Untersuchung zur Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen durch Schwermetalle

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

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Untersuchung zur Beeinflussung der Funktion dendritischer Zellen durch Schwermetalle

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Karoline Hünermann

aus Haselünne Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2006

Meiner lieben Familie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung………..…..1

2 Literaturübersicht………..…2

2.1 Dendritische Zellen……….2

2.1.1. Hämatopoese und Reifung der DC………...5

2.1.2. Steuerung der DC-Funktion………7

2.1.3. Antigenaufnahme, -prozessierung und –präsentation durch DC………..9

2.2 Schwermetalle………...11

2.2.1. Definition ……….12

2.2.2. Vorkommen……….12

2.2.3. Toxikologie………..13

2.3 Blei………..………15

2.3.1. Vorkommen……….15

2.3.2. Toxikokinetik.………..15

2.3.3. Toxikologie………..………16

2.4 Mangan………..………17

2.4.1. Vorkommen……….17

2.4.2.Toxikokinetik………18

2.4.3. Toxikologie………..18

2.5 Schwermetalle und ihr Einfluss auf Immunreaktionen….………..20

2.5.1. Allergische Kontaktdermatitis………20

2.5.2. TDI-Kontaktallergiemodell……….22

2.5.3. DNCB-Kontaktallergiemodell………23

2.5.4. Th1-/Th2-Antwort………24

2.5.5. In-vitro-Untersuchungen zur Beeinflussung der DC-Maturation und Immunreaktionen durch Schwermetalle……….26

2.5.5.1. MAPKinase-Signalwege und die Wirkungen von Schwermetallen..29

2.5.5.2. Einfluss der Schwermetalle auf die CCR7-Expression………..30

2.5.6. In-vivo-Untersuchungen zu immunmodulatorischen Effekten durch Schwermetalle………31

3 Material und Methoden………...34

3.1 Geräte und Reagenzien………...34

3.1.1. Geräte für Zellkulturversuche………34

3.1.2. Reagenzien für Zellkulturversuche………...35

3.1.3. Schwermetalle……….35

3.1.4. Geräte für ELISA……….36

3.1.5. Geräte für FACS-Analyse………..36

3.1.6. Reagenzien für FACS-Analyse………...36

3.1.7. Geräte für Westernblot………...37

3.1.8. Reagenzien für Westernblot……….37

3.2 Hergestellte Puffer und Lösungen………..38

3.3 Versuchstiere………...40

3.4 Versuchsübersicht……….41

3.4.1. In-vitro-Untersuchungen………42

3.4.1.1. Generierung von DC……….42

3.4.1.2. Gewinnung von T-Zellen………..43

3.4.1.3. Versuchsaufbau………..43

3.4.1.4. Zytokinbestimmung………...45

3.4.1.5. Migrationsassay……….45

3.4.1.6. FACS-Analyse………...46

3.4.1.7. Untersuchung der MAPKinase pp38 mit Hilfe des Westernblots…..48

3.4.1.8. T-Zellen: MLR, Vitalität und Proliferation………...48

3.4.2. In-vivo-Untersuchungen……….50

3.4.2.1. TDI-Kontaktallergiemodell………50

3.4.2.2. DNCB-Kontaktallergiemodell………..50

3.4.2.3. Bleibestimmung im Vollblut………...51

3.4.2.4. Untersuchung der allergischen Entzündungsreaktion anhand der Lnn. auriculares und der Ohrdickenmessung………...51 3.4.2.5. Untersuchung von Lymphknotenzellen aus den Lnn. auriculares….52

3.4.2.6. Migrationsassay……….53

3.4.2.7. Bestimmung von IL-4 aus dem Ohrhomogenat………..53

3.4.2.8. Proteinbestimmung………...53

3.5 Statistische Auswertung……….55

4 Ergebnisse……….56

4.1 In-vitro-Untersuchungen……….……56

4.1.1. Einfluss der Schwermetalle auf die Vitalität der DC und T-Zellen, sowie auf die Proliferation der T-Zellen……….……56

4.1.2. Einfluss von Blei und Mangan auf die TNF-α-Produktion………...58

4.1.3. Beeinflussung der DC durch Schwermetalle im Migrationsassay….60 4.1.4. Untersuchung der Expression von Oberflächenmolekülen in der FACS- Analyse………..62

4.1.5. Einfluss von Blei auf die MAPKinase p38……….67

4.1.6. Wirkung der Schwermetalle auf die T-Zellproliferation in der MLR..68

4.2 In-vivo-Untersuchungen……….72

4.2.1. Bleiwerte im Vollblut……….72

4.2.2. Einfluss von Blei auf die entzündliche Ohrschwellung………...73

4.2.3. Einfluss von Blei auf die lokalen Lymphknoten (Lnn. auriculares)..74

4.2.4. Ergebnisse der Migrationsassays……….80

4.2.5. Einfluss von Blei auf die Lymphknotenzellen………..81

4.2.6. Einfluss von Blei auf die IL4-Produktion im Kontaktallergiemodell..83

5 Diskussion……….84

5.1 Einfluss der Schwermetalle auf die DC- und T-Zellfunktionen …………..84

5.1.1. Einfluss der Schwermetalle auf die Vitalität sowie auf die p38- Aktivierung ………..84

5.1.2. Einfluss von Blei und Mangan auf die TNF-α-Produktion durch DC..85

5.1.3. Einfluss von Blei und Mangan auf die CCR7-Expression………86

5.1.4. Beeinflussung der DC-Migration durch Schwermetalle ………..87

5.1.5. Einfluss von Blei und Mangan auf die CD80/86-Expression………...88

5.1.6. Wirkung von Blei und Mangan auf die T-Zellproliferation………90

5.2 Einfluss von Blei im Allergiegeschehen………..93

5.2.1. Einfluss von Blei auf die entzündliche Ohrschwellung………...93

5.2.2. Einfluss von Blei auf die lokalen Lymphknoten (Lnn. auriculares)….94 5.2.3. Einfluss von Blei im Migrationsassay………..95

5.2.4. Einfluss von Blei auf Lymphknotenzellen in der Zellkultur…………..96

5.2.5. Einfluss von Blei auf die IL4-Produktion im Kontaktallergiemodell…96 6 Zusammenfassung……….……….98

7 Summary………..………100

8 Literaturverzeichnis………..102

9 Anhang……….115

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

APC Antigenpräsentierende Zellen BC Boyden Chamber

CCL Chemokine Ligand CCR Chemokine Receptor CD Cluster of Differentiation

DC Dendritic Cell(s), dendritische Zelle(n) DNCB 2,4-Dinitrochlorobenzol

ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay g Gramm

GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor IFN Interferon

Ig Immunglobulin IL Interleukin i.p. intraperitoneal LPS Lipopolysaccharide mA Milliampere

MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 mg Milligramm

MHC Major-Histocompatibility -Complex MIP-3β Macrophage-Inflammatory-Protein-3 β ml Milliliter

MLR Mixed Leukocyte Reaction Mn Mangan

MW Molekulargewicht OD Optische Dichte PGE2 Prostaglandin E2 PHA Phytohämagglutinin

RANTES Regulation and Activated Normal T-cell Expressed and Secreted SDS Sodiumlaurylsulfat

Tab. Tabelle

TARC Thymus and Activation-Regulated Chemokine TDI Toluendiisocyanat

Th T-Helferzelle TLR Toll-like receptor

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor α u.a. unter anderem

Pb Blei V Volt µmol Mikromol µl Mikroliter

1 Einleitung

Das Immunsystem ist ein komplexes, den gesamten Organismus durchziehendes Netzwerk mit der Aufgabe, Informationen über die Präsenz körpereigener, harmloser und pathogener Bestandteile zu sammeln, zu bewerten und darauf zu reagieren. Die Antwort besteht entweder in der Ausbildung einer Toleranz oder einer Immunität. Wichtige Komponenten dieses Systems sind immunkompetente Zellen, zu denen auch die dendritischen Zellen (DC) gehören. Sie sind leukozytären Ursprungs und stellen eine bedeutende Gruppe antigenpräsentierender Zellen dar (APC), die in der Lage sind, Antigene aufzunehmen und mit diesen in den regionalen Lymphknoten zu wandern, um dort durch Stimulation von T-Zellen eine Immunantwort zu initiieren.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Zellfunktionen von murinen DC durch Schwermetalle zu gewinnen. Als Substanzen kommen Blei, Mangan und in den Vorversuchen Zink, Kupfer und Cadmium zum Einsatz. In der Literatur gibt es lediglich Angaben zu dem Metall Nickel und seine Wirkung als Allergen bei der Kontaktdermatitis, sowie zu der Immunmodulation von Splenozyten, B-Zellen und Makrophagen durch Schwermetalle allgemein.

In vitro wird der Einfluss der Schwermetalle auf die unterschiedlichen Phasen der DC-Maturation untersucht. Im Mittelpunkt stehen zum einen das Auswanderverhalten stimulierter DC in einem Migrationsassay, sowie die Expression diverser Oberflächenmoleküle nach Schwermetallkontakt untersucht in der Durchflußzytometrie. Die T-Zellstimulation durch DC in der Mixed Leukocyte Reaction (MLR) ist ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit.

In zwei Kontaktallergiemodellen mit den Haptenen Toluen-2,4-diisocyanat (TDI) und 2,4-Dinitrochlorobenzol (DNCB) wird in vivo der immunmodulatorische Effekt von Bleiacetat getestet. Den Balb/c-Mäusen wird diese Substanz in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (230 und 2300 ppm) ad libitum über das Trinkwasser angeboten. Die Studien beziehen sich auf das Migrationsverhalten und die T-Zellstimulation der DC untersucht anhand der Ohrschwellung, der Anzahl ausgewanderter Zellen im regionalen Lymphknoten und deren Charakterisierung.

2 Literaturübersicht 2.1 Dendritische Zellen

Die dendritischen Zellen (DC) sind antigenpräsentierende Zellen und spielen eine wichtige Rolle in der Überwachung und Steuerung der Immunabwehr. Sie werden häufig als die „Wächter des Immunsystems“ bezeichnet, da sie auf der einen Seite das Immunsystem alarmieren und andererseits dessen Reaktionen kontrollieren. Somit spiegeln sie die Verbindung zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem wider (CAUX et al. 2000). Erstmals wurden die DC als solche von STEINMAN et al. (1973) beschrieben, die durch die eigenartige Zellmorphologie dieser Zellen auf sie aufmerksam wurden. Die DC erhielten ihren Namen aufgrund ihrer baumartig verzweigten Zytoplasmaausläufer (dendron, griech.:

der Baum). Abbildung 1 zeigt unterschiedliche Entwicklungsstadien der DC.

Abb.1 Unterschiedliche Reifestadien der aus dem Knochenmark einer Maus gewonnenen DC im Phasenkontrastmikroskop

In den frühen 90er Jahren begannen u.a. INABA et al. (1992) erstmals mit der Kultivierung von DC aus dem murinen Knochenmark. Hierbei konnte man drei unterschiedliche myeloide Zellarten gewinnen, die sich in Morphologie, Wachstumseigenschaften und Oberflächenstrukturen voneinander unterscheiden:

Neutrophile Granulozyten, Makrophagen und DC. Die Differenzierung dieser heterogenen Zellgruppe gelang zu dieser Zeit anhand ihrer charakteristischen Zellmorphologie und mit Hilfe monoklonaler Antikörper. INABA et al. (1992) schafften es, größere Mengen unreifer DC zu generieren, indem sie granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, ein Schlüsselzytokin für die DC-Reifung) hinzusetzten und die in großen Mengen vorkommenden, nicht adhärenten Granulozyten durch Waschvorgänge entfernten. Übrig blieben proliferierende Cluster bestehend aus DC, die sich locker mit darunterliegendem Stroma der Zellkultur verbanden. Es gelang, eine Zellpopulation von ca. 5x10⁶ Zellen/Maus nach acht bis zehn Tagen mit einer Reinheit von 70% zu kultivieren. Diese Methode zur Generierung von DC wurde einige Jahre später von LUTZ et al. (1999) modifiziert, indem die Dosis von GM-CSF reduziert, die Kultivierungsdauer um zwei Tage verlängert und eine geringere Zelldichte ausgesät wurde. Damit erreichte man eine Reinheit von 65-75% bei einer Zelldichte von 1-3x10⁸ DC/Maus nach 10-12 Tagen Kultivierung (siehe auch in dem Kapitel Versuchsübersicht, Generierung von DC).

Mittlerweile konnte man die gewonnenen Zellen mit der FACS-Analyse (siehe Material und Methoden) weiter differenzieren und sie anhand bestimmter Oberflächenmoleküle in immatur und maturiert unterteilen (siehe Tab.1).

Tab.1 Einteilung der DC nach den Cluster of Differentiation (CD) (JANEWAY und TRAVERS 1997)

CD31/34 MHCII CD11b CD11c CD14 CD25 CD40 CD68 CD80/86

Stammzelle + - - - - - -

Unreife DC - - + -/+ + - - + -

Reife DC - + - + - + + - +

(+ = CD exprimiert, - = CD nicht exprimiert)

Die CD-Moleküle (cluster of differentiation) sind zelltypische oder funktionell exprimierte Oberflächenmoleküle, die jeder einzelnen Zelle des Körpers eine Zugehörigkeit oder eine bestimmte Funktion zuweisen. Bei der DC spielen sie eine wichtige Rolle zur Unterscheidung ihrer Entwicklungsstadien.

Das Oberflächenmolekül CD11c ist zum Beispiel ein Oberflächenmolekül, das nur auf reifen DC zu finden ist. Es ist ein Integrin, also ein Zelloberflächenprotein, das in der Lage ist, die Adhäsion zwischen Zellen bei der Immunantwort oder im inflammatorischen Geschehen zu ermöglichen. Weitere wichtige CDs, die im Laufe der DC-Entwicklung eine Rolle spielen, sind die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, die bei der Interaktion der DC mit naiven T-Zellen für deren Aktivierung sorgen. In diesem Zusammenhang sei auch CD40 genannt, ein Oberflächenmolekül der DC, das ebenfalls bei der T-Zellaktivierung wichtige Funktionen hat und seinen Liganden CD40L auf den T-Zellen bindet (JANEWAY und TRAVERS 1997). Im Folgenden sollen die Entwicklung und unterschiedliche Funktionen der DC dargestellt werden.

2.1.1. Hämatopoese und Reifung der DC

Die DC entwickeln sich aus Vorläuferzellen, die wiederum von sich immer wieder erneuernden CD34+-Stammzellen aus dem Knochenmark abstammen. DC entwickeln sich sowohl aus der lymphoiden, als auch aus der myeloiden Linie und werden den Leukozyten zugeordnet (siehe Abb.2) (CAUX et al. 2000).

Abb.2 Schematische Darstellung der DC-Entwicklung (nach NAIRN 2004)

Die in dieser Arbeit nach LUTZ et al. (1999) generierten DC stellen eine von insgesamt vier DC-Subtypen dar (epitheliale, interstitielle, Monozyten-abgeleitete und

Neutrophile Granulozyten Makrophagen

Thrombozyten T-Zellen T-Helferzellen

Knochenmark- Stromazellen

Lymphoide Entwicklungslinie

Myeloide Entwicklungslinie

Myeloide Stammzellen

Erythrozyten

Basophile Granulozyten Mastzellen Eosinophile Granulozyten Lymphoide

Stammzellen

Stammzelle DC

CD34 +

Natürliche Killerzellen

plasmazytoide DC). Die DC unterscheiden sich sowohl morphologisch als auch funktionell voneinander. Allen gemeinsam sind die Phasen der Maturation, die sie während ihrer Funktion als antigenpräsentierende Zellen durchlaufen. Um sich den funktionellen Änderungen während der Reifung anpassen zu können, kommt es im Laufe der Reifung zur Veränderung des Phänotyps.

Im ersten Schritt werden proinflammatorische und/oder antivirale Zytokine von Vorläufer-DC im Knochenmark und in der Blutbahn ausgeschüttet. Die zweite Phase ist geprägt von unreifen DC in der Peripherie mit einer geringen Anzahl costimulatorischer Oberflächenmoleküle und einer Heraufregulation endozytotischer Rezeptoren zur Antigenaufnahme. Phase drei spiegelt reife DC wider, die durch inflammatorische Signale (wie z.B. TNF-α, IL-1β) oder LPS während einer Infektion oder Entzündung aktiviert werden, endozytotische Rezeptoren herunterzuregulieren und costimulatorische Oberflächenmoleküle sowie MHCII zu exprimieren. Im Anschluß werden in Phase vier naive T-Zellen stimuliert und folglich eine Immunantwort induziert (CAUX et al. 2000).

Nicht alle DC durchlaufen diese Phasen gleichermaßen. Man kann immature und semi-maturierte von maturierten DC unterscheiden. Die immaturen DC kommen im Gewebe vor und verharren solange in einem Steady-state-Zustand, bis sie durch Zytokine oder andere Warnsignale (z.B. TNF-α, LPS) aktiviert werden (McCOLL 2002). Es kommt daraufhin zur Reifung der DC (=maturierte DC) und durch die Stimulation naiver T-Zellen im regionalen Lymphknoten zur Immunreaktion des Organismus gegen das Fremdantigen, also die Bildung von T-Effektor- und Gedächtnis-Zellen. Die semi-maturierten DC, also DC, die nicht vollständig gereift sind, unterscheiden sich von reifen DC durch die fehlende Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine. Ihre Funktion besteht darin, Selbstantigen oder apoptotisches Zellmaterial zu den regionalen Lymphknoten zu transportieren und über dort ansässige T-Zellen eine Toleranz zu vermitteln (LUTZ und SCHULER 2002; STEINMAN 2003a).

2.1.2. Steuerung der DC-Funktion

Sämtliche Aktionen der DC können als eine Reaktion auf Chemokine gesehen werden. Chemokine sind Proteine von einer Größe von 6-14 kDa, die von Zellen sezerniert werden, um das Verhalten meist phagozytischer Zellen oder Lymphozyten hinsichtlich ihrer Wanderung und Aktivierung zu beeinflussen (JANEWAY und TRAVERS 1997).

Durch das Zusammenspiel der chemotaktischen Substanzen einerseits und der Expression spezifischer Rezeptoren auf Leukozytenoberflächen andererseits kommt es zur Migration der Entzündungszellen entlang eines chemotaktischen Gradienten auf einer somit festgelegten Route. In Tabelle 2 ist eine Übersicht über einige wichtige Chemokinrezeptoren sowie ihrer Liganden gegeben. Die für diese Arbeit relevanten Substanzen sind hervorgehoben.

Tab.2 Nomenklatur einiger Chemokine mit Hervorhebung der für diese Arbeit relevanten Substanzen (McCOLL 2002)

Rezeptor Ligand

systematischer Name Mensch Maus

CCR 2 CCL 2 MCP-1, MCAF JE

CCR 5 CCL 3 MIP-1α MIP-1α

CCR 5 CCL 4 MIP-1 β MIP-1 β

CCR 5 CCL 5 RANTES RANTES

CCR 7 CCL 19, CCL 21 MIP-3β, ELC MIP- 3β, ELC

Die Chemokine lassen sich funktionell in inflammatorische und homöostatische unterteilen: inflammatorische Chemokine, wie z.B. CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β und CCL5/RANTES, werden zur Rekrutierung immaturer DC und T-Zellen von DC in deren frühen Reifungsphase sezerniert.

Dieses geschieht im peripheren Gewebe nach Kontakt mit Pathogenen, um einen möglichst hohen Influx von Entzündungszellen zu erreichen. Homöostatische Chemokine (CCL19/MIP-3β, CCL22/MDC) werden vorrangig von reifen DC in den T- und B-Zell-Zonen sekundärer lymphoider Organe, wie z.B. Lymphknoten oder

Milz, gebildet. Sie sorgen für den Nachschub von DC aus der Peripherie und das Anlocken naiver T-Zellen, die wiederum mit dem Chemokinrezeptor 7 (CCR7) ausgestattet sind. Zuletzt gibt es auch solche Chemokine, die beiden Gruppen zugeordnet werden können und sowohl im peripheren Gewebe als auch in Lymphorganen anzutreffen sind (CCL17/TARC, CCL20/MIP-3α) (LEBRE et al. 2005).

DC gelten somit als große „Chemokinquellen“, wobei es vom Reifestadium der DC abhängt, welche Chemokine sie in der Lage sind zu sezernieren. In der frühen Reifungsphase werden inflammatorische, in der späteren Reifephase homöostatische Chemokine ausgeschüttet (siehe Abb.3).

Chemokine Chemokinrezeptoren Oberflächenmoleküle Abb.3 Schematische Darstellung des Zusammenhanges zwischen Chemokinen und

der DC-Reifung, in Anlehnung an LEBRE et al. (2005) und McCOLL (2002) maturierte

DC(mDC)

naive T- Zellen

Immature DC (iDC)

drainierendes Lymphgefäß

CCR7

CCR1/2/5/6 Ag

CCL19/

MIP-3β CCL2 /3/5

mDC

sekundäres Lymphorgan (Lymphknoten/Milz etc.) Blutgefäß

Immunantwort (Immunität, Toleranz)

MHCII CD40 CD80/86

2.1.3. Antigenaufnahme, -prozessierung und –präsentation durch DC Das Immunsystem ist ständig damit beschäftigt, Fremd- oder Selbstantigene im Organismus zu kontrollieren und zu erkennen. Im Bezug auf die DC gibt es vorwiegend zwei bisher bekannte Mechanismen, wie sie Antigene aufnehmen und den T-Zellen präsentieren können.

Die erste und auch zugleich schnellere Art ist die Aufnahme von Antigenen durch residente DC im Lymphknoten (innerhalb weniger Minuten). Dieser enthält ein dreidimensionales Netzwerk bestehend aus Retikulumzellen, deren Stabilität durch Retikulumfasern gewährleistet wird. In diesem Netzwerk befinden sich neben Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen immature DC, die mit der Basalmembran dieses „Conduit-Systems“ verbunden sind. Die Funktion des Netzwerkes ist die Verbindung afferenter Lymphgefäße mit den Venolen des Lymphknotens, damit kleine lösliche Substanzen (<70 kDa) direkt vom subcapsulären Sinus in die kleinen Venolen gelangen, ohne die B-/T-Zell-Zone zu durchlaufen. Dieses System ermöglicht es, dass z.B. Chemokine bei inflammatorischen Prozessen auf dem schnellsten Weg Leukozyten alarmieren können. Ein anderer Vorteil ist die direkte Aufnahme von löslichen Antigenen durch die residenten, immaturen DC, die darauf eine Reifung durchmachen und folglich in der Lage sind, Antigen über MHCII den T-Zellen zu präsentieren (SIXT et al. 2005).

Der zweite Mechanismus, der zwischen acht und zwölf Stunden in Anspruch nimmt, stellt die Aufnahme von Pathogenen durch DC z.B. in einem Entzündungsgeschehen dar. Immature DC besitzen durch ihre große Anzahl antigenbindender Rezeptoren (z.B. CD40, TLR, Fcγ-, Fcε- und Langerinrezeptoren) eine hohe Phagozytosekapazität (WALLET et al. 2005). Antigen wird von DC durch Endozytose aufgenommen und an MHCII gebunden. Einmal aktiviert, werden costimulatorische Moleküle (CD 40/54/80/86), sowie diverse Chemokinrezeptoren (CCR5/7) exprimiert, um es den nun reifenden DC zu ermöglichen, aus dem Entzündungsgebiet in den drainierenden Lymphknoten auszuwandern und die Antigene den T-Zellen zu präsentieren. Während dieses Prozesses wandern die DC ausgehend vom lymphatischen Gewebe entlang eines chemotaktischen Gradienten (MIP-3β, CCL19/21) (STEINMAN et al. 2003b). Im Lymphknoten kommt es zur

Interaktion zwischen DC und T-Zellen durch Oberflächenmoleküle, wie z.B. CD40 und dem Liganden CD40L, sowie durch CD80 und CD86 und dem Ligand CD28 auf den T-Zellen. Nachdem diese Rezeptoren gebunden haben, wird eine intrazelluläre Kaskade ausgelöst, unter anderem werden MAPKinasen wie p38 aktiviert. In Folge dessen kommt es zur Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine (IL-6, IFN-γ) und zur Aktivierung weiterer T-Zellen. Da immature DC in der Peripherie nicht ausschließlich Pathogene oder Fremd-Antigene phagozytieren, sondern auch körpereigene Substanzen, wie z.B. apoptotische Zellen, ist es wichtig, dass es nicht immer zu einer Immunreaktion über eine T-Zellaktivierung kommt. Da die DC in der Lage sind, Immunantworten zu steuern, kommt es z.B. nach Aufnahme von apoptotischen Zellen zu einer reduzierten Produktion von IL-12 und zu vermehrter IL-10-Ausschüttung, womit die Aktivierung der T-Zellen inhibiert und folglich eine Toleranz erreicht wird (WALLET et al. 2005).

Tab.3 Übersicht der DC und ihrer typischen Charakteristika zu bestimmten Entwicklungsstadien

DC- Entwicklungs-

Stadium

Stammzelle Vorläuferzelle

(myeloid/lymphoid) Immature DC Maturierte DC

Oberflächen-

Moleküle CD34+ CCR2

CCR1/2/5/6, MHCII, CD40, TLR,

Fcγ-, Fcε- und Langerinrezeptoren

CCR7 MHCII, CD40/80/86

CCL19/21, Langerinrezeptoren↓

Zytokin-/

Chemokinaus- schüttung

--- --- IL-8, CCL3/4/5 CCL17/18/19/22

Vorkommen Knochenmark Knochenmark, Blut

Gewebe,

Lymphknoten sek. lymphat.Organe Reaktion auf

Antigene ---- ---

Aufnahme, Expression über

MHCII

Ausbildung von Toleranz/Immunität

Interaktion T-

Zellen --- --- nicht möglich

Präsentation, Stimulation T-Zellen +

Toleranzinduktion CCL2

2.2 Schwermetalle

Die meisten bekannten Elemente auf der Welt zählen zu den Schwermetallen.

Insgesamt haben davon 30 toxikologische Bedeutung (RÖMPP 1996). In Abbildung 4 sind die für diese Arbeit relevanten Schwermetalle und ihre Stellung im Periodensystem dargestellt.

Hauptgruppen Ia-VIIIa

Ia IIIa IVa Va VIa VIIa VIIIa

H IIa He 1

Li Be Nebengruppen

B C N O F Ne 2

Na Mg IIIb IVb Vb VIb VIIb VIIIbVIIIbVIIIb Ib IIb Al Si P S Cl Ar 3

K Ca Sc Ti V Cr

Mn

Cu Zn

Rb Sr Y Zr Nb Mo Tc^* Ru Rh Pd Ag

Cd

Cs Ba ¹ Hf Ta W Re^* Os Ir Pt Au

Hg Tl

Pb

Fr^* Ra^{* 2} Rf^* Db^* Sg^* Bh^* Hn^* Mt^* Uun^* Uuu^* Uub^* Uut^*Uuq^* 115^* Uuh^* 117^* Uuo^* 7

1Lantanoide La Ce Pr Nd Pm^* Sm Eu Gd Tb Dy Ho Er Tm Yb Lu 6

2Actinoide Ac^* Th^* Pa^* U^* Np^* Pu^* Am^* Cm^* Bk^* Cf^* Es^* Fm^* Md^* No^* Lr^* 7

Abb.4 Stellung der Schwermetalle Blei (Pb), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Mangan (Mn) und Cadmium (Cd) im Periodensystem der Elemente

In der vorliegenden Arbeit wurden fünf Schwermetalle (Blei, Mangan, Kupfer, Zink und Cadmium) in den Konzentrationen 1, 10 und 100 µmol/l (bei Cadmium 0,1 anstatt 100 µmol/l) verwendet. Nachdem in Vorversuchen ersichtlich wurde, dass sie die dendritischen Zellfunktionen in ähnlicher Art und Weise beeinflussen, wurden die Hauptversuche repräsentativ mit Blei und Mangan in den Konzentrationen 1,10 und 100 µmol/l durchgeführt. Mangan ist als Vertreter einer Substanz ausgewählt

worden, die in geringer Dosis essentiell ist; Blei hingegen als ein Metall, das gerade im chronischen Geschehen toxische Auswirkungen hat.

2.2.1. Definition

Zu den Schwermetallen zählen alle natürlichen metallischen Elemente einer Dichte > 5 g/cm³. Die Gruppe der Schwermetalle umfasst viele Elemente, u.a.

Quecksilber, Blei, Kadmium, Kupfer, Arsen, Nickel, Zink, Kobalt und Mangan.

Abzugrenzen von den Schwermetallen sind die Leichtmetalle, also Metalle, deren Reingewicht < 5 g/cm³ ist (z.B. Natrium, Calcium, Magnesium, Aluminium) (RÖMPP 1996).

Man unterscheidet lebensnotwendige (essentielle) Schwermetalle (z.B. Zink, Eisen, Mangan, Kupfer), die für uns Menschen als Spurenelemente in der Ernährung wichtig sind, von giftigen (z.B. Cadmium, Quecksilber, Blei). Schwermetalle sind natürliche Bestandteile der Erdkruste. Sie werden durch Verarbeitung oder Nutzung durch den Menschen als Emissionen, flüssiger oder fester Abfall (Klärschlamm) und mit Agrochemikalien der Umwelt zugeführt (Bioakkumulation), wodurch sie in die Nahrungskette gelangen. Beispiele für Schwermetallquellen aus der Industrie ist die Kunststoffverarbeitung (z.B. Cadmium), die Metallveredelung (z.B. Chrom, Cadmium) oder der Einsatz von Schwermetallen als Katalysatoren (z.B. Nickel).

Schwermetalle werden z.B. von Pflanzen aus dem Boden aufgenommen, gelangen über die Nahrungskette direkt oder über Tiere zum Menschen und schließlich wieder in den Boden. Eine Reihe von Schwermetallen reichern sich an Stellen dieses Kreislaufes an und führen ab einer bestimmten Konzentration zur Kontamination von Boden und Vergiftung von Pflanze, Tier oder Mensch (MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.2.2. Vorkommen

Die Quellen für die erhöhte atmosphärische Belastung mit Metallen sind u.a. in der Verbrennung fossiler Brennstoffe, wie Kohle und Erdöl zu suchen. Diese Brennstoffe enthalten als Bestandteile der mineralischen Verunreinigungen auch Metalle. So wird ein großer Teil der Arsen-, Kupfer- und Quecksilberemissionen beim

Abbrand von Kohle freigesetzt. Eine andere wichtige Quelle für atmosphärische Emissionen stellen zum einen Herstellungsprozesse, Verhüttung und Gewinnung von Erzen in Eisenschmelzöfen, sowie in Zinkhütten dar. Zum anderen entstehen Stäube durch die Verbrennung von kommunalen Müllabfällen, was besonders bei der Belastung durch Quecksilber eine große Rolle spielt. Letztlich entsteht eine hohe Belastung durch Gehalte von Batterien in städtischen Abfällen, die am Ende zu quecksilberhaltigen Klärschlamm und, bei dessen Verbrennung, zu belastete Staub führen. Da die Substanzen Mn(CO)3 und MMT (Methylcyclopentadienyl-Mn- Tricarbonyl) das Tetraethylblei als Antiklopfmittel im Benzin ersetzt haben, könnten auch diese in naher Zukunft toxikologisch relevant werden. Aus der Atmosphäre gelangen die Metalle direkt oder auf dem Umweg über Lebensmittel und Wasser in den Organismus, wo sie infolge zum Teil langfristiger Speicherung chronische Schäden hervorrufen können (MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.2.3. Toxikologie

Metalle haben von Alters her eine große toxikologische Bedeutung. Der Gebrauch von Blei z.B. geht etwa auf die Zeit 2000 v. Chr. zurück. Hippokrates hat schon 370 v. Chr. Symptome bei Erzarbeitern beschrieben, die einer Darmkolik entsprechen und vermutlich auf eine Bleivergiftung zurückgingen. Auch Arsen und Quecksilber sind im Altertum verwendet worden. In der Medizin waren ehemals Verbindungen des Arsens, Antimons und Quecksilber in Gebrauch. Metalle haben weiterhin große arbeitsmedizinische Bedeutung. Neuerdings findet der umwelttoxikologische Aspekt der Metalltoxikologie besondere Aufmerksamkeit, wobei Blei, Quecksilber und Cadmium im Vordergrund des Interesses stehen.

Die allgemeinen Wirkungen der Metalltoxizität sind abhängig von der Verteilung im Organismus und spiegeln sich unterschiedlich wider. Je nach Schwermetall kommt es zur Anreicherung in einem oder mehreren Organen mit Störungen der Organfunktionen bzw. einzelner Zellstoffwechselvorgänge.

Beispiele hierfür sind im Folgenden aufgeführt:

- Ätzwirkung (z.B. Hg²⁺ ) - Neurotoxizität (z.B. Pb²⁺ ) - Nierentoxizität (z.B. Hg²⁺ ) - Kanzerogenität (z.B. As³⁺ )

- Verdrängung essentieller, regulatorisch wirksamer Metallionen, wie z.B. Ca²⁺, Mg²⁺ und Zn²⁺ aus ihren Komplexen

- Fe, Cr, Cu, V katalysieren durch Redoxzyklen die Bildung von ROS (Superoxidanionradikal und Hydroxylradikal)

- Cd, Hg, Ni, Pb vermindern Glutathion und Protein-SH mit der Folge der ROS-Bildung

- Störung von Signalwegen und Hemmung der DNA-Reparatur (AKTORIES et al. 2004; MARQUARDT und SCHÄFER 2004)

Viele Metallionen können mit SH-Gruppen schwer lösliche Verbindungen eingehen. Darüber hinaus können sie mit sauerstoff- oder stickstoffhaltigen Gruppen in verschiedenen Molekülen Komplex-Verbindungen bilden (Chelate). Auf derartige Komplex-Bindungen beruhen viele physiologische Funktionen essentieller Metalle (Beispiel: Eisen im Hämoglobin); prinzipiell analog dürften auch die toxischen Metalle wirken, wobei essentielle Metalle aus ihrer Komplex-Bindung verdrängt werden oder neue Komplexe entstehen können. Trotz dieser grundsätzlichen Gemeinsamkeiten im Wirkungsmechanismus sind die von den einzelnen Metallen ausgelösten Vergiftungsbilder sehr unterschiedlich und weitgehend spezifisch für das jeweilige Agens (MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.3 Blei

Blei (lat. plumbum) ist ein Element, das seinen Namen aus dem Indoeuropäischen hat und soviel wie schimmernd, leuchtend oder glänzend bedeutet. Im Periodensystem hat Blei das Symbol Pb, besitzt die Ordnungszahl 82 und befindet sich in der Hauptgruppe IVa mit der Periodenzahl 6. Die Dichte beträgt 11,34 g/cm³. Der Schmelzpunkt liegt bei 327,5 °C, der Siedepunkt bei 1750 °C. Pb 208 ist mit 52,4 % das häufigste stabile Blei-Isotop in der Natur, gefolgt von Pb 204 (24,1 %) und Pb 207 (22,1 %). Auf der Liste der Elementhäufigkeiten in der Erdhülle nimmt Blei Platz 35 ein (RÖMPP 1996).

2.3.1. Vorkommen

Blei kommt in der Natur meist in Form von PbS (Bleiglanz) vor. Im industriellen Bereich findet man es als PbO oder Pb3O4 (Mennige) in Bleifarben, sowie als Oberflächenschutz in älteren Wasserrohren. Durch industrielle Emissionen gelangt es in die Natur und ist dadurch in geringen Konzentrationen in Pflanze und Tier nachweisbar. In der Medizin kommt Blei als Burow´sche Mischung vor, welche aus Bleiacetat, Alaun und Wasser hergestellt wird und der Behandlung von Phlegmonen, Wunden und Hautentzündung diente (HAPKE 1988).

2.3.2. Toxikokinetik

Organische Bleiverbindungen, wie z.B. Bleitetraäthyl oder Bleitetramethyl, werden im Gegensatz zu anorganischen Bleiverbindungen wegen ihrer hohen Lipidlöslichkeit fast vollständig enteral resorbiert. Im Blut binden sie an Erythrozyten und Albumine und stören infolgedessen deren Funktionen.

Bei der Inhalation wird je nach Partikelgröße und Löslichkeit 50-80% des Bleis aus der Luft resorbiert und wiederum im Blut gebunden.

Die Hauptmengen (95%) des Bleis werden bei konstanten Bleiblutwerten (> 0,5 mg/L Blut) im Knochen als Bleiphosphat (Pb3(PO4)2) gebunden und insbesondere in den Verkalkungszonen gespeichert. Es wird mit einer Halbwertzeit

von ca. 30 Jahren wieder freigesetzt, jedoch kann dieser Vorgang bei Fieber oder Streßreaktionen beschleunigt werden und zu einer erneuten Intoxikation führen (sog.

Bleikrise). Auch Zähne und Haare speichern Blei und können retrospektiv zur Feststellung einer Bleibelastung herangezogen werden. Unter Normalbedingungen besteht zwischen täglicher Aufnahme und Ausscheidung ein Gleichgewicht. Die Elimination von Blei erfolgt über die Nieren und mit dem Kot. Zur Übersicht siehe Abbildung 5 (HAPKE 1988).

Abb. 5 Verteilung und Ausscheidung von Blei (in %) im Organismus (HAPKE, 1988)

2.3.3. Toxikologie

Zufuhr größerer Bleimengen kann zu akuten Vergiftungen (Saturnismus) führen. Blei wirkt im akuten Geschehen wenig toxisch, doch kann es zu chronischen Vergiftungen durch die Aufnahme kleiner Mengen über einen längeren Zeitraum kommen. Die Halbwertzeit von Blei im Weichgewebe beträgt ca. 20 Tage, im Knochen hingegen 5-30 Jahre. Typische Krankheitsbilder einer chronischen

5 %

Nahrung 98 %

Inhalation 2 %

Leber

95 %

Nieren

4 % BLEI

andere Gewebe

1 %

Knochen 95 %

Kopfschmerzen, Müdigkeit, Abmagerung und Defekte der Blutbildung und des Nervensystems. Schwerere Symptome treten beim Erwachsenen bei einer Überschreitung des normalen Blutbleispiegel um etwa das 10-fache auf, jedoch sind erste Anzeichen, denen noch kein wesentlicher Krankheitswert zugeordnet werden kann, bereits bei geringfügiger Erhöhung der Werte zu verzeichnen. Der Provisional Tolerable Weekly Intake (PTWI) für Blei beim Menschen liegt bei 25 µg Pb/kg KM.

Erste Symptome einer Bleiintoxikation beim Menschen erscheinen bei Blutbleigehalten von >15 µg/100ml Vollblut, chronische Enzephalopathien treten bei Konzentrationen ab einem Bleigehalt von 50 µg/100ml im Blut auf.

Blei ist wahrscheinlich der Umweltschadstoff, bei dem der geringste Sicherheitsabstand zwischen der derzeitigen Belastung der Bevölkerung und krankmachenden Intoxikationen besteht (AKTORIES et al. 2004; MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.4 Mangan

Mangan (Mn) ist ein silbrig-metallisches Element und steht in der Elementhäufigkeit an 14. Stelle, womit es zu den relativ häufigen Elementen in der Erdkruste gehört. Es tritt in der Natur nicht elementar auf, kommt aber in zahlreichen Erzen in chemisch gebundener Form vor. Das wichtigste Manganerz ist der Pyrolusit (Mangandioxid, MnO2). Mangan hat die Ordnungszahl 25, der Schmelzpunkt liegt bei 1244 °C, der Siedepunkt bei 1962 °C und die Dichte beträgt 7,47 g/cm³ (RÖMPP 1996).

2.4.1.Vorkommen

In der Natur kommt Mangan häufig in Verbindung mit Eisen in dessen Erzen vor. Industriell spielt Mangan eine Rolle bei der Herstellung von Stahl, Metall, Gläsern, Keramik und bei der Produktion von Ferrolegierungen. Es wird außerdem als Düngemittel eingesetzt und gelangt dadurch in die Natur.

2.4.2. Toxikokinetik

Gebundenes Mangan ist ein essentielles Spurenelement für alle Lebensformen. Es aktiviert Enzyme und steigert die Verwertung des Vitamin B1, außerdem ist es wichtig für die Insulinproduktion der Bauchspeicheldrüse. Der menschliche Körper enthält etwa 10- 40 mg Mangan, der größte Anteil (ca. 40%) befindet sich im Knochen. Täglich sollten ungefähr 4 mg aufgenommen werden.

Manganreich sind Nüsse, Vollkornprodukte, Keimlinge, Erdbeeren und Kakao. Milch, Mineralwässer, und manche Trinkwässer hingegen sind manganarm (MARQUARDT und SCHÄFER 2004). Nachdem Mangan resorbiert wurde, wird es in der Leber und in den Nieren gespeichert. Die Ausscheidung erfolgt biliär, über den Harn werden nur Mengen um die 0,01 mg/L ausgeschieden (HAPKE 1988).

2.4.3. Toxikologie

Neben Eisen, Kobalt, Kupfer, Zink, Selen, Molybdän und Jod handelt es sich bei Mangan um ein essentielles Spurenelement. Diese Bezeichnung trifft auf solche Substanzen zu, die in allen Geweben regelmäßig nachweisbar sind, zu Mangelerscheinungen nach Entzug führen und gleichzeitig biochemische Defekte auf molekularer Ebene verursachen können. In Tierversuchen wirkt Mangan in hohen Dosen verabreicht kanzerogen. Hierbei wird ein für die Kanzerogenese allgemeingültiger Mechanismus bei Metallen angenommen: durch die Metalle werden in Säugerzellen reaktive Sauerstoffe gebildet, die diverse DNA- Veränderungen zur Folge haben (Strangbrüche, oxidierte Basen). Zusätzlich sind Metalle in der Lage, durch Inhibition detoxifizierender Enzyme die Abwehrmechanismen der Zelle gegen oxidativen Streß zu schwächen, sowie die DNA-Reparaturen durch die Hemmung der dafür zuständigen Enzyme zu stören.

Mangan hat im katalytischen Zentrum einiger Enzyme, wie z.B. Peptidasen, wichtige Funktionen (AKTORIES et al. 2004).

Toxikologische Bedeutung erlangt Mangan im Bergbau oder bei der Produktion von Batterien oder Legierungen. Dieses kann zu einer erhöhten Aufnahme und zu unterschiedlichen Folgeerscheinungen führen. So kann es bei

Exposition über Monate oder Jahre zu einem „Manganismus“, einer parkinsonähnlichen Erkrankung kommen. Diese chronische Intoxikation führt zu einer zentralen Zerstörung von Neuronen. Hierbei kommt es durch Entstehung von freien Radikalen zu einer oxidativen Schädigung, die mit motorischen Störungen wie Ataxie, Rigidität und feinem Tremor einhergehen (AKTORIES et al. 2004). Dieses Krankheitsbild wird auch als „Mangan-Wahnsinn“ bezeichnet. Eine andere Erkrankung, die häufig bei Arbeitern im Erzbergbau auftrat, ist die

„Manganpneumonie“. Sie ist charakterisiert durch hohes Fieber und kann im schlimmsten Fall auch tödlich enden. Eher selten kommt es zur akuten Intoxikation durch Mangan. Beschrieben ist die Vergiftung durch das Verschlucken von Kaliumpermanganat, das auch als Desinfektionsmittel Verwendung findet. Es kommt zu schweren Verätzungen und einer Gastroenteritis; die letale Dosis von KMnO4

beträgt 5-8 g für den Menschen. Die empfohlene maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK) für Mangan liegt bei 0,5 mg/m³ (MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.5 Schwermetalle und ihr Einfluss auf Immunreaktionen

In der Literatur wird bei Untersuchungen mit Schwermetallen die Unterscheidung zwischen Irritantien und Allergenen getroffen (AIBA 1998). Hierbei werden solche Substanzen als Irritantien bezeichnet, die lediglich zu einem inflammatorischen Geschehen führen. Allergene, auch in Form von Haptenen, führen dagegen zu einer Sensibilisierung und bei erneutem Kontakt mit der gleichen Substanz zu einer Überempfindlichkeitsreaktion z.B. in Form einer Kontaktdermatitis (DE SMEDT et al. 2001).

Die in dieser Arbeit zusammen mit Bleiacetat zur Anwendung gekommenen In-vivo-Untersuchungen mit TDI und DNCB stellen eine Art dieser Kontaktallergien dar und sollen daher im Anschluß erläutert werden. Es wird hierbei zwischen der Induktion einer Th1- und einer Th2-Antwort als Reaktion der unterschiedlichen Allergene unterschieden.

2.5.1. Allergische Kontaktdermatitis

Es handelt sich hierbei um eine inflammatorische Hauterkrankung, die als Konsequenz einer gesteigerten Allergenexposition auftritt und durch das Zusammenwirken von DC, T-Zellen und Zytokinen vermittelt wird (NASORRI et al.

2002). Die Kontaktdermatitis tritt als Allergie vom Typ I (Soforttyp/ Anaphylaxie) und Typ IV (zellvermittelter/ verzögerter Typ) auf.

Der Typ I ist charakterisiert durch eine Ig-E-vermittelte Reaktion auf das lösliche Allergen innerhalb von 15 Minuten. Hierbei werden inflammatorische Zytokine (z.B. Leukotrien C4) und Histamin aus in der Sensibilisierungsphase stimulierten Mastzellen und basophilen Granulozyten freigesetzt; dies führt zu einer Vasodilatation und zur Kontraktion glatter Muskulatur. Die Symptome zeigen sich lokal als Urtikaria, Ekzem, Asthma oder systemisch als Anaphylaxie (MARQUARDT und SCHÄFER 2004). Als Typ IV wird dagegen jene Hypersensitivität bezeichnet, die nach Allergenkontakt verzögert auftritt.

Man unterteilt eine Allergie in die Sensibilisierungs- und die Auslösephase. In der Sensibilisierungsphase werden naive T-Zellen aktiviert und differenzieren zu

T-Gedächtnis-Zellen aus. In der anschließenden Auslösephase werden die ausdifferenzierten T-Gedächtniszellen lokal aktiviert und zu T-Effektorzellen umgewandelt; außerdem kommt es zur Ausschüttung diverser Zytokine und Chemokine.

Sensibilisierungsphase: Haptene, die aufgrund ihrer geringen Größe nicht vom Immunsystem erkannt werden, binden an lösliche oder zellständige Proteine und bilden somit einen Antigen-Komplex. Ausgehend von der Haut werden Haptene von ansässigen dendritischen Zellen, den Langerhanszellen (LC), aufgenommen und durch gleichzeitige Interaktion mit Keratinozyten via afferenter Lymphbahnen zum regionalen Lympknoten transportiert. Die DC durchlaufen während dieser Wanderung eine Reifung und sind nach der Antigenaufnahme in der Lage, ihr Antigen naiven T-Zellen im Lymphknoten zu präsentieren. BECKER und KNOP (1992) konnten bei humanen DC in diesem Zusammenhang die Aktivierung intrazellulärer MAPKinasen (ERK1/2) durch Kontaktallergene (nicht aber durch Irritantien) nachweisen.

Im regionalen Lymphknoten werden die T-Zellen durch zwei voneinander abhängige Signale aktiviert: zum einen werden entweder MHCI- oder MHCII- Moleküle exprimiert. Zum anderen muß es zur Expression costimulatorischer Moleküle wie B7.1, B7.2 (=CD 80/86) und ICAM 1 kommen. Nur beide Signale zusammen führen zu einer durch aktivierte T-Zellen resultierenden klonalen Expansion von T-Gedächtnis-Zellen. Der letzte Schritt der Sensibilisierungsphase besteht in dem Auswandern der T-Gedächtniszellen, was durch bestimmte exprimierte Oberflächen- und Adhäsionsmoleküle, sowie Chemokinrezeptoren ermöglicht wird.

Auslösephase (Challenge): Bei sekundärem Antigenkontakt wird die Auslösephase eingeleitet. Hier wird zwischen einer Antigen-unspezifischen und einer Antigen-spezifischen Phase unterschieden. In ersterer kommt es zur Freisetzung entzündlicher Mediatoren durch Keratinozyten. Mastzellen werden aktiviert, Chemokine und andere Entzündungsmediatoren freigesetzt. Daraufhin kommt es zur Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten, Makrophagen und den dendritischen Zellen. Während die erste Phase anläuft, kommt es zur Aktivierung

haptenspezifischer T-Gedächtniszellen, die sich in T-Effektorzellen umwandeln, Mediatoren (z.B. IFN-γ) freisetzen und zytotoxisch wirken (RIEMANN et al. 2003).

Durch eine erhöhte Gefäßpermeabilität und Plasmaexsudation kommt es zur Entstehung typischer Symptome der Kontaktdermatitis (Erythem, Ödem, Vesikulation), deren vollständige Ausbildung bis zu 72 Stunden dauern kann. Aus diesem Grund wird sie als verzögerter Typ bezeichnet (MARQUARDT und SCHÄFER 2004).

2.5.2. TDI-Kontaktallergie-Modell

TDI (Toluen-2,4-diisocyanat) ist ein niedermolekulares Antigen, das im Tiermodell eine Hypersensitivitätsreaktion vom Soforttyp und vom verzögerten Typ auslöst. FUCHIBE et al. (2003) haben in einer Studie an haarlosen Mäusen mit TDI eine Sensibilisierung durch epicutane Applikation von 1% TDI erzeugen können.

Den Tieren wurde TDI über fünf Tage auf die Bauchhaut gegeben, die Challenge erfolgte durch wiederholte Gabe von 0,1% TDI auf die zervikodorsale Haut alle zehn Tage. Nach der sechsten Challenge zeigte sich eine Allergie vom verzögerten Typ.

0,1% TDI allein hatte keinen Effekt bei nicht sensibilisierten Mäusen, von daher wurde eine Aktivierung von T-Gedächtniszellen beim Zweitkontakt in der Challenge angenommen. TOMINAGA et al. (1985) haben in einem anderen Versuchsansatz TDI auf die Ohrhaut von sensibilisierten Mäusen aufgetragen und nach 20 Stunden eine Ohrschwellung feststellen können. Zusätzlich kam es hier bei wiederholter TDI- Verabreichung neben der Allergie vom verzögerten Typ auch zu einer Sofortreaktion in Form von einer Ohrschwellung, begleitet von einem Anstieg von TDI-spezifischen IgE im Serum. Dieses galt als Zeichen einer gleichzeitig stattfindenden zellulären und humoralen Immunausbildung (FUCHIBE et al. 2003). Dass TDI primär zu einer Th2- induzierten Immunantwort führt, zeigten DEARMAN et al. (1996) anhand von Messungen erhöhter IgE-Spiegel im Blut und erhöhter IL-4- und IL-10-Produktion durch Lymphknotenzellen von TDI-sensibilisierten Mäusen. In Arbeiten von BÄUMER et al. (2004, 2005) ist das TDI-Modell, zum Teil auch zusammen mit dem DNCB- Modell (siehe dort), zum Einsatz gekommen. Hierbei wurde der Effekt von TDI

entzündlichen Ohrschwellung, durch das Allergen gezeigt. Weiterhin ist in einem Local-Lymphnode-Assay (LLNA) der Einfluss von TDI auf die lokalen Lnn.

auriculares untersucht worden. Es zeigte sich eine gesteigerte Interaktion mit naiven T-Zellen in den lokalen Lymphknoten, sowie eine erhöhte Migrationsbereitschaft stimulierter DC. Diese Eigenschaft konnte ebenfalls in einem Skinmigrationsassay gezeigt werden, in dem die Anzahl ausgewanderter DC aus TDI-sensibilisierten Ohren bestimmt wurde (BÄUMER et al. 2005).

2.5.3. DNCB-Kontaktallergie-Modell

Dieses Allergiemodell ist in etwa vergleichbar mit dem TDI-Modell. Es kommt allerdings, so HOPKINS et al. (2004), durch die Applikation von DNCB (2,4- Dinitrochlorobenzol) zu einer Th1-Antwort des Immunsystems mit dazugehörigem Zytokinmuster. Sie untersuchten an Balb/c-Mäusen die unterschiedlichen Reaktionen auf die Haptene DNCB, Dinitrofluorobenzen (DNFB), Fluorescein-isothiocyanat (FITC), TMA und Dinitrofluorobenzen-sulfonylchlorid (DNBSCl) und stellten dar, dass DNCB ebenso wie DNFB ein Zytokinmuster einer Th1-Antwort bestehend aus hohen Mengen IFN-γ hervorriefen. TMA, FITC oder DNBSCl hingegen induzierten eine Th2- Induktion. DEARMAN et al. (2002) zeigten vergleichend in einer Studie mit Balb/c- Mäusen und Ratten die Reaktion auf das Hapten DNCB in Form einer Th1-Induktion.

Sie verglichen außerdem die Zytokine, die nach DNCB-Kontakt produziert wurden, mit denen aus der Reaktion auf TMA. TMA führt auch hier zu einer Th2-Antwort mit der Induktion der Zytokine IL-10 und IL-13. Bei der Th1-Antwort durch DNCB werden die Zytokine IFN- γ und IL-12 produziert. In einer Untersuchung von BÄUMER et al.

(2004) sind in TDI- und DNCB-Modellen die Effekte von RANTES und TARC untersucht worden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine wiederholte Gabe von TDI und DNCB zu einem Anstieg der Ohrschwellung 6 und 24 Stunden nach Applikation führt. Hervorgehoben wird der unterschiedliche Effekt der Allergene auf die T-Zellpolarisierung, wobei TDI auch hier im Hautgewebe zu einer Th2- und DNCB zu einer Th1-Antwort mit dem dazugehörigen Zytokinmuster führen (BÄUMER et al. 2004).

2.5.4. Th1-/Th2-Antwort

Bei der Immunantwort kommt es je nach Antigenkontakt zur Proliferation unterschiedlicher Subtypen von T-Zellen, entweder den Th1- oder den Th2- Lymphozyten. Dieses ist abhängig von den an der Immunantwort beteiligten Zellen.

Wird ein Hapten über MHCI-Moleküle naiven CD8+-T-Zellen präsentiert, kommt es zur Induktion einer Th1-Antwort, wobei IL-12 produziert von den DC als eines der wichtigen Zytokine fungiert (CARTER und DUTON 1996). Eine Th2- und zugleich humorale Antwort wird eingeleitet, wenn ein Hapten an MHCII gebunden exprimiert wird und durch IL-4, Histamin und PGE2 CD4+-T-Zellen stimuliert werden (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000). Beispiele für die unterschiedliche T-Zell- Polarisierung sind zum einen DNCB und DNFB für Th1, TMA und TDI für Th2 (KRASTEVA et al. 1999; DEARMAN et al. 1996,2005; BÄUMER et al. 2004,2005).

LANGENKAMP et al. (2000) beschreiben die Differenzierung der T-Zellen folgendermaßen: DC sind in der Lage, T-Gedächtniszellen in der Challengephase in eine bestimmte Richtung zu polarisieren. Eine hohe Antigen-Dosis und große Mengen an IL-12 von aktivierten DC führen zu einer Th1-Antwort (bei Infektionen mit Bakterien, Viren, aber nicht durch Parasiten), wohingegen gleiche DC zu einem späteren Zeitpunkt durch eine geringere Menge an Antigenen im Lymphknoten nur eine Th2-Antwort einleiten oder T-Zellen gar nicht erst polarisiert werden und den Pool an Gedächtniszellen auffüllen.

Nicht nur die Art des Antigens, sondern auch die Dauer der Antigenbindung mit T-Zellen hat Einfluss auf die T-Zellpolarisierung. Kommt es nur zu einem kurzen Kontakt, führt dies zum Zelltod. Eine längere Bindung zwischen T-Zelle und DC und somit auch eine stärkere Sekretion von Zytokinen hat eine Differenzierung der T-Zellen in nichtpolarisierte-T-Zellen, die später immer noch aktiviert werden können, oder in Gedächtnis- und den daraus sich später entwickelnden Effektorzellen zur Folge. Eigenart der Effektorzellen ist, dass sie die Expression von CCR7 zugunsten von Rezeptoren für inflammatorische Chemokine reduzieren, da sie aus dem Lymphknoten in das periphere Gewebe wandern (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000).

Die Differenzierung der T-Zellen ist also kein festgelegter Ablauf, sondern eher ein stochastischer Prozess, indem es bei Kontakt mit Allergenen, Haptenen,

Bakterien, Viren, LPS oder nekrotischem Material zur Ausbildung von Th1-Lymphozyten kommt. Ausschlaggebend hierfür ist die Produktion von IL-12 (und

IL-18, IFN-γ) durch DC (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000). Dieser Zusammenhang ist schematisch in Abbildung 6 dargestellt.

Abb.6 Darstellung der Interaktion von DC und T-Zellen im drainierenden Lymph- knoten einschließlich der möglichen Immunantworten (nach SHORTMAN und LIU 2002)

Kein IL-12 und/oder IL-10

ruhige DC

Danger Signal 2 Danger Signal 1 IL-12

Fremd-Antigen aktivierte DC

Th1

Drainierender Lymphknoten Gewebe

CD4 (TH)

Anergie, Apoptose oder regulatorische T-Zelle

CD8

Anergie,Apoptose

Th2

Zellvermittelte Immunantwort IFN-γ

Humorale Immunantwort IL-4/-5/-13

MHC I Toleranz MHC II Selbst-Peptid Kein Danger-Signal

Danger-Signal (TNF-α, IL-1β)

2.5.5. In-vitro-Untersuchungen zur Beeinflussung der DC-Maturation und Immunreaktionen durch Schwermetalle

Im Mittelpunkt diverser In-vitro-Untersuchungen stehen der Maturationsprozeß der DC und dessen Beeinflussung durch Kontaktallergene, Irritantien oder Schwer- metalle. Nach Applikation von Kontaktallergenen kommt es zu einem Anstieg von TNF-α und IL-1β und einer erhöhten Expression von MHCII bei humanen DC (RYAN et al. 2005; ENK und KATZ 1992). Schwermetalle induzieren die Maturation von DC auf unterschiedliche Art und Weise. Nickel und Kobalt induzieren, wie auch LPS, die Formation reaktiver Sauerstoffradikale und stimulieren dadurch NF-κB, was zur Reifung der DC beiträgt (MANOME et al. 1999). CD40 gilt zusammen mit IL-12 als Aktivierungsmarker der DC. Durch die Bindung an CD40 wird eine intrazelluläre Kaskade ausgelöst und folglich IL-12 und IL-6, wichtige Zytokine für die T-Zell- interaktion, sezerniert. Nickel führt zu einer starken Erhöhung der beiden (VITAL et al. 2004).

Ausgereifte DC werden anhand ihrer exprimierten Oberflächenmoleküle, wie z.B. CD40, CD54, CD80, CD86, MHCII, charakterisiert. Ist die Reifung der DC

abgeschlossen, verlieren diese die Fähigkeit der Antigenaufnahme und -prozessierung, können aber stattdessen aufgenommenes Antigen naiven T-Zellen

präsentieren. In einem Vergleich zwischen dem Einfluss von Haptenen, Bakterienprodukten und Zytokinen auf DC, in diesem Fall auf Langerhans-Zellen (LC), beschreiben AIBA et al. (2000) die zweiphasige Reifung der DC durch diese Stimuli. Da es schwierig ist, LC zu kultivieren, haben AIBA et al. (1997) in Anlehnung an SALLUSTO und LANZAVECCHIA (1994) DC aus humanen Blutmonozyten kultiviert und daran die Effekte unterschiedlicher Schwermetalle untersucht. Ein Teil ihrer Untersuchungen bezieht sich auf die Expression costimulatorischer Moleküle nach Inkubation mit Nickel, Mangan, Kobalt, Kupfer, TNCB und DNCB, sowie den Irritantien Zink, SLS (Sodiumlaurylsulfat) und BC (Benzalkoniumchlorid). Nach Inkubation der DC über zwei Tage mit den Substanzen sind anschließend die Expression der Oberflächenmoleküle mit Hilfe der Durchflußzytometrie ermittelt

worden. Nickel und DNCB führen zu einer signifikant gesteigerten Expression von CD54, CD86 und HLA-DR. Im Zusammenhang mit dieser Phänotypveränderung der DC ist eine gesteigerte Produktion der Zytokine IL-1β und TNF-α festzustellen. Auch die Stimulation von T-Zellen ist durch Nickel und DNCB im Vergleich zu Zink, SLS und BC gesteigert (AIBA 1998). Im Vergleich der Substanzen Nickelund DNCB wird ein Unterschied in dem Mechanismus der DC-Aktivierung festgestellt. DNCB stimuliert DC, die daraufhin IL-1β oder TNF-α sezernieren, was wiederum die CD86- Expression induziert. Nickel hingegen kann die CD86-Expression direkt induzieren.

Die zytotoxische Dosis für DC liegt bei DNCB bei über 100 µmol/l. Nickel und Mangan haben erst ab einer Konzentration von 1000 µmol/l zytotoxische Effekte (AIBA und TAGAMI 1999).

AIBA et al. (2000) zeigen neben der Expression costimulatorischer Moleküle als Zeichen der DC-Reifung ebenfalls die gesteigerte Fähigkeit maturierter DC, auf chemotaktische Reize wie MIP-3β zu reagieren. DC, die mit Nickel in Kontakt gekommen sind, exprimieren infolgedessen eine erhöhte Anzahl an CCR7, dem Rezeptor, der es den DC ermöglicht, in die Peripherie auszuwandern. Nickel (100- 300 µmol/l) und SDS (0,1%) induzieren ebenfalls die Expression von CCR7 bei humanen CD34+ - DC (DE SMEDT et al. 2001). Zusätzlich kommt es zu einer gesteigerten Produktion von IL-12, der Gehalt an IL-1β bleibt unverändert. Die T-Zellstimulation in der allogenen Mixed Leucocyte Reaction (MLR) wird durch beide Substanzen induziert.

ZELIKOFF und THOMAS (1998) untersuchten den Einfluss unterschiedlicher, umweltrelevanter Schwermetalle auf Immunzellen in vitro und in vivo. Th1-Zellen werden durch Blei (10 µmol/l PbCl2) inhibiert, B-Lymphozyten werden dagegen stimuliert. In der Durchflußzytometrie wird eine erhöhte Expression der MHCII- Moleküle auf B-Zellen nach Kontakt mit Blei festgestellt.

KOWOLENKO et al. (1991) untersuchten den Einfluss von Blei auf murine Makrophagen und deren Auswirkungen auf B- und T-Zellen. Hierbei stehen Lymphozyten aus dem In-vivo-Versuch den Lymphozyten aus der Kultur gegenüber.

Auffällig sind die je nach Versuchsaufbau unterschiedlichen Effekte des Bleis auf die Zellen des Immunsystems. Die Lymphozyten werden in vivo in ihrer Funktion als

Immunzelle durch Blei in Konzentrationen bis zu 10 µmol/l nicht beeinträchtigt (über das Trinkwasser für 10 Wochen verabreicht). Im Gegensatz dazu sind Lymphozyten, die in vivo gewonnen und in der nachfolgenden Kultur mit 10 µmol/l Blei versetzt werden, nicht in der Lage, eine Immunantwort einzuleiten. Die T-Zellaktivität wird weder in vitro, noch in vivo durch die verwendeten Bleikonzentrationen beeinträchtigt.

SMITH und LAWRENCE (1988) führten erste Studien an Mäusen durch, die belegen, dass es durch Schwermetalle in Konzentrationen von 10 und 100 µmol/l zur Immunmodulation bei antigenpräsentierenden Zellen (Splenozyten, B-Zellen und Makrophagen) kommt. Durch die Produktion von IL-2 stellen sie die Aktivierung von T-Zellen durch das Schwermetall Nickel dar. Die Schwermetalle Cadmium, Kupfer,

Zink und Blei zeigen eine hemmende Wirkung auf die IL-2-Produktion durch T-Zellen, wobei Blei als einzige Substanz in dem untersuchten Konzentrationsbereich nicht toxisch auf die Zellen wirkt. Obwohl keine gesteigerte IL-2-Antwort durch T-Zellen nach einer Bleiinkubation gezeigt werden kann, wird eine gesteigerte humorale Immunantwort in Form einer B-Zellproliferation beobachtet.

Das bedeutet, dass Nickel und Blei eine Immunantwort durch unterschiedliche Mechanismen induzieren, Nickel über direkten T-Zellkontakt, Blei evtl. durch Bindung von Oberflächenproteinen und anschließender Stimulation von B-Zellen. Hierbei wird die Wechselwirkung von Blei mit Phospholipiden oder Histidinresten in der Zellmembran vermutet (SMITH und LAWRENCE 1988).

KROCOVA et al. (2000) zeigen eine aktivierende Wirkung von Blei (PbNO3) und Cadmium (CdCl2) in Konzentrationen von 12-120 µmol/l auf murine peritoneale Makrophagen und auf Splenozyten. Im Zentrum der Untersuchungen stehen die NO- und Zytokinproduktion, sowie die Vitalität und Proliferation der Zellen. Für beide Schwermetalle kann eine gesteigerte IL-4-Produktion sowohl in Monokulturen mit Lymphozyten als auch in Mischkulturen gezeigt werden. Sie sorgen bevorzugt für eine Differenzierung der T-Zellen in Richtung einer Th2-Antwort. In hohen Dosen (20-40 µg/ml) führen Blei und Cadmium zu einer verminderten Produktion von NO, was essentiell für die Interaktion der Makrophagen mit T-Zellen ist. Paradoxerweise kommt es bei geringen Dosen zu einer potenzierten Wirkung der Schwermetalle auf

die NO-Produktion durch Makrophagen. Die in hohen Dosen auftretende Wirkung der Schwermetalle auf Makrophagen wird als eine von vielen Ursachen der verminderten Immunabwehr gegenüber Infektionen bei gleichzeitiger Bleiexposition bei Mensch und Maus diskutiert (KROCOVA et al. 2000).

2.5.5.1. MAPKinase-Signalwege und die Wirkungen von Schwermetallen Sobald es zu einer Beeinflussung der DC in Form von Noxen kommt (LPS, TNF-α, u.a.), werden in den Zellen Signalwege aktiviert und eine Immunantwort eingeleitet. Einer dieser Signalwege ist die Aktivierung in Form der Phosphorylierung von mitogen-aktivierten Proteinkinasen, kurz MAPK. Hierbei handelt es sich um etwa 38 bis 110 kDa große Kinasen bestehend aus drei Subtypen: p38, ERK (extrazelluläre signalregulierte Proteinkinase) und JNK (c-jun N-terminale Kinase) (WU et al. 2001). Die Phosphorylierung der MAPK hat eine Aktivierung intrazellulärer Transkriptionsfaktoren zur Folge, wobei im weiteren Verlauf Oberflächenmoleküle (z.B. CD80, CD86, CD1a, MHCII) oder Rezeptoren (CCR7) bei DC gebildet werden (ARRIGHI et al. 2001, AIBA et al. 2003). Gehemmt werden können diese Signalwege durch spezifische Inhibitoren, z.B. durch den p38-Inhibitor SB203580 oder PD98059 als Inhibitor für ERK (WU et al. 2001).

Die drei Subtypen der MAPK werden auf unterschiedliche Art und Weise und zum Teil gleichzeitig aktiviert, um eine optimale Immunantwort gewährleisten zu können. p38 und JNK reagieren auf Umweltstressoren oder inflammatorische Zytokine (TNF-α). ERK hingegen ist auf die Bindung von Tyrosinkinasenrezeptoren angewiesen (NAKAHARA et al. 2006).

Bei Untersuchungen mit dem Inhibitor SB203580 an humanen DC wurde festgestellt, dass es durch Präinkubation mit dem Inhibitor und nachfolgender Stimulation mit TNF-α bzw. LPS zu einer verminderten Expression der Oberflächenmolekülen CD40, CD80, CD86, CD83 und MHCII kommt. Werden die DC anstatt mit TNF-α bzw. LPS mit Nickeloder DNCB stimuliert, bleibt auch hier die vorher beobachtete Expression von CD40L auf der Zelloberfläche aus. Ähnliche Untersuchungen erfolgten im Hinblick auf die Zytokinausschüttung durch stimulierte DC. Solange sie mit SB203580 behandelt werden, bleibt der Effekt der IL-12-,

TNF-α-, IL -1β- und IL-6-Produktion aus. Die MAPK p38 spielt demzufolge eine wichtige Rolle in dem Maturationsprozeß der DC, da ihre Aktivierung sowohl die Expression von Oberflächenmolekülen, als auch die Zytokinausschüttung beeinflusst (NAKAHARA et al. 2006).

Nickel (100 µmol/l, 300 µmol/l und 1 mmol/l) aktiviert in humanen DC im Gegensatz zu primären Irritantien wie SDS alle drei MAPK; im Anschluß wird CD83 exprimiert (AIBA et al. 2003). Da es durch SB203580 zur Hemmung der CD83- Expression kommt, wird für die Expression von CD83 die Phosphorylierung von p38 verantwortlich gemacht. Nickel induziert ebenfalls die Expression von CD80 und CD86, was als Zeichen der DC-Maturation gilt. Auch hier kann die Expression durch den p38-Inhibitor SB203580 gehemmt werden (ARRIGHI et al. 2001; BOISLEVE et al. 2005).

2.5.5.2. Einfluss der Schwermetalle auf die CCR7-Expression

Essentiell für die Migration reifender DC vom Ort der Antigenaufnahme bis hin zum regionalen Lymphknoten ist die Expression des Chemokinrezeptors 7 (CCR7), der nur auf reifen DC, sowie B- und T-Zellen zu finden ist. Es gibt zwei Chemokine, die mit CCR7 interagieren: CCL19 (entspricht MIP-3β) und CCL21 (VANBERVLIET et al. 2002). RITTER et al. (2004) beschreiben die Expression von CCR7 als Zeichen der DC-Reifung und die Interaktion von CCL19 und CL21 als wichtigen Bestandteil der Migration der DC zum regionalen Lymphknoten. Es gibt unterschiedliche Wege, über die die DC durch Kontaktallergene aktiviert werden. Essentiell für die Expression von CCR7 scheint die Aktivierung der MAPKinasen p38 und JNK zu sein.

Nach Inkubation humaner DC mit dem spezifischen p38-Inhibitor SB203580 konnte die Expression von CCR7 nach Nickelkontakt signifikant reduziert werden (BOISLEVE et al. 2004). DNCB ist auf die Aktivierung der MAPKinasen durch TNF-α angewiesen. Nickel hingegen ist in der Lage, direkt auf diesen Signalweg einzuwirken und führt so zu einer erhöhten CCR7-Expression.

CCR7 ist nicht nur im Stande, chemotaktisch zu wirken, sondern durch die Expression wird auch die Geschwindigkeit, mit der die DC wandern, beeinflusst (RIOL-BLANCO et al. 2005). Durch die Expression von CCR7 kommt es zur Bindung

an CCL19 und CCL21, wodurch eine intrazelluläre, G1-abhängige Kaskade aktiviert wird. Letztlich steuert diese die Funktion von p38, ERK und JNK, wobei es primär zu einer Aktivierung von p38 und/ oder ERK kommt, JNK wird im Anschluß durch einer der beiden MAPKinasen stimuliert (RIOL-BLANCO et al. 2005). Werden alle drei Kinasen inhibiert, kommt es trotzdem zu einer CCR7-Expression, was bedeutet, dass es ein zusätzliches, bislang unbekanntes Molekül geben muß, was die Expression beeinflusst. Keine Wirkung besitzen die MAPKinasen auf die Migrations- geschwindigeit. Diese wird allein über die Moleküle GTPase Rho / Tyrosinkinase Pyk 2/ Cofilin nach Bindung von CCR7 reguliert (RIOL-BLANCO et al. 2005).

2.5.6. In-vivo-Untersuchungen zu immunmodulatorischen Effekten durch Schwermetalle

Untersuchungen im Tiermodell sind hauptsächlich zur Darstellung der umweltrelevanten Schwermetallkonzentrationen und deren Auswirkungen für den Menschen durchgeführt worden. Es gibt einige Studien, die zeigen, dass Blei inhibitorisch auf das Immunsystem wirkt.

In einer Langzeitstudie mit Ratten ist eine chronische Bleiexposition nachgestellt worden. Hierfür ist zum einen den weiblichen Tieren sieben Wochen ante partum und zum anderen den weiblichen Tieren und dem Nachwuchs sechs Wochen post partum Blei (0, 25 und 50 ppm) verabreicht worden. In den Versuchen an den Jungtieren zeigte sich, dass die Ausbildung von Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ durch die Bleiverabreichung vermindert ist (FAITH et al. 1979).

Welcher Mechanismus hinter diesen Vorgängen steckt, bleibt unklar. Vermutet wird die Inhibition von Th1-Lymphozyten, die hauptsächlich für den verzögerten Typ der Hypersensitivitätsreaktion verantwortlich gemacht werden.

In einer Langzeitstudie von KIMBER et al. (1986) ist Probanden Blei in einer nicht toxischen Dosis verabreicht worden. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (11,8 µg/dl) lag der Bleiwert im Blut der Probanden bei 38,4 µg/dl. Die Bildung von Immunglobulinen (IgA, IgG, IgM) ist durch die Bleiexposition nicht gestört. Auch die Funktion der natürlichen Killerzellen oder der T-Zellen konnten durch Blei nicht

beeinträchtigt werden. LUSTER et al. (1978) haben hingegen eine geschwächte Immunabwehr bei Ratten in Form einer verminderten Immunglobulinbildung, sowie einer Schwächung der T-Zellfunktion beobachtet. Der Bleiwert der Versuchstiere lag im Blut bei 29,3 - 52,8 µg/dl nach Verabreichung von 25 ppm Bleiacetat. MULLER et al. (1977) führten über 30 Tage einen Versuch an Balb/c-Mäusen durch, wobei Bleiacetatkonzentrationen zwischen 0,025 bis 0,25 mg/Maus intraperitoneal verabreicht wurden. Um bei den Mäusen eine Hypersensitivitätsreaktion auszulösen, ist eine Sensibilisierung mit Schaferythrozyten intravenös und anschließender Challenge an den Hinterläufen durchgeführt worden. Nach 0, 24 und 48 Stunden konnte über eine zunehmende Pfotenschwellung bei den Mäusen eine Reaktion auf das Agens ermittelt werden. Sobald den Mäusen Blei zugefügt wurde, nahm diese Schwellung entgegengesetzt zum Bleivollblutgehalt ab. Die Überempfindlich- keitsreaktion vom verzögerten Typ scheint somit unterdrückt zu werden. Der Autor

vermutet in diesem Zusammenhang, ob Blei einen direkten Einfluss auf die T-Zellaktivität, insbesondere der Th1-Aktivität, nimmt oder eher das lokale

Entzündungsgeschehen hemmt. Da in dieser Arbeit der Effekt von Bleiacetat, das über das Trinkwasser verabreicht wurde, auf das Immungeschehen der TDI- bzw.

DNCB-behandelten Mäuse untersucht werden sollte, ist der In-vivo-Versuch in Anlehnung an CARMOUCHE et al. (2005) durchgeführt worden. Hierbei wurden die Auswirkungen von Bleiacetat auf das Skelettsystem über einen Zeitraum von sechs Wochen getestet. Die Konzentrationen im Trinkwasser zwischen 0 und 5800 ppm ergaben nach dieser Zeit konstante Bleiwerte im Vollblut (Blutbleigehalt bei 230 ppm im Trinkwasser ca. 40 µg/dL, bei 2300 ppm ca. 100 µg/dL). Umweltrelevante Konzentrationen liegen zwischen 0 und 230 ppm.

Die Tabelle 4 gibt einen Überblick der In-vitro- und In-vivo-Daten von Blei und Nickel und deren Wirkung auf DC wider.