In-vivo-Untersuchungen

Es wurden zwei unterschiedliche Allergiemodelle für diese Arbeit ausgesucht, um die möglichen Immunmodulationen durch Schwermetalle sowohl in einem Th1-, als auch in einem Th2-induzierten Allergiegeschehen untersuchen zu können.

Insgesamt sind 42 Tiere auf sieben Gruppen verteilt worden (n=6). Neben einer Kontrollgruppe gab es sowohl für das TDI-, als auch für das DNCB-Modell eine Kontrolle. Außerdem wurde innerhalb der beiden Allergiemodelle jeweils eine Gruppe mit 230 bzw. 2300 ppm Bleiacetat behandelt. Das Bleiacetat ist den Tieren über das Trinkwasser ad libitum für insgesamt acht Wochen angeboten worden. Die Bleiacetatkonzentrationen 230 bzw. 2300 ppm entsprechen einem Bleigehalt von 0,126 bzw. 1,265 g/l. Somit ergibt sich eine tägliche Bleiaufnahme von 0,63 bzw.

6,325 mg pro Maus bei einer Wasseraufnahme von durchschnittlich 5 ml.

3.4.2.1. TDI-Kontaktallergiemodell

Die Balb/c-Mäuse sind an vier aufeinander folgenden Tagen mit 5 %igen TDI sensibilisiert worden. Am ersten Tag ist ihnen 100 µl, an den Tagen 2 bis 4 50 µl auf die zuvor rasierte Bauchhaut aufgetragen worden. Für eine bessere Penetration des Allergens durch die Epidermis ist die Hornschicht der rasierten Bauchhaut zusätzlich mit Klebestreifen abgestrippt worden. Am Tag 21 des Versuches erfolgte die Challenge durch wiederholte Applikation von 0,5 %igen TDI (50 µl) auf die Bauchhaut. Am Tag 28 und 29 des Versuches erfolgte die zweite Challenge, allerdings an Ober- und Unterseite der Ohren (je 20 µl 0,5 % TDI) (BÄUMER et al.

2005).

3.4.2.2. DNCB-Kontaktallergiemodell

Die Mäuse wurden zwei Tage lang im DNCB-Modell sensibilisiert. Zuerst ist ihnen 100 µl 1 %iges DNCB in Freundsches Adjuvans gelöst intracutan appliziert worden. Die Wiederholung am darauf folgenden Tag erfolgte mit nur 50 µl der Lösung. Die Challenge mit 0,5 %igem DNCB (je 20 µl) erfolgte 7 Tage später durch lokales Auftragen des Allergens auf die Ohrhaut (BÄUMER et al. 2005).

In Abbildung 9 ist der Aufbau des Tierversuchs schematisch dargestellt.

TDI-Modell DNCB-Modell

Abb. 9 Übersicht zum In-vivo-Versuchsablauf im TDI- und DNCB-Modell

3.4.2.3. Bleibestimmung im Vollblut

Es wurde jeweils eine Sammelblutprobe einer Gruppe in der Atom-absorptionsspektroskopie (AAS) auf ihren Gehalt an Blei gemessen. Hierfür sind die Proben in mehreren Arbeitsschritten vorbereitet worden: 0,5 ml Vollblut ist mit HNO3

für sechs Stunden bei 60°C erwärmt worden. Im Anschluß erfolgte für vier Stunden die Erhitzung mit HNO3 und Salpetersäure bei Temperaturen zwischen 130 und 200 °C. Danach wurden die Proben in einen Glaskolben überführt und gemessen.

3.4.2.4. Untersuchung der allergischen Entzündungsreaktion anhand der Lnn. auriculares und der Ohrdickenmessung

Prinzip der Methode nach EHLING et al. (2005) ist die Gewichtsbestimmung regionaler Lymphknoten nach stattgefundener Entzündungsreaktion. Den Mäusen sind nach der Tötung beide Lnn. auriculares entnommen worden, um deren Gewicht zu bestimmen. Dieses wird durch stimulierte und folglich proliferierte T-Zellen, deren

Sensibilisierung:

Zahl ebenfalls bestimmt wurde, beeinflusst. Die T-Zellproliferation wiederum ist eine Folge der Stimulation durch ausgewanderte DC nach TDI- bzw. DNCB-Kontakt aus dem Entzündungsgeschehen in die regionalen Ohrlymphnoten.

Als zusätzlicher Parameter einer durch die beiden Allergene induzierten, allergischen Entzündungsreaktion dient das Ausmessen der Ohrdicke vor und nach der Challenge mit Hilfe eines Cutimeters (Mitutoyo, Neuss).

3.4.2.5. Untersuchung von Lymphknotenzellen aus den Lnn. auriculares Die für den vorherigen Versuch gewonnenen Lymphknoten sind nach der Gewichtsbestimmung von jeder Maus gesammelt und zerkleinert worden. Im Anschluß ist die jeweilige Zellzahl bestimmt und die Zellen sind für die FACS-Analyse (CD11c/CD40) und die Zellkultur in zwei Gruppen zu je 1 Mio. DC aufgeteilt worden.

In Anlehnung an CUMBERBATCH et al. (2005) sind die DC in der Zellkultur erneut mit TDI bzw. DNBS (dem wasserlöslichen Analogon zu DNCB) inkubiert worden:

Im TDI-Modell sind die DC zunächst für eine Stunde mit 100 µg/ml TDI inkubiert worden (RPMI-Medium ohne Zusatz von FKS). Nach einem Waschvorgang wurde dieser Vorgang wiederholt (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS). Es erfolgten ein Mediumwechsel und ein Transfer der Zellen in eine 96er-well-Platte, wo sie für drei Tage bei 37 °C inkubierten. Im Anschluß wurden die Zellen herunterzentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung von IL-4 und IL-1β genutzt.

Die Kultivierung der Zellen aus den DNCB-Gruppen erfolgte ähnlich. Nachdem die Zellen in RPMI-Medium (mit FKS und Pen/Strep) aufgenommen wurden, ist ihnen für drei Stunden DNBS (100 µg/ml) zugesetzt worden. Nach einem Mediumwechsel wurden sie für weitere zwei Tage im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Zellen sind dann herunterzentrifugiert und die Überstände für die Bestimmung von IFN-γ gewonnen worden.

3.4.2.6. Migrationsassay

In Anlehnung an ORTNER et al. (1996) ist in diesem Versuch die Auswanderungsbereitschaft der DC nach Bleiacetatverabreichung untersucht worden. Hierfür sind die Ohren der Mäuse unmittelbar nach deren Tötung abgetrennt und für 8-10 Minuten zur Desinfektion in 70 % Ethanol aufbewahrt worden.

Anschließend wurden sie luftgetrocknet, um für den Migrationsassay in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt werden zu können. Die dorsale Ohrhälfte ist mit der Epidermis nach oben liegend auf ein dreibeiniges Stahlnetz gelegt und dieses wiederum in ein mit Medium (RPMI-Medium mit FKS, Pen/Strep und MIP-3β) vorbereitete 6well-Platte gestellt worden. Diese Kultur ist für drei Tage im Brutschrank bei 37 °C inkubiert worden, wobei an den Tagen 1 und 2 das Medium gewechselt und mit dem Medium des dritten Tages gepoolt wurden, um die Zahl der ausgewanderten DC bestimmen zu können.

3.4.2.7. Bestimmung von IL-4 aus dem Ohrhomogenat

Zur Bestimmung der Zytokinproduktion in den behandelten Ohren der Mäuse sind diese nach der zervikalen Dislokation entnommen und bei -80 °C aufbewahrt worden. Für die Untersuchungen sind sie unter Flüssigstickstoff zerkleinert und danach in Eppendorfgefäße überführt worden. Nach Zugabe von 150 µl PBS wurden die Proben bei 4 °C für eine Stunde inkubiert und schließlich zentrifugiert, um die Überstände zu gewinnen. Diese wurden mit Hilfe einer Proteinbestimmung auf einen gemeinsamen Proteingehalt eingestellt, um dann die IL-4-Menge der einzelnen Proben im ELISA zu messen.

3.4.2.8. Proteinbestimmung

Es wird zuvor gelöstes Protein in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und anschließend mit einem Reaktionsreagenz vermischt. Abhängig vom Proteingehalt kommt es zu einem Farbumschlag der jeweiligen Probe, die durch die Bindung des Reagenz mit dem Protein zustande kommt. Die exakte Proteinmenge wird bei einer Wellenlänge von 595 nm photometrisch gemessen und kann durch eine ebenfalls

gemessene Kalibrationsreihe, angesetzt mit BSA als Standard, in absolute Werte umgerechnet werden.

Die Proteinbestimmung findet in dieser Arbeit zum einen Anwendung bei dem zuvor beschriebenen Ohrhomogenat-Versuch, als auch bei der Einstellung der Proben für den Westernblot.

Die Tabelle 6 gibt einen Überblick über die für die einzelnen Tiergruppen durchgeführten Versuche.

Tab. 6 Überblick der In-vivo-Versuche bei den einzelnen Tiergruppen

Gruppen (Bleigehalt im

Lymphozytenkultur x +TDI:

Messung von

Ohrdickenmessung x x X

Skinmigrationsassay x x X