3.4 Versuchsübersicht
3.4.1. In-vitro-Untersuchungen
3.4.1.7. Untersuchung der MAPKinase pp38 mit Hilfe des Westernblots…
versetzt und mit Hilfe einer Proteinbestimmung (Biorad) auf eine gemeinsame Proteinmenge eingestellt (50 µg/30 µl). Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgt in der Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Hierfür werden die Proben nach Zugabe des Ladepuffers bei 95°C für 8 Minuten in einem Thermoblock gekocht, um anschließend bei 200 V und 50 mA aufgetrennt zu werden (ca.10 cm Lauflänge). Als Marker für die Molekularmassen dient der Proteinstandard PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas).
Der Transfer auf eine Nitrozellulosemembran der im SDS-Gel aufgetrennten Proteine erfolgt mit Hilfe einer Transferzelle bei einer angelegten Spannung von 25 V und einer Dauer von 60 Minuten. Danach können im Gel mittels Coomassie®–Blau die Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Die Nitrozellulosemembran wird genutzt, um nach dem Blockierungsvorgang immunogene Proteine durch spezifische Antikörper nachzuweisen. Hierfür wird die Membran zuerst mit dem primären Antikörper (p38 bzw. pp38) beschickt, gewaschen und der sekundäre Antikörper (ECL Anti-rabbit IgG) aufgetragen. Durch die Enhanced chemoluminescence (ECL) werden zum Schluß die Proteine detektiert.
In den Versuchen sind ca. 5-7 Mio. DC/Ansatz zum Einsatz gekommen. Den Proben ist für unterschiedliche Zeiten (15, 30 oder 60 Minuten) Blei in 10 oder 100 µmol/l oder LPS (0,8 µg/ml) zugesetzt worden, um die mögliche Aktivierung der MAPKinase p38 untersuchen zu können. Anschließend sind die Zellen zentrifugiert (220 g, 4 °C, 10 Minuten) und das Zellpellet gewonnen worden. Es ist eine Proteinbestimmung durchgeführt (siehe 3.4.2.8.) und Aliquots gebildet worden, die bei -80 °C eingefroren wurden.
3.4.1.8. T-Zellen: Mixed Leukocyte Reaction (MLR), Vitalität und Proliferation
Bei der heterologen MLR werden T-Zellen einer NMRI-Maus mit DC einer Balb/c-Maus zusammengebracht und nach fünf Tagen mit ³H-Thymidin markiert, um
die Proliferationsrate der T-Zellen als Reaktion auf die behandelten DC bestimmen zu können.
Die dafür verwendeten DC werden zunächst für neun Tage kultiviert und für 24 Stunden mit einem Schwermetall inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe der frisch gewonnenen T-Zellen aus der Milz. Dieser Versuch erfolgte zum einen als Präinkubation, d.h. die DC wurden vor der Zugabe zu den T-Zellen herunterzentifugiert und mit neuem Medium versetzt. Außerdem wurde eine Coinkubation, also ohne vorherigen Mediumwechsel, durchgeführt. Die Aufteilung der T-Zellen war mit 100.000 Zellen /well immer gleich; die der DC änderte sich von well zu well (312, 625, 1.250, 2.500, 5.000, 10.000 DC/ 100µl Medium). Der Ansatz erfolgte in einer Roundbottom-Platte. Am fünften Tag sind die Proben mit 10 µl 3 H-Thymidin (0,005 mCi) markiert und nach 18 Stunden bei -20 °C eingefroren worden.
Ausgewertet wurde die Proliferationsrate der T-Zellen anhand des Scintilationszählers, der die vom eingebauten Thymidin ausgehende β-Strahlung misst.
Zusätzlich ist die Vitalität der T-Zellen und die Proliferation unabhängig von den DC gemessen worden, um darzustellen, dass die verwendeten Schwermetallkonzentrationen nicht toxisch für die T-Zellen sind.
Für die Vitalitätsbestimmung sind die T-Zellen gleichmäßig zu 75.000 TZ bzw.
150.000 TZ/ well in einer Roundbottom-Platte verteilt worden. Als Stimulans diente PHA (5 µg/ml). Zusätzlich sind Schwermetalle in den Konzentrationen 1, 10 und 100 µmol/l für drei Tage zusammen mit den T-Zellen inkubiert worden. Im Anschluß erfolgte ein MTT-Test.
Um die Proliferation der T-Zellen in Abwesenheit der DC bestimmen zu können, sind die T-Zellen in Anlehnung an DUGAN et al. (2004) in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (75.000 und 150.000 TZ/200 µl Medium) aufgeteilt und in eine Roundbottom-Platte überführt worden. Nach Zugabe von unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen und PHA (5 µg/ml) sind die Zellen nach drei Tagen mit Thymidin markiert und 18 Stunden später bei -20 °C eingefroren worden. Die Auswertung erfolgt so wie bei der MLR mit dem Scintilationsgerät.
3.4.2. In-vivo-Untersuchungen
Es wurden zwei unterschiedliche Allergiemodelle für diese Arbeit ausgesucht, um die möglichen Immunmodulationen durch Schwermetalle sowohl in einem Th1-, als auch in einem Th2-induzierten Allergiegeschehen untersuchen zu können.
Insgesamt sind 42 Tiere auf sieben Gruppen verteilt worden (n=6). Neben einer Kontrollgruppe gab es sowohl für das TDI-, als auch für das DNCB-Modell eine Kontrolle. Außerdem wurde innerhalb der beiden Allergiemodelle jeweils eine Gruppe mit 230 bzw. 2300 ppm Bleiacetat behandelt. Das Bleiacetat ist den Tieren über das Trinkwasser ad libitum für insgesamt acht Wochen angeboten worden. Die Bleiacetatkonzentrationen 230 bzw. 2300 ppm entsprechen einem Bleigehalt von 0,126 bzw. 1,265 g/l. Somit ergibt sich eine tägliche Bleiaufnahme von 0,63 bzw.
6,325 mg pro Maus bei einer Wasseraufnahme von durchschnittlich 5 ml.
3.4.2.1. TDI-Kontaktallergiemodell
Die Balb/c-Mäuse sind an vier aufeinander folgenden Tagen mit 5 %igen TDI sensibilisiert worden. Am ersten Tag ist ihnen 100 µl, an den Tagen 2 bis 4 50 µl auf die zuvor rasierte Bauchhaut aufgetragen worden. Für eine bessere Penetration des Allergens durch die Epidermis ist die Hornschicht der rasierten Bauchhaut zusätzlich mit Klebestreifen abgestrippt worden. Am Tag 21 des Versuches erfolgte die Challenge durch wiederholte Applikation von 0,5 %igen TDI (50 µl) auf die Bauchhaut. Am Tag 28 und 29 des Versuches erfolgte die zweite Challenge, allerdings an Ober- und Unterseite der Ohren (je 20 µl 0,5 % TDI) (BÄUMER et al.
2005).
3.4.2.2. DNCB-Kontaktallergiemodell
Die Mäuse wurden zwei Tage lang im DNCB-Modell sensibilisiert. Zuerst ist ihnen 100 µl 1 %iges DNCB in Freundsches Adjuvans gelöst intracutan appliziert worden. Die Wiederholung am darauf folgenden Tag erfolgte mit nur 50 µl der Lösung. Die Challenge mit 0,5 %igem DNCB (je 20 µl) erfolgte 7 Tage später durch lokales Auftragen des Allergens auf die Ohrhaut (BÄUMER et al. 2005).
In Abbildung 9 ist der Aufbau des Tierversuchs schematisch dargestellt.
TDI-Modell DNCB-Modell
Abb. 9 Übersicht zum In-vivo-Versuchsablauf im TDI- und DNCB-Modell
3.4.2.3. Bleibestimmung im Vollblut
Es wurde jeweils eine Sammelblutprobe einer Gruppe in der Atom-absorptionsspektroskopie (AAS) auf ihren Gehalt an Blei gemessen. Hierfür sind die Proben in mehreren Arbeitsschritten vorbereitet worden: 0,5 ml Vollblut ist mit HNO3
für sechs Stunden bei 60°C erwärmt worden. Im Anschluß erfolgte für vier Stunden die Erhitzung mit HNO3 und Salpetersäure bei Temperaturen zwischen 130 und 200 °C. Danach wurden die Proben in einen Glaskolben überführt und gemessen.
3.4.2.4. Untersuchung der allergischen Entzündungsreaktion anhand der Lnn. auriculares und der Ohrdickenmessung
Prinzip der Methode nach EHLING et al. (2005) ist die Gewichtsbestimmung regionaler Lymphknoten nach stattgefundener Entzündungsreaktion. Den Mäusen sind nach der Tötung beide Lnn. auriculares entnommen worden, um deren Gewicht zu bestimmen. Dieses wird durch stimulierte und folglich proliferierte T-Zellen, deren
Sensibilisierung:
Zahl ebenfalls bestimmt wurde, beeinflusst. Die T-Zellproliferation wiederum ist eine Folge der Stimulation durch ausgewanderte DC nach TDI- bzw. DNCB-Kontakt aus dem Entzündungsgeschehen in die regionalen Ohrlymphnoten.
Als zusätzlicher Parameter einer durch die beiden Allergene induzierten, allergischen Entzündungsreaktion dient das Ausmessen der Ohrdicke vor und nach der Challenge mit Hilfe eines Cutimeters (Mitutoyo, Neuss).
3.4.2.5. Untersuchung von Lymphknotenzellen aus den Lnn. auriculares Die für den vorherigen Versuch gewonnenen Lymphknoten sind nach der Gewichtsbestimmung von jeder Maus gesammelt und zerkleinert worden. Im Anschluß ist die jeweilige Zellzahl bestimmt und die Zellen sind für die FACS-Analyse (CD11c/CD40) und die Zellkultur in zwei Gruppen zu je 1 Mio. DC aufgeteilt worden.
In Anlehnung an CUMBERBATCH et al. (2005) sind die DC in der Zellkultur erneut mit TDI bzw. DNBS (dem wasserlöslichen Analogon zu DNCB) inkubiert worden:
Im TDI-Modell sind die DC zunächst für eine Stunde mit 100 µg/ml TDI inkubiert worden (RPMI-Medium ohne Zusatz von FKS). Nach einem Waschvorgang wurde dieser Vorgang wiederholt (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS). Es erfolgten ein Mediumwechsel und ein Transfer der Zellen in eine 96er-well-Platte, wo sie für drei Tage bei 37 °C inkubierten. Im Anschluß wurden die Zellen herunterzentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung von IL-4 und IL-1β genutzt.
Die Kultivierung der Zellen aus den DNCB-Gruppen erfolgte ähnlich. Nachdem die Zellen in RPMI-Medium (mit FKS und Pen/Strep) aufgenommen wurden, ist ihnen für drei Stunden DNBS (100 µg/ml) zugesetzt worden. Nach einem Mediumwechsel wurden sie für weitere zwei Tage im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Zellen sind dann herunterzentrifugiert und die Überstände für die Bestimmung von IFN-γ gewonnen worden.
3.4.2.6. Migrationsassay
In Anlehnung an ORTNER et al. (1996) ist in diesem Versuch die Auswanderungsbereitschaft der DC nach Bleiacetatverabreichung untersucht worden. Hierfür sind die Ohren der Mäuse unmittelbar nach deren Tötung abgetrennt und für 8-10 Minuten zur Desinfektion in 70 % Ethanol aufbewahrt worden.
Anschließend wurden sie luftgetrocknet, um für den Migrationsassay in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt werden zu können. Die dorsale Ohrhälfte ist mit der Epidermis nach oben liegend auf ein dreibeiniges Stahlnetz gelegt und dieses wiederum in ein mit Medium (RPMI-Medium mit FKS, Pen/Strep und MIP-3β) vorbereitete 6well-Platte gestellt worden. Diese Kultur ist für drei Tage im Brutschrank bei 37 °C inkubiert worden, wobei an den Tagen 1 und 2 das Medium gewechselt und mit dem Medium des dritten Tages gepoolt wurden, um die Zahl der ausgewanderten DC bestimmen zu können.
3.4.2.7. Bestimmung von IL-4 aus dem Ohrhomogenat
Zur Bestimmung der Zytokinproduktion in den behandelten Ohren der Mäuse sind diese nach der zervikalen Dislokation entnommen und bei -80 °C aufbewahrt worden. Für die Untersuchungen sind sie unter Flüssigstickstoff zerkleinert und danach in Eppendorfgefäße überführt worden. Nach Zugabe von 150 µl PBS wurden die Proben bei 4 °C für eine Stunde inkubiert und schließlich zentrifugiert, um die Überstände zu gewinnen. Diese wurden mit Hilfe einer Proteinbestimmung auf einen gemeinsamen Proteingehalt eingestellt, um dann die IL-4-Menge der einzelnen Proben im ELISA zu messen.
3.4.2.8. Proteinbestimmung
Es wird zuvor gelöstes Protein in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und anschließend mit einem Reaktionsreagenz vermischt. Abhängig vom Proteingehalt kommt es zu einem Farbumschlag der jeweiligen Probe, die durch die Bindung des Reagenz mit dem Protein zustande kommt. Die exakte Proteinmenge wird bei einer Wellenlänge von 595 nm photometrisch gemessen und kann durch eine ebenfalls
gemessene Kalibrationsreihe, angesetzt mit BSA als Standard, in absolute Werte umgerechnet werden.
Die Proteinbestimmung findet in dieser Arbeit zum einen Anwendung bei dem zuvor beschriebenen Ohrhomogenat-Versuch, als auch bei der Einstellung der Proben für den Westernblot.
Die Tabelle 6 gibt einen Überblick über die für die einzelnen Tiergruppen durchgeführten Versuche.
Tab. 6 Überblick der In-vivo-Versuche bei den einzelnen Tiergruppen
Gruppen (Bleigehalt im
Lymphozytenkultur x +TDI:
Messung von
Ohrdickenmessung x x X
Skinmigrationsassay x x X
3.5 Statistische Auswertung
Die Darstellungen der Ergebnisse (DC- und T-Zellvitalität, T-Zellproliferation, TNF-α- und CCL2-ELISA, Migrationsassay, MLR, entzündliche Ohrschwellung, Lymphknotengewicht, -zellzahl, sowie CD11c/CD40-positivie Zellen) erfolgten unter Angabe der Mittelwerte (MW) + Standardabweichung (S.D.).
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism. Die mit unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen behan-delten Gruppen sind jeweils mit der Kontrollgruppe bzw. untereinander auf signifikante Differenzen untersucht worden. Hierfür wurde zuerst eine parametrische Varianzanalyse (One-way-Anova) und im Anschluß der Dunnetts Test als post-hoc-Test durchgeführt. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% galt als schwach signifikant; lag sie bei 1%, wurde sie als signifikant bzw. bei 0,1% als hoch signifikant eingestuft. Diese statistischen Durchführungen gelten für alle aufgeführten In-vivo-Ergebnisse und z.T. für die In-vitro-In-vivo-Ergebnisse. Die Ausnahmen hierbei sind die Ergebnisse der MLR und T-Zellproliferation, bei denen ein ungepaarter T-Test als statistische Auswertung gewählt wurde.
Die zugehörigen Einzelwerte aller durchgeführten Versuche sind in dem Anhangskapitel aufgeführt.
4 Ergebnisse
4.1 In-vitro-Untersuchungen
4.1.1. Einfluss der Schwermetalle auf die Vitalität der DC und T-Zellen, sowie auf die Proliferation der T-Zellen
Als Vorraussetzung für die nachfolgenden Untersuchungen ist sowohl bei den DC, als auch bei den T-Zellen die Vitalität mittels MTT-Test gemessen worden (Abb.
4.1-a+b und 4.2). Im Vergleich zur Kontrolle (KO) ist keine signifikante Beeinträchtigung der DC oder T-Zellen durch Inkubation mit den Schwermetallen in unterschiedlichen Konzentrationen zu erkennen. Die Proliferationsrate der T-Zellen nach alleiniger Inkubation mit Schwermetallen sinkt bei beiden Metallen mit zunehmender Konzentration (Abb.4.3).
Abb.4.1-a Vitalität der DC (nach zusätzlicher LPS-Stimulation), Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests am Tag 10 der Kultur; Stimulation durch Schwermetalle am Tag 8 und durch LPS am Tag 9 der Kultur; die Probenanzahl beträgt n=4; die Versuche wurden dreimal durchgeführt; Einzelwerte siehe Tab.9-1 A und G im Anhang
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8
KO LPS 1 10 100 1 10 100
Optische Dichte
µmol/l Blei+LPS Mangan+LPS
Abb.4.1-b Vitalität der DC, Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests am Tag 10 der Kultur; Stimulation durch Schwermetalle am Tag 8 der Kultur.
Die Probenanzahl beträgt n=4; es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von drei Versuchsdurchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-1 J und D im Anhang
Abb. 4.2 Vitalität der T-Zellen, Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests. Die T-Zellen (75.000 TZ/ 200 µl Medium) wurden mit Blei bzw. Mangan über drei Tage mit Zusatz von 5 µg/ml PHA als Stimulans inkubiert, die Proben-anzahl beträgt n=6; es wurden drei Versuche durchgeführt. Einzelwerte siehe Tab.9-2 A und D im Anhang
Abb.4.3 ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Blei bzw. Mangan. Die Proliferation der T-Zellen nimmt im Vergleich zur Kontrolle mit steigender Schwermetallkonzentration ab; ein signifikanter Unterschied besteht zwischen der Kontrolle und Blei 100 µmol/l (*p < 0,05), die Probenanzahl beträgt n=6, es wurden drei Versuche durchgeführt. Einzelwerte siehe Tab.9-3 A und D im Anhang
4.1.2. Einfluss von Blei und Mangan auf die TNF-α-Produktion
Das proinflammatorische Zytokin TNF-α ist in diesem Versuch aus den Kulturüberständen zuvor stimulierter DC durch Schwermetalle bestimmt worden. Bei zusätzlicher LPS-Stimulation steigt die Zytokinmenge ebenso wie bei nur LPS-stimulierten DC. Fällt die LPS-Stimulation weg, liegt die Sekretion auf Kontrollniveau (Abb. 4.4a+b).
0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000
KO 1 10 100 1 10 100
³H-Thymidin (cpm)x10³
Blei Mangan
*
µmol/l
Abb.4.4-a TNF-α-Produktion durch DC (nach zusätzlicher LPS-Stimulation)
Dargestellt ist die Extinktion als optische Dichte. Ein Anstieg der Zytokinausschüttung findet nur im Zusammenhang mit einer LPS-Stimulation statt; die Probenanzahl beträgt n=4. Es handelt sich um repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen.
Einzelwerte siehe Tab.9-4 C und H im Anhang
Abb.4.4-b TNF-α-Produktion durch DC
Dargestellt ist die Extinktion als optische Dichte. Ein Anstieg der Zytokinausschüttung durch Blei oder Mangan findet nicht statt; die Probenanzahl beträgt n=4. Es handelt sich um repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-4 E und K im Anhang
4.1.3. Beeinflussung der DC durch Schwermetalle im Migrationsassay In der Boyden Chamber ist das Auswanderverhalten der DC nach Schwer-metallinkubation untersucht worden. Das Auswanderverhalten der DC nimmt nach Stimulation mit LPS nur leicht zu (Abb.4.5). Nach einer zusätzlichen Inkubation mit Blei 100 µmol/l kommt es zu einem signifikanten Anstieg der Migrationsbereitschaft gegenüber der Kontrolle (Abb.4.6-a). Innerhalb der Bleigruppe sieht man einen dosisabhängigen Anstieg bei der Migration. Bei der Inkubation mit Mangan (100 µmol/l) steigt das Auswanderverhalten der DC signifikant (Abb. 4.6-b).
Abb.4.5 Migrationsassay unter LPS-Stimulation, kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und LPS-stimulierten DC. Der Versuch ist mit einer Probenanzahl von n=4 dreimal durchgeführt worden. Einzelwerte siehe Tab.9-5 A im Anhang
0 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000
Kontrolle LPS
ausgewanderte DC/ml
Abb.4.6-a Migrationsassay unter Bleiinkubation und LPS-Stimulation, signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Blei 100 µmol/l nach 90 Minuten Inkubation (*p < 0,05). Die Probenanzahl ist n=4; der Versuch wurde dreimal durchgeführt.
Einzelwerte siehe Tab.9-5 A im Anhang
Abb.4.6-b Migrationsassay unter Manganinkubation und LPS-Stimulation, signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Mangan 100 µmol/l nach 90 Minuten Inkubation (*p < 0,05). Die Probenanzahl beträgt n=3; es ist ein repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-5 D im Anhang
4.1.4. Untersuchung der Expression von Oberflächenmolekülen in der FACS- Analyse
Der Rezeptor CCR7 auf reifenden DC wird für das Auswandern in den drainierenden Lymphknoten benötigt. In der Tab.4.1 sind zwei unterschiedliche Versuchsansätze mit ihren Ergebnissen dargestellt: zum einen der Anteil der DC, die CCR7 nach LPS-Stimulation bzw. Bleiinkubation exprimieren (A); zum anderen die DC, die im MIgrationsassay ausgewandert sind und in Folge der dadurch induzierten Maturation CCR7 exprimieren (B). Die Untersuchungen beschränken sich auf Blei und Mangan in jeweils einer Konzentration, da dieser Ansatz als orientierend anzusehen ist.
Tab. 4.1 Expression von CCR7 durch DC nach LPS-/Bleikontakt, sowie Auswan- derung im Migrationsassay nach Manganinkubation, repräsentatives Ergebnis von zwei Durchführungen; Einzelwerte siehe Tab.9-6 im Anhang;
Anzahl der CCR7-exprimierenden DC
(Zellzahl / %)
A Kontrolle 8.500 / 1,7
LPS 30.900 / 6,18
Pb 100 µmol/l 46.600 / 9,32
Anzahl der CCR7-exprimierenden DC
(Zellzahl / %)
Anzahl CCR7-exprimierenden DC im
Migrationsassay (Zellzahl / %)
B Kontrolle 300 / 0,06 58.100 / 11,62
LPS 10.000 / 2 43.800 / 8,76
Mn 10 µmol/l 25.100 / 5,02 73.600/ 14,7
Zum einen ist zu erkennen, dass allein durch das Schwermetall die DC eine stärkere Expression von CCR7 zeigen (A). Im Migrationsassay ist zum anderen die CCR7-Expression sowohl durch das Auswandern, als auch durch die zusätzliche Stimulation mit Mangan gesteigert (B).
In den Abb. 4.7-a+b ist die Expression von CCR7 durch die DC anhand von Histogrammen gezeigt. Hierbei wird die gesteigerte CCR7-Expression von DC, die mit Mangan (10 µmol/l) inkubiert wurden, gegenüber der Kontrolle durch eine Rechtsverschiebung des Histogramms deutlich.
Abb.4.7-a Histogramm CCR7-positiver DC, Abb.4.7-b Histogramm CCR7-positi- die unbehandelt sind und eine geringe ver DC, die mit Mangan (10 µmol/l) CCR7-Expression zeigen. inkubiert wurden und mit einer
gesteigerten Expression reagieren.
Die Expression der Oberflächenmoleküle CD11c als DC-Marker, sowie CD80 und CD86 als DC-Aktivierungsmarker ist nach Schwermetallinkubation im Vergleich zur Kontrolle und LPS-stimulierten DC gemessen worden. Die Darstellungen der Ergebnisse (CD11c/CD80) aus der FACS-Analyse erfolgen als Dotplots. Der Quadrant C2 spiegelt die doppeltpositiven DC wider. Es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von zwei Durchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-6 im
Anhang; Auf der x-Achse ist CD80, auf der y-Achse CD11c aufgetragen (Abb.4.8-a-e).
Abb.4.8-a Dotplot unbehandelter DC, Abb.4.8-b Dotplot LPS-stimulierter DC, CD11c/CD80-positive DC sind im die Anzahl der CD11c/CD80-positiven Quadranten C2 dargestellt steigt im Gegensatz zur Kontrolle
Abb. 4.8-c Dotplot bleistimulierter DC Abb. 4.8-d Dotplot bleistimulierter DC (1 µmol/l), erhöhte Expression von (10 µmol/l), erhöhte Expression von CD11c/CD80 durch DC CD11c/CD80 durch DC
CD80
CD11c
Abb. 4.8-e Dotplot bleistimulierter DC (100 µmol/l), die Anzahl CD11c/CD80-positiver DC geht auf Kontroll- niveau zurück
Zusammenfassend zeigt sich eine leichte Erhöhung von CD11c/CD80 bei den DC, die zuvor mit 1 bzw. 10 µmol/l Blei inkubiert wurden (Abb.4.8 c+d). Bei Blei 100 µmol/l sinkt die Expression unterhalb des Kontrollniveaus (Abb.4.8-e).
Die Darstellungen der CD11c/CD86-Ergebnisse erfolgen ebenfalls als Dotplots; es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von zwei Durchführungen.
Einzelwerte siehe Tab.9-6 im Anhang; Auf der x-Achse ist CD86, auf der y-Achse CD11c aufgetragen (Abb.4.8-f-j).
Abb. 4.8-f Dotplot unbehandelter DC, Abb. 4.8-g Dotplot LPS-stimulierter CD11c/CD86-positive DC sind im DC, starker Anstieg von
Quadranten C2 dargestellt CD11c/CD86-positiven DC
CD11c
CD86
Abb. 4.8-h Dotplot bleistimulierter DC Abb. 4.8-i Dotplot bleistimulierter DC (1 µmol/l), Expression von CD11c/CD86 (10 µmol/l), Expression von CD11c/
sinkt auf Kontrollniveau CD86 ist auf Kontrollniveau
Abb. 4.8-j Dotplot bleistimulierter DC (100 µmol/l) Expression von CD11c/CD86 ist auf Kontrollniveau
Zusammenfassend lässt sich bei der Expression von CD11c/CD86 kein Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und den bleistimulierten DC nachweisen.
4.1.5. Einfluss von Blei auf die MAPKinase p38
p38 zählt zu den MAPKinasen, die intrazellulär vorkommen und durch Noxen aktiviert (phosphoryliert) werden (p38 → pp38). Dargestellt sind die im Westernblot aufgetrennten und durch ECL-Detektion sichtbar gemachten Proteine der DC-Proben, die zuvor mit Blei inkubiert wurden. Die Proben sind zu unterschiedlichen Zeiten stimuliert worden, um eine zeitabhängige Aktivierung von p38 untersuchen zu können.
In der Abb. 4.9 ist die p38 zusammen mit ihrer aktivierten Form pp38 dargestellt. Die stärkste Aktivierung erfolgt bei LPS nach 30 Minuten, bei Blei 10 µmol/l ist nach 60 Minuten eine ganz schwache Aktivierung zu sehen. Bei Blei 100 µmol/l ist erstmals bei 15 Minuten ein Signal zu erkennen.
Abb.4.9 Darstellung der Banden aus dem Westernblot, Gegenüberstellung von p38 ( ) und pp38 ( ) einzelner Proben; negatives Ergebnis bei der Kontrolle, stärkste Aktivierung bei LPS nach 30 Minuten, leichte Aktivierung bei Pb 10 µmol/l nach 60 Minuten, bei Pb 100 µmol/l ist bei 15 Minuten (hier zweimal aufgeführt) schon eine Aktivierung zu sehen. Es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von zwei Durchführungen.
15´ 30´ 60´
LPS
15´ 30´ 60´
Blei 10 µmol/l KO
15´ 15´ 30´ 60´
Blei 100 µmol/l
p38 pp38
4.1.6. Wirkung der Schwermetalle auf die T-Zellproliferation in der MLR In der MLR wird die Proliferationsrate der T-Zellen als Reaktion auf die Stimulation durch DC gemessen. Insgesamt wurden zwei unterschiedliche Versuchsansätze durchgeführt. Zum einen erfolgte die MLR anhand einer Inkubation der DC nach vorheriger Schwermetallinkubation (Abb.4.10-a-c). Als zweites ist aus den Überständen dieses Ansatzes die Konzentration des Chemokins CCL2 gemessen worden (Abb. 4.10-d+e).
Es zeigt sich bei allen drei Bleikonzentrationen (1, 10 und 100 µmol/l) ein Anstieg der T-Zellproliferation proportional zur DC-Anzahl (siehe Abb. 4.9 a-c). Bei der Inkubation mit Mangan 1-100 µmol/l erfolgten ähnliche Ergebnisse; diese sind im Anhang aufgeführt.
Abb.4.10-a ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit
Abb.4.10-a ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit