo-Migration nicht beeinflußt wird. Takrolimus inhibiert jedoch wirkungsvoll die Auslösung der Kontaktallergie. Da trotz erfolgter Migration dendritischer Zellen in den regionalen Lymphknoten dort kein Proliferationsprozeß von T-Lymphozyten stattfindet (s. Abb. 17-4), ist davon auszugehen, daß als primäre Zielzelle für Takrolimus T-Lymphozyten in Frage kommen. Die Ergebnisse der FACS-Analyse (s. 4.7.2) untermauern diese Hypothese, da die CD80- und CD86-Expression auf DCs durch Takrolimus nur marginal beeinflußt wird. Die hemmende Wirkung von Takrolimus auf die Proliferation von T-Zellen geht einher mit den MLR-Ergebnissen der eigenen Untersuchungen (s. 4.6.2). Die durch Takrolimus hervorgerufene Proliferationshemmung von T-Lymphozyten im regionalen Lymphknoten entspricht Angaben von SALERNO et al. (1998) sowie von HOMEY et al. (1998) für das TNCB- bzw. Oxazolon-Modell. Weiterhin zeigen sich zwischen Cilomilast und Takrolimus Unterschiede bezüglich der Wirkstärke; im Gegensatz zu Cilomilast bewirkt Takrolimus auch bei den länger sensibilisierten Versuchstieren eine wirkungsvolle Inhibition der Kontaktallergie, wie aus den Ergebnissen des MEST und LLNA ersichtlich. Zudem zeigt Takrolimus im MEST und LLNA im Vergleich zu Cilomilast eine stärkere inhibitorische Wirkung.

Abschließend betrachtet lassen die Resultate der eigenen Untersuchungen den Schluß zu, daß mit dem PDE4-Inhibitor Cilomilast und dem Calcineurin-Inhibitor Takrolimus zwei wirksame Pharmaka zur Prävention der Th2-mediierten Kontaktallergie zur Verfügung stehen.