Zytokinbestimmung

In dieser Arbeit sind Kulturüberstände der DC auf ihren Gehalt an unterschiedlichen Zytokinen untersucht worden (TNF-α, IL-4, IFN-γ, CCL2, IL-1β).

Für den Nachweis wird ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet, der ein immunologisches Nachweisverfahren basierend auf enzymatischen Farbreaktionen darstellt. Mit Hilfe des ELISA können verschiedenste biomolekulare Substanzen oder niedermolekulare Verbindungen in einer Probe nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zu Nutze, die an die nachzuweisenden Antigene binden.

Hierfür werden Probe und Antikörper über eine definierte Zeit gemeinsam inkubiert. Durch unterschiedliche Wasch- und Trennungsschritte wird dann das gebundene Material (Antigen-Antikörper-Komplex) von dem ungebundenen Restmaterial der Probe getrennt. Mit Hilfe der an den Antikörper gekoppelten Enzyme wird anschließend eine Farbreaktion ausgelöst. Die Stärke der Farbreaktion ist mittels eines Photometers messbar und ihre Stärke proportional zur Konzentration in der Probe, die wiederum mit einem Standard verglichen wird.

3.4.1.5. Migrationsassay

In Anlehnung an GUTZMER et al. (2004) ist am Tag 10 der Kultur ein Migrationsassay von DC durchgeführt worden, um die Auswanderungsbereitschaft der Zellen nach Schwermetallinkubation beurteilen zu können. Hierfür sind am Tag 8 der Kultur die DC mit Schwermetallen in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert und je nach Versuchsansatz die DC mit LPS (0,8 µg/ml) oder gar nicht stimuliert worden. Nach 48 Stunden erfolgte der Transfer von 200.000 DC in 300 µl Medium auf die Membran einer 6er Transwell-Platte (Porengröße 8 µm). Im Well wurde 1 ml Medium mit MIP-3β (50 ng/ml) als chemotaktische Substanz vorgelegt. Nach 90 Minuten Inkubation wurde die Membran entnommen, das Medium aus dem Well gewonnen und zentrifugiert (1000 g, 4 °C, 10 Minuten). Das Zellpellett wurde in neuem Medium (100 µl) aufgenommen und im Verhältnis 1:3 mit Trypan verdünnt, um anschließend die Zahl ausgewanderter DC mit folgender Gleichung bestimmen

zu können:

X

4 x 3 x 10.000 x 0,1 = ausgewanderte DC/ ml

Im Anschluß an den Migrationsassay sind die ausgewanderten Zellen auf die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 untersucht worden. Hierfür sind sie nach der Migration herunterzentrifugiert (s.o.), der Überstand verworfen und die DC in 200 µl PBS aufgenommen worden, um sie mit dem CCR7-Antikörper und nachfolgend mit dem sekundären Antikörper für die FACS-Analyse zu färben (siehe dort).

3.4.1.6. FACS-Analyse

Das Prinzip der Durchflusszytometrie (Fluorescence activated cell sorting, FACS) beruht auf der Emission optischer Signale ausgehend von Zellen, die während des Verfahrens einen Laserstrahl passieren. Hierzu dienen zwei Parameter:

das Vorwärtsstreulicht FSC (Forward Scatter) als Maß für die Zellgröße und das Seitwärtsstreulicht SSC (Side Scatter) als Maß für die Granularität (Größe und Struktur des Zellkerns etc.) (siehe Abb. 8).

Abb.8 Darstellung einer FACS-Analyse (repräsentatives Beispiel), Auftrennung der Zellen nach Granularität und Größe

SSC (Granularität)

FSC (Größe)

Die in einer Lösung befindlichen Zellen werden durch eine Kapillare gesaugt und passieren im Sensormodul einzeln einen Laserstrahl. Die Zelle emittiert dabei Licht und kann abhängig von Zellgröße, -struktur, intrazellulären Bestandteilen oder gebundenen Antikörpern sortiert und gezählt werden. Die verwendeten Antikörper, die hier zum Einsatz gekommen sind, sind an fluoreszierende Farbstoffe (FITC, PE) gekoppelt und gegen bestimmte Oberflächenmoledüle der DC (CD11c, CD40, CD80, CD86 oder CCR7) gerichtet. Nach der Markierung erfolgt die Sortierung nach diesen Merkmalen. Durch Einsatz verschiedenfarbiger Laser kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und damit die Informationsdichte erhöht werden. In Tabelle 5 ist eine Übersicht zur Vorbereitung der DC und der anschließenden Färbung für die unterschiedlichen Versuchsansätze gegeben.

Tab. 5 Übersicht zur Vorbereitung und Färbung der DC für die FACS-Analyse

CD11c/CD86 CD11c/CD80 CD11c/CD40 CCR7 Zentrifugation der DC und Aufnahme des Zellpellets in sterilem PBS,

Überführung in Roundbottom-wells

Zweimaliges Waschen mit 0,1%igen FACS-Waschpuffer (10 mg BSA auf 10ml PBS)

Vorbereitung der DC

Aufnahme In 50µl PBS und anschließende Färbung

Inkubation des

3.4.1.7. Untersuchung der MAPKinase pp38 mit Hilfe des Westernblots Die für den Westernblot benötigten DC-Proben werden mit einem Lysepuffer versetzt und mit Hilfe einer Proteinbestimmung (Biorad) auf eine gemeinsame Proteinmenge eingestellt (50 µg/30 µl). Die elektrophoretische Auftrennung der Proben erfolgt in der Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Hierfür werden die Proben nach Zugabe des Ladepuffers bei 95°C für 8 Minuten in einem Thermoblock gekocht, um anschließend bei 200 V und 50 mA aufgetrennt zu werden (ca.10 cm Lauflänge). Als Marker für die Molekularmassen dient der Proteinstandard PageRuler^TM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas).

Der Transfer auf eine Nitrozellulosemembran der im SDS-Gel aufgetrennten Proteine erfolgt mit Hilfe einer Transferzelle bei einer angelegten Spannung von 25 V und einer Dauer von 60 Minuten. Danach können im Gel mittels Coomassie^®–Blau die Proteinbanden sichtbar gemacht werden. Die Nitrozellulosemembran wird genutzt, um nach dem Blockierungsvorgang immunogene Proteine durch spezifische Antikörper nachzuweisen. Hierfür wird die Membran zuerst mit dem primären Antikörper (p38 bzw. pp38) beschickt, gewaschen und der sekundäre Antikörper (ECL Anti-rabbit IgG) aufgetragen. Durch die Enhanced chemoluminescence (ECL) werden zum Schluß die Proteine detektiert.

In den Versuchen sind ca. 5-7 Mio. DC/Ansatz zum Einsatz gekommen. Den Proben ist für unterschiedliche Zeiten (15, 30 oder 60 Minuten) Blei in 10 oder 100 µmol/l oder LPS (0,8 µg/ml) zugesetzt worden, um die mögliche Aktivierung der MAPKinase p38 untersuchen zu können. Anschließend sind die Zellen zentrifugiert (220 g, 4 °C, 10 Minuten) und das Zellpellet gewonnen worden. Es ist eine Proteinbestimmung durchgeführt (siehe 3.4.2.8.) und Aliquots gebildet worden, die bei -80 °C eingefroren wurden.

3.4.1.8. T-Zellen: Mixed Leukocyte Reaction (MLR), Vitalität und Proliferation

Bei der heterologen MLR werden T-Zellen einer NMRI-Maus mit DC einer Balb/c-Maus zusammengebracht und nach fünf Tagen mit ³H-Thymidin markiert, um

die Proliferationsrate der T-Zellen als Reaktion auf die behandelten DC bestimmen zu können.

Die dafür verwendeten DC werden zunächst für neun Tage kultiviert und für 24 Stunden mit einem Schwermetall inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe der frisch gewonnenen T-Zellen aus der Milz. Dieser Versuch erfolgte zum einen als Präinkubation, d.h. die DC wurden vor der Zugabe zu den T-Zellen herunterzentifugiert und mit neuem Medium versetzt. Außerdem wurde eine Coinkubation, also ohne vorherigen Mediumwechsel, durchgeführt. Die Aufteilung der T-Zellen war mit 100.000 Zellen /well immer gleich; die der DC änderte sich von well zu well (312, 625, 1.250, 2.500, 5.000, 10.000 DC/ 100µl Medium). Der Ansatz erfolgte in einer Roundbottom-Platte. Am fünften Tag sind die Proben mit 10 µl ³ H-Thymidin (0,005 mCi) markiert und nach 18 Stunden bei -20 °C eingefroren worden.

Ausgewertet wurde die Proliferationsrate der T-Zellen anhand des Scintilationszählers, der die vom eingebauten Thymidin ausgehende β-Strahlung misst.

Zusätzlich ist die Vitalität der T-Zellen und die Proliferation unabhängig von den DC gemessen worden, um darzustellen, dass die verwendeten Schwermetallkonzentrationen nicht toxisch für die T-Zellen sind.

Für die Vitalitätsbestimmung sind die T-Zellen gleichmäßig zu 75.000 TZ bzw.

150.000 TZ/ well in einer Roundbottom-Platte verteilt worden. Als Stimulans diente PHA (5 µg/ml). Zusätzlich sind Schwermetalle in den Konzentrationen 1, 10 und 100 µmol/l für drei Tage zusammen mit den T-Zellen inkubiert worden. Im Anschluß erfolgte ein MTT-Test.

Um die Proliferation der T-Zellen in Abwesenheit der DC bestimmen zu können, sind die T-Zellen in Anlehnung an DUGAN et al. (2004) in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (75.000 und 150.000 TZ/200 µl Medium) aufgeteilt und in eine Roundbottom-Platte überführt worden. Nach Zugabe von unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen und PHA (5 µg/ml) sind die Zellen nach drei Tagen mit Thymidin markiert und 18 Stunden später bei -20 °C eingefroren worden. Die Auswertung erfolgt so wie bei der MLR mit dem Scintilationsgerät.

3.4.2. In-vivo-Untersuchungen

Es wurden zwei unterschiedliche Allergiemodelle für diese Arbeit ausgesucht, um die möglichen Immunmodulationen durch Schwermetalle sowohl in einem Th1-, als auch in einem Th2-induzierten Allergiegeschehen untersuchen zu können.

Insgesamt sind 42 Tiere auf sieben Gruppen verteilt worden (n=6). Neben einer Kontrollgruppe gab es sowohl für das TDI-, als auch für das DNCB-Modell eine Kontrolle. Außerdem wurde innerhalb der beiden Allergiemodelle jeweils eine Gruppe mit 230 bzw. 2300 ppm Bleiacetat behandelt. Das Bleiacetat ist den Tieren über das Trinkwasser ad libitum für insgesamt acht Wochen angeboten worden. Die Bleiacetatkonzentrationen 230 bzw. 2300 ppm entsprechen einem Bleigehalt von 0,126 bzw. 1,265 g/l. Somit ergibt sich eine tägliche Bleiaufnahme von 0,63 bzw.

6,325 mg pro Maus bei einer Wasseraufnahme von durchschnittlich 5 ml.

3.4.2.1. TDI-Kontaktallergiemodell

Die Balb/c-Mäuse sind an vier aufeinander folgenden Tagen mit 5 %igen TDI sensibilisiert worden. Am ersten Tag ist ihnen 100 µl, an den Tagen 2 bis 4 50 µl auf die zuvor rasierte Bauchhaut aufgetragen worden. Für eine bessere Penetration des Allergens durch die Epidermis ist die Hornschicht der rasierten Bauchhaut zusätzlich mit Klebestreifen abgestrippt worden. Am Tag 21 des Versuches erfolgte die Challenge durch wiederholte Applikation von 0,5 %igen TDI (50 µl) auf die Bauchhaut. Am Tag 28 und 29 des Versuches erfolgte die zweite Challenge, allerdings an Ober- und Unterseite der Ohren (je 20 µl 0,5 % TDI) (BÄUMER et al.

2005).

3.4.2.2. DNCB-Kontaktallergiemodell

Die Mäuse wurden zwei Tage lang im DNCB-Modell sensibilisiert. Zuerst ist ihnen 100 µl 1 %iges DNCB in Freundsches Adjuvans gelöst intracutan appliziert worden. Die Wiederholung am darauf folgenden Tag erfolgte mit nur 50 µl der Lösung. Die Challenge mit 0,5 %igem DNCB (je 20 µl) erfolgte 7 Tage später durch lokales Auftragen des Allergens auf die Ohrhaut (BÄUMER et al. 2005).

In Abbildung 9 ist der Aufbau des Tierversuchs schematisch dargestellt.

TDI-Modell DNCB-Modell

Abb. 9 Übersicht zum In-vivo-Versuchsablauf im TDI- und DNCB-Modell

3.4.2.3. Bleibestimmung im Vollblut

Es wurde jeweils eine Sammelblutprobe einer Gruppe in der Atom-absorptionsspektroskopie (AAS) auf ihren Gehalt an Blei gemessen. Hierfür sind die Proben in mehreren Arbeitsschritten vorbereitet worden: 0,5 ml Vollblut ist mit HNO3

für sechs Stunden bei 60°C erwärmt worden. Im Anschluß erfolgte für vier Stunden die Erhitzung mit HNO3 und Salpetersäure bei Temperaturen zwischen 130 und 200 °C. Danach wurden die Proben in einen Glaskolben überführt und gemessen.

3.4.2.4. Untersuchung der allergischen Entzündungsreaktion anhand der Lnn. auriculares und der Ohrdickenmessung

Prinzip der Methode nach EHLING et al. (2005) ist die Gewichtsbestimmung regionaler Lymphknoten nach stattgefundener Entzündungsreaktion. Den Mäusen sind nach der Tötung beide Lnn. auriculares entnommen worden, um deren Gewicht zu bestimmen. Dieses wird durch stimulierte und folglich proliferierte T-Zellen, deren

Sensibilisierung:

Zahl ebenfalls bestimmt wurde, beeinflusst. Die T-Zellproliferation wiederum ist eine Folge der Stimulation durch ausgewanderte DC nach TDI- bzw. DNCB-Kontakt aus dem Entzündungsgeschehen in die regionalen Ohrlymphnoten.

Als zusätzlicher Parameter einer durch die beiden Allergene induzierten, allergischen Entzündungsreaktion dient das Ausmessen der Ohrdicke vor und nach der Challenge mit Hilfe eines Cutimeters (Mitutoyo, Neuss).

3.4.2.5. Untersuchung von Lymphknotenzellen aus den Lnn. auriculares Die für den vorherigen Versuch gewonnenen Lymphknoten sind nach der Gewichtsbestimmung von jeder Maus gesammelt und zerkleinert worden. Im Anschluß ist die jeweilige Zellzahl bestimmt und die Zellen sind für die FACS-Analyse (CD11c/CD40) und die Zellkultur in zwei Gruppen zu je 1 Mio. DC aufgeteilt worden.

In Anlehnung an CUMBERBATCH et al. (2005) sind die DC in der Zellkultur erneut mit TDI bzw. DNBS (dem wasserlöslichen Analogon zu DNCB) inkubiert worden:

Im TDI-Modell sind die DC zunächst für eine Stunde mit 100 µg/ml TDI inkubiert worden (RPMI-Medium ohne Zusatz von FKS). Nach einem Waschvorgang wurde dieser Vorgang wiederholt (RPMI-Medium mit Zusatz von FKS). Es erfolgten ein Mediumwechsel und ein Transfer der Zellen in eine 96er-well-Platte, wo sie für drei Tage bei 37 °C inkubierten. Im Anschluß wurden die Zellen herunterzentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung von IL-4 und IL-1β genutzt.

Die Kultivierung der Zellen aus den DNCB-Gruppen erfolgte ähnlich. Nachdem die Zellen in RPMI-Medium (mit FKS und Pen/Strep) aufgenommen wurden, ist ihnen für drei Stunden DNBS (100 µg/ml) zugesetzt worden. Nach einem Mediumwechsel wurden sie für weitere zwei Tage im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die Zellen sind dann herunterzentrifugiert und die Überstände für die Bestimmung von IFN-γ gewonnen worden.

3.4.2.6. Migrationsassay

In Anlehnung an ORTNER et al. (1996) ist in diesem Versuch die Auswanderungsbereitschaft der DC nach Bleiacetatverabreichung untersucht worden. Hierfür sind die Ohren der Mäuse unmittelbar nach deren Tötung abgetrennt und für 8-10 Minuten zur Desinfektion in 70 % Ethanol aufbewahrt worden.

Anschließend wurden sie luftgetrocknet, um für den Migrationsassay in eine dorsale und ventrale Hälfte getrennt werden zu können. Die dorsale Ohrhälfte ist mit der Epidermis nach oben liegend auf ein dreibeiniges Stahlnetz gelegt und dieses wiederum in ein mit Medium (RPMI-Medium mit FKS, Pen/Strep und MIP-3β) vorbereitete 6well-Platte gestellt worden. Diese Kultur ist für drei Tage im Brutschrank bei 37 °C inkubiert worden, wobei an den Tagen 1 und 2 das Medium gewechselt und mit dem Medium des dritten Tages gepoolt wurden, um die Zahl der ausgewanderten DC bestimmen zu können.

3.4.2.7. Bestimmung von IL-4 aus dem Ohrhomogenat

Zur Bestimmung der Zytokinproduktion in den behandelten Ohren der Mäuse sind diese nach der zervikalen Dislokation entnommen und bei -80 °C aufbewahrt worden. Für die Untersuchungen sind sie unter Flüssigstickstoff zerkleinert und danach in Eppendorfgefäße überführt worden. Nach Zugabe von 150 µl PBS wurden die Proben bei 4 °C für eine Stunde inkubiert und schließlich zentrifugiert, um die Überstände zu gewinnen. Diese wurden mit Hilfe einer Proteinbestimmung auf einen gemeinsamen Proteingehalt eingestellt, um dann die IL-4-Menge der einzelnen Proben im ELISA zu messen.

3.4.2.8. Proteinbestimmung

Es wird zuvor gelöstes Protein in einer Mikrotiterplatte vorgelegt und anschließend mit einem Reaktionsreagenz vermischt. Abhängig vom Proteingehalt kommt es zu einem Farbumschlag der jeweiligen Probe, die durch die Bindung des Reagenz mit dem Protein zustande kommt. Die exakte Proteinmenge wird bei einer Wellenlänge von 595 nm photometrisch gemessen und kann durch eine ebenfalls

gemessene Kalibrationsreihe, angesetzt mit BSA als Standard, in absolute Werte umgerechnet werden.

Die Proteinbestimmung findet in dieser Arbeit zum einen Anwendung bei dem zuvor beschriebenen Ohrhomogenat-Versuch, als auch bei der Einstellung der Proben für den Westernblot.

Die Tabelle 6 gibt einen Überblick über die für die einzelnen Tiergruppen durchgeführten Versuche.

Tab. 6 Überblick der In-vivo-Versuche bei den einzelnen Tiergruppen

Gruppen (Bleigehalt im

Lymphozytenkultur x +TDI:

Messung von

Ohrdickenmessung x x X

Skinmigrationsassay x x X

3.5 Statistische Auswertung

Die Darstellungen der Ergebnisse (DC- und T-Zellvitalität, T-Zellproliferation, TNF-α- und CCL2-ELISA, Migrationsassay, MLR, entzündliche Ohrschwellung, Lymphknotengewicht, -zellzahl, sowie CD11c/CD40-positivie Zellen) erfolgten unter Angabe der Mittelwerte (MW) + Standardabweichung (S.D.).

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm GraphPadPrism. Die mit unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen behan-delten Gruppen sind jeweils mit der Kontrollgruppe bzw. untereinander auf signifikante Differenzen untersucht worden. Hierfür wurde zuerst eine parametrische Varianzanalyse (One-way-Anova) und im Anschluß der Dunnetts Test als post-hoc-Test durchgeführt. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% galt als schwach signifikant; lag sie bei 1%, wurde sie als signifikant bzw. bei 0,1% als hoch signifikant eingestuft. Diese statistischen Durchführungen gelten für alle aufgeführten In-vivo-Ergebnisse und z.T. für die In-vitro-In-vivo-Ergebnisse. Die Ausnahmen hierbei sind die Ergebnisse der MLR und T-Zellproliferation, bei denen ein ungepaarter T-Test als statistische Auswertung gewählt wurde.

Die zugehörigen Einzelwerte aller durchgeführten Versuche sind in dem Anhangskapitel aufgeführt.

4 Ergebnisse

4.1 In-vitro-Untersuchungen

4.1.1. Einfluss der Schwermetalle auf die Vitalität der DC und T-Zellen, sowie auf die Proliferation der T-Zellen

Als Vorraussetzung für die nachfolgenden Untersuchungen ist sowohl bei den DC, als auch bei den T-Zellen die Vitalität mittels MTT-Test gemessen worden (Abb.

4.1-a+b und 4.2). Im Vergleich zur Kontrolle (KO) ist keine signifikante Beeinträchtigung der DC oder T-Zellen durch Inkubation mit den Schwermetallen in unterschiedlichen Konzentrationen zu erkennen. Die Proliferationsrate der T-Zellen nach alleiniger Inkubation mit Schwermetallen sinkt bei beiden Metallen mit zunehmender Konzentration (Abb.4.3).

Abb.4.1-a Vitalität der DC (nach zusätzlicher LPS-Stimulation), Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests am Tag 10 der Kultur; Stimulation durch Schwermetalle am Tag 8 und durch LPS am Tag 9 der Kultur; die Probenanzahl beträgt n=4; die Versuche wurden dreimal durchgeführt; Einzelwerte siehe Tab.9-1 A und G im Anhang

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

KO LPS 1 10 100 1 10 100

Optische Dichte

µmol/l Blei+LPS Mangan+LPS

Abb.4.1-b Vitalität der DC, Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests am Tag 10 der Kultur; Stimulation durch Schwermetalle am Tag 8 der Kultur.

Die Probenanzahl beträgt n=4; es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von drei Versuchsdurchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-1 J und D im Anhang

Abb. 4.2 Vitalität der T-Zellen, Messung der Extinktion nach Durchführung eines MTT-Tests. Die T-Zellen (75.000 TZ/ 200 µl Medium) wurden mit Blei bzw. Mangan über drei Tage mit Zusatz von 5 µg/ml PHA als Stimulans inkubiert, die Proben-anzahl beträgt n=6; es wurden drei Versuche durchgeführt. Einzelwerte siehe Tab.9-2 A und D im Anhang

Abb.4.3 ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Blei bzw. Mangan. Die Proliferation der T-Zellen nimmt im Vergleich zur Kontrolle mit steigender Schwermetallkonzentration ab; ein signifikanter Unterschied besteht zwischen der Kontrolle und Blei 100 µmol/l (*p < 0,05), die Probenanzahl beträgt n=6, es wurden drei Versuche durchgeführt. Einzelwerte siehe Tab.9-3 A und D im Anhang

4.1.2. Einfluss von Blei und Mangan auf die TNF-α-Produktion

Das proinflammatorische Zytokin TNF-α ist in diesem Versuch aus den Kulturüberständen zuvor stimulierter DC durch Schwermetalle bestimmt worden. Bei zusätzlicher LPS-Stimulation steigt die Zytokinmenge ebenso wie bei nur LPS-stimulierten DC. Fällt die LPS-Stimulation weg, liegt die Sekretion auf Kontrollniveau (Abb. 4.4a+b).

0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000

KO ^{1 10 100 1 10 100}

³H-Thymidin (cpm)x10³

Blei Mangan

*

µmol/l

Abb.4.4-a TNF-α-Produktion durch DC (nach zusätzlicher LPS-Stimulation)

Dargestellt ist die Extinktion als optische Dichte. Ein Anstieg der Zytokinausschüttung findet nur im Zusammenhang mit einer LPS-Stimulation statt; die Probenanzahl beträgt n=4. Es handelt sich um repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen.

Einzelwerte siehe Tab.9-4 C und H im Anhang

Abb.4.4-b TNF-α-Produktion durch DC

Dargestellt ist die Extinktion als optische Dichte. Ein Anstieg der Zytokinausschüttung durch Blei oder Mangan findet nicht statt; die Probenanzahl beträgt n=4. Es handelt sich um repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-4 E und K im Anhang

4.1.3. Beeinflussung der DC durch Schwermetalle im Migrationsassay In der Boyden Chamber ist das Auswanderverhalten der DC nach Schwer-metallinkubation untersucht worden. Das Auswanderverhalten der DC nimmt nach Stimulation mit LPS nur leicht zu (Abb.4.5). Nach einer zusätzlichen Inkubation mit Blei 100 µmol/l kommt es zu einem signifikanten Anstieg der Migrationsbereitschaft gegenüber der Kontrolle (Abb.4.6-a). Innerhalb der Bleigruppe sieht man einen dosisabhängigen Anstieg bei der Migration. Bei der Inkubation mit Mangan (100 µmol/l) steigt das Auswanderverhalten der DC signifikant (Abb. 4.6-b).

Abb.4.5 Migrationsassay unter LPS-Stimulation, kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und LPS-stimulierten DC. Der Versuch ist mit einer Probenanzahl von n=4 dreimal durchgeführt worden. Einzelwerte siehe Tab.9-5 A im Anhang

0 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000

Kontrolle LPS

ausgewanderte DC/ml

Abb.4.6-a Migrationsassay unter Bleiinkubation und LPS-Stimulation, signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Blei 100 µmol/l nach 90 Minuten Inkubation (*p < 0,05). Die Probenanzahl ist n=4; der Versuch wurde dreimal durchgeführt.

Einzelwerte siehe Tab.9-5 A im Anhang

Abb.4.6-b Migrationsassay unter Manganinkubation und LPS-Stimulation, signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Mangan 100 µmol/l nach 90 Minuten Inkubation (*p < 0,05). Die Probenanzahl beträgt n=3; es ist ein repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen. Einzelwerte siehe Tab.9-5 D im Anhang

4.1.4. Untersuchung der Expression von Oberflächenmolekülen in der FACS- Analyse

Der Rezeptor CCR7 auf reifenden DC wird für das Auswandern in den drainierenden Lymphknoten benötigt. In der Tab.4.1 sind zwei unterschiedliche Versuchsansätze mit ihren Ergebnissen dargestellt: zum einen der Anteil der DC, die CCR7 nach LPS-Stimulation bzw. Bleiinkubation exprimieren (A); zum anderen die DC, die im MIgrationsassay ausgewandert sind und in Folge der dadurch induzierten Maturation CCR7 exprimieren (B). Die Untersuchungen beschränken sich auf Blei und Mangan in jeweils einer Konzentration, da dieser Ansatz als orientierend anzusehen ist.

Tab. 4.1 Expression von CCR7 durch DC nach LPS-/Bleikontakt, sowie Auswan- derung im Migrationsassay nach Manganinkubation, repräsentatives Ergebnis von zwei Durchführungen; Einzelwerte siehe Tab.9-6 im Anhang;

Anzahl der CCR7-exprimierenden DC

(Zellzahl / %)

A Kontrolle 8.500 / 1,7

LPS 30.900 / 6,18

Pb 100 µmol/l 46.600 / 9,32

Anzahl der CCR7-exprimierenden DC

(Zellzahl / %)

Anzahl CCR7-exprimierenden DC im

Migrationsassay (Zellzahl / %)

B Kontrolle 300 / 0,06 58.100 / 11,62

LPS 10.000 / 2 43.800 / 8,76

Mn 10 µmol/l 25.100 / 5,02 73.600/ 14,7

Zum einen ist zu erkennen, dass allein durch das Schwermetall die DC eine stärkere Expression von CCR7 zeigen (A). Im Migrationsassay ist zum anderen die CCR7-Expression sowohl durch das Auswandern, als auch durch die zusätzliche Stimulation mit Mangan gesteigert (B).

In den Abb. 4.7-a+b ist die Expression von CCR7 durch die DC anhand von Histogrammen gezeigt. Hierbei wird die gesteigerte CCR7-Expression von DC, die

In den Abb. 4.7-a+b ist die Expression von CCR7 durch die DC anhand von Histogrammen gezeigt. Hierbei wird die gesteigerte CCR7-Expression von DC, die

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