3.5 Statistische Auswertung
4.1.6. Wirkung der Schwermetalle auf die T-Zellproliferation in der MLR
Stimulation durch DC gemessen. Insgesamt wurden zwei unterschiedliche Versuchsansätze durchgeführt. Zum einen erfolgte die MLR anhand einer Inkubation der DC nach vorheriger Schwermetallinkubation (Abb.4.10-a-c). Als zweites ist aus den Überständen dieses Ansatzes die Konzentration des Chemokins CCL2 gemessen worden (Abb. 4.10-d+e).
Es zeigt sich bei allen drei Bleikonzentrationen (1, 10 und 100 µmol/l) ein Anstieg der T-Zellproliferation proportional zur DC-Anzahl (siehe Abb. 4.9 a-c). Bei der Inkubation mit Mangan 1-100 µmol/l erfolgten ähnliche Ergebnisse; diese sind im Anhang aufgeführt.
Abb.4.10-a ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Blei (1 µmol/l); schwach signifikanter bzw. hoch signifikanter Unterschied zwischen
der Kontrolle und Blei 1 µmol/l; dieser Versuch wurde dreimal reproduziert (Einzelwerte siehe Anhangstabelle), die Probenanzahl beträgt n=6; * p > 0,05,
*** p<0,001; Einzelwerte siehe Tab.9-7 B im Anhang 0
312 625 1.250 2.500 5.000 10.000 Anzahl DC
Abb.4.10-b ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Blei (10 µmol/l); stark signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Blei 10 µmol/l, dieser Versuch wurde dreimal reproduziert (Einzelwerte siehe
Anhangstabelle); die Probenanzahl beträgt n=6; *** p > 0,001; Einzelwerte siehe Tab.9-7 B im Anhang
Abb.4.10-c ³H-Thymidin-Einbaurate (cpm) in T-Zellen bei Inkubation mit Blei (100 µmol/l); signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und Blei 100 µmol/l, dieser Versuch wurde dreimal reproduziert (Einzelwerte siehe Anhangstabelle), die Probenanzahl beträgt n=4; ** p > 0,01, *** p < 0,001 ; Einzelwerte siehe Tab.9-7 B im Anhang
0
312 625 1.250 2.500 5.000 10.000
Kontrolle
Am Tag 4 der MLR sind vor der Thymidinmarkierung Überstände für die Bestimmung von CCL2 und TNF-α entnommen worden. In dem TNF-α-ELISA zeigten sich keine Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen, und deshalb sind sie nicht aufgeführt (Einzelwerte siehe Tab.9-9 im Anhang).
Für die CCL2-Gewinnung erfolgte folgender Ansatz: in Abb.4.10-d+e sind Kontroll-DC solchen DC gegenübergestellt, die zuvor mit Blei (100 µmol/l) als Prä- oder Coinkubation stimuliert wurden. Hierbei zeigt sich ein signifikanter Rückgang des CCL2-Gehaltes sowohl bei der Prä-, als auch bei der Coinkubation der bleiinkubierten DC im Vergleich zur Kontrolle.
Abb.4.10-d Bestimmung des CCL2-Gehalts aus Überständen der MLR mit Blei 100 µmol/l (Präinkubation), signifikante Reduktion jeweils in den zwei größeren
DC-Gruppen (2.500 und 10.000 DC), repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen, die Probenanzahl beträgt n=4, * p < 0,05; Einzelwerte siehe Tab.9-8 B im Anhang
0 20 40 60 80 100 120
312 2.500 10.000 312 2.500 10.000
pg/ml CCL2
*
Kontrolle Blei 100 µmol/l
Präinkubation
Anzahl DC
*
Abb.4.10-e Bestimmung des CCL2-Gehalts aus Überständen der MLR mit Blei 100 µmol/l (Coinkubation), signifikante Reduktion jeweils in den zwei größeren
DC-Gruppen (2.500 und 10.000 DC), repräsentatives Ergebnis von drei Durchführungen, die Probenanzahl beträgt n=4, * p < 0,05; Einzelwerte siehe Tab.9-8 B im Anhang
0 20 40 60 80 100 120
312 2.500 10.000 312 2.500 10.000
pg/ml CCL2
*
Kontrolle
Anzahl DC
*
Blei 100 µmol/l Coinkubation
4.2 In-vivo-Untersuchungen 4.2.1. Bleiwerte im Vollblut
In den beiden Kontaktallergiemodellen mit TDI und DNCB ist den Mäusen über einen Zeitraum von insgesamt sieben bzw. acht Wochen Bleiacetat in zwei Konzentrationen über das Trinkwasser verabreicht worden. Die Bleikonzentrationen im Vollblut sind aus den Blutproben, die unmittelbar nach der Tötung entnommen wurden, bestimmt worden. Die Abb. 4.11 zeigt die Werte der Kontrollgruppen (Kontrolle, TDI und DNCB), sowie der mit 230 ppm und 2300 ppm Bleiacetat behandelten TDI- und DNCB-Gruppen. Die Bleiacetatkonzentrationen 230 bzw. 2300 ppm entsprechen einer Bleikonzentration von 0,126 bzw. 1,265 g/l im Trinkwasser.
Es ist ein dosisabhängiger Anstieg der Bleikonzentrationen im Vollblut zu den Mengen im Trinkwasser bei beiden Gruppen zu sehen. Die Bleibelastung der DNCB-Gruppe fällt insgesamt geringer aus; ihnen wurde im Gegensatz zur TDI-DNCB-Gruppe nur sieben, anstatt acht Wochen Bleiacetat verabreicht.
Abb. 4.11 Konzentrationen von Blei im Vollblut (µg/dl) der Mäuse aus den Kontroll-, TDI- und DNCB-Gruppen, Messung von je einer Sammelblutprobe pro Gruppe. Es stellt sich ein dosisabhängiger Anstieg innerhalb beider Gruppen der Kontaktallergiemodelle dar. Einzelwerte siehe Tab.9-10 im Anhang
0
µg/dl Bleigehalt im Vollblut
Kontrolle
TDI-Modell DNCB-Modell g/l Blei im Trinkwasser
4.2.2. Einfluss von Blei auf die entzündliche Ohrschwellung
Die in diesem Versuch durch die Kontaktallergene TDI bzw. DNCB induzierte Ohrschwellung nimmt gegenüber der Kontrolle signifikant zu und konnte durch die zusätzliche Verabreichung von 1,265 g/l Blei im TDI-Modell signifikant gesteigert werden; bei 0,126 g/l Blei ist kein Effekt erkennbar (Abb. 4.12-a). Im DNCB-Modell haben keine der beiden Bleikonzentrationen eine Wirkung auf die Entzündungsreaktion (Abb. 4.12-b).
Abb. 4.12-a Messung der Ohrschwellung (µm) 24 h nach der TDI-Challenge;
Es kommt zu einer schwach signifikanten Steigerung der Ohrschwellung durch TDI + 1,265 g/l Blei, die Anzahl der Proben ist n=4, * p< 0,05, *** p< 0,001
Abb. 4.12-b Messung der Ohrschwellung (µm) 24 h nach der DNCB-Challenge;
Es kommt nicht zu einer signifikanten Änderung nach der Bleizugabe, aber zu einer stark signifikanten Steigerung von DNCB-behandelten Mäusen gegenüber unbehandelten Mäusen; die Probenanzahl beträgt n=6; *** p< 0,001; Einzelwerte siehe Tab.9-11 b) im Anhang
0
4.2.3. Einfluss von Blei auf die lokalen Lymphknoten (Lnn. auriculares) In den Abb.4.13-a+b ist das Lymphknotengewicht der TDI- bzw. DNCB-sensibilisierten Tiere nach Verabreichung von Blei im Vergleich zu den Kontrollen (Kontrolle, TDI und DNCB) aufgeführt. Es wurden beide Lymphknoten einer Maus entnommen und gewogen. Die Ergebnisse sprechen für keine Beeinflussung des Gewichts durch Blei, lediglich die Sensibilisierung durch TDI und DNCB führen, wie erwartet, zu einer Gewichtszunahme in beiden Gruppen.
Abb.4.13-a Gewichte der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere bei gleichzeitiger Bleiverabreichung (0,126 und 1,265 g/l); es kommt zu keinen signifikanten Unterschieden innerhalb der TDI-Gruppe, aber TDI gegenüber Kontrolle; die Probenanzahl beträgt n=6; ** p < 0,01
Abb.4.13-b Gewichte der Lnn. auriculares DNCB-sensibilisierter Tiere bei gleichzeitiger Bleiverabreichung (0,126 und 1,265 g/l), keine signifikanten Unterschiede innerhalb der DNCB-Gruppe oder gegenüber der Kontrolle, die
0
Zusätzlich zu dem Gewicht ist die Zellzahl der isolierten Lnn. auriculares für die spätere FACS-Analyse bestimmt worden; analog zu dem Lymphknotengewicht ist auch hier kein signifikanter Unterschied in den beiden Gruppen zu sehen (Abb.4.14-a+b).
Abb.4.14-a Zellzahl der Lnn. auriculares TDI-sensibilisierter Tiere bei gleichzeitiger Bleiverabreichung (0,126 und 1,265 g/l), keine signifikanten Unterschiede innerhalb der TDI-Gruppe, lediglich zwischen der Kontrolle und TDI+0,126 bzw. 1,265 g/l, die Probenanzahl beträgt n=6, * p < 0,05
Abb.4.14-b Zellzahl der Lnn. auriculares DNCB-sensibilisierter Tiere bei gleichzeitiger Bleiverabreichung (0,126 und 1,265 g/l), keine signifikanten Unterschiede innerhalb der DNCB-Gruppe oder gegenüber der Kontrolle; die Probenanzahl ist n=6. Einzelwerte siehe Tab.9-11 d) im Anhang
0
Im Anschluß an die Zellzahlbestimmung der Lymphknoten ist in der FACS-Analyse die Menge der CD11c- und CD40-positiven DC untersucht worden. Der Kontrollgruppe sind die beiden Gruppen der Kontaktallergene TDI und DNCB gegenübergestellt. Es kommt lediglich in der TDI-Gruppe bei zusätzlicher Bleistimulation (0,126 g/l) zu einer erhöhten Expression von CD11c/CD40. In der DNCB-Gruppe zeigt Blei keinen Effekt auf die Expression der untersuchten Oberflächenmoleküle. Die Ergebnisse sind als Dotplots dargestellt:
In Abb. 4.15-a ist die Kontrollgruppe und in den folgenden Abbildungen je eine Darstellung aus den TDI-Gruppen (Abb.4.15-b-d) bzw. DNCB-Gruppen (Abb.4.15-e-g) aufgeführt. Es handelt sich hierbei um ein repräsentatives Ergebnisse von jeweils sechs aus den einzelnen Gruppen (Kontrolle, TDI/DNCB – 0/ 0,126/
1,265 g/l Blei).
Auf der x-Achse ist CD40, auf der y-Achse CD11c aufgetragen. Die
CD11c/CD40-positiven DC befinden sich im oberen rechten Quadranten.
Abb.4.15-a Dotplot von Lymphknoten- Abb.4.15-b Dotplot von Lymphknoten- zellen aus der Kontrollgruppe, die zellen von TDI-behandelten Mäusen, CD11c/CD40-positiven Zellen befinden leichter Anstieg der CD11c/CD40 – sich im Quadranten C2 positiven Zellen
CD11c
CD40
Abb. 4.15-c Dotplot von Lymphknoten- Abb.4.15-d Dotplot von Lymphknoten- zellen aus der TDI-Gruppe + 0,126 g/l zellen aus der Gruppe TDI + 1,265 g/l Blei, zunehmende Expression von Blei, Abnahme der Expression auf CD11c/CD40 Niveau der Zellen aus der TDI-Gruppe
Auf der x-Achse ist CD11c, auf der y-Achse CD40 aufgetragen. Die CD11c/CD40-positiven DC befinden sich im oberen rechten Quadranten.
Abb.4.15-e Dotplot von Lymphknoten- Abb.4.15-f Dotplot von Lymphknoten- zellen aus der DNCB-Gruppe, zellen aus der Gruppe DNCB +
zunehmende Expression von 0,126 g/l Blei, Abnahme der Ex- CD11c/CD40 pression auf Kontrollniveau
CD40
CD11c
Abb. 4.15-g Dotplot von Lymphknotenzellen aus der Gruppe DNCB + 1,265 g/l Blei, keine gesteigerte Expression durch zusätzliche Blei- stimulation
In den Abb. 4.16-a+b sind die in der FACS-Analyse bestimmten DC auf die vorher bestimmte Zellzahl bezogen dargestellt. Hierbei ist ein signifikanter
Unterschied zwischen der nicht stimulierten Kontrollgruppe und der TDI-sensibilisierten Gruppe zu sehen.
Abb.4.16-a Analyse der Lymphknotenzellen im Durchflußzytometer, Darstellung der CD11c/CD40-positiven DC der Kontroll- und TDI-Gruppe, signifikanter Unterschied zwischen KO und TDI, die Probenanzahl beträgt n=6; * p < 0,05
Abb.4.16-b Analyse der Lymphknotenzellen im Durchflußzytometer, Darstellung der CD11c/CD40-positiven DC der DNCB-Gruppe, keine signifikanten Unterschiede innerhalb der DNCB-sensibilisierten Gruppe und gegenüber der Kontrolle, die Probenanzahl ist n=6; Einzelwerte siehe Tab.9-12 im Anhang
0
4.2.4. Ergebnisse der Migrationsassays
Das Auswanderverhalten der Zellen aus den von den Versuchstieren gewonnenen Ohrhälften ist in diesem Versuch untersucht worden. In den Abb.4.17-a+b erkennt man einen leichten Anstieg ausgewanderter DC abhängig vom Bleigehalt im Trinkwasser. Signifikante Unterschiede sind allerdings nicht festzustellen.
Abb.4.17-a Migrationsassay im TDI-Modell, keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen, lediglich ein leichter Anstieg ausgehend von der Kontroll-, über die TDI- und die TDI- und bleibehandelte Gruppe, die Probenanzahl beträgt n=6.
0 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000
0 0 0,126 1,265
ausgewanderte DC/ml
g/l Blei TDI
Kontrolle
Abb.4.17-b Migrationsassay im DNCB-Modell, keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen, die Probenanzahl beträgt n=6. Einzelwerte siehe Tab.9-11 a) im Anhang
4.2.5. Einfluss von Blei auf die Lymphknotenzellen
Die aus den Lymphknoten gewonnenen Zellen sind in einer Zellkultur erneut mit TDI bzw. DNBS (DNCB-Analogon) inkubiert und die Überstände vor der Thymidinmarkierung gewonnen worden. Aus diesen Überständen ist der Gehalt an IL-4, IL-1β und IFN-γ bestimmt worden. Die Ergebnisse sind nicht aufgeführt, da in keinem der drei ELISA eine Änderung der Zytokinsekretion zu erkennen war (Einzelwerte siehe Tab.9-15 A-C im Anhang).
In Abb. 4.18-a+b sind die Einbauraten des Thymidin durch DC als Zeichen der Proliferation dargestellt. Es kommt zu keinerlei Signifikanz bei der TDI- oder DNCB-Gruppe.
0 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 14.000
0 0 0,126 1,265
ausgewanderte DC/ml
g/l Blei Kontrolle DNCB
Abb.4.18-a ³H-Thymidin-Einbaurate in der Kontroll- und TDI-Zellkultur, kein signifikanter Unterschied durch die Verabreichung von Blei im Vergleich zur Kontrolle oder innerhalb der TDI-Gruppe, die Probenanzahl beträgt n=6.
Abb.4.18-b ³H-Thymidin-Einbaurate in der DNCB-Zellkultur, kein signifikanter Unterschied durch die Verabreichung von Blei, die Probenanzahl beträgt n=6.
Einzelwerte siehe Tab.9-13 im Anhang
0 200 400 600 800 1.000 1.200
0 0 0,126 1,265
³H-Thymidin (cpm)x10³
g/l Blei
0 200 400 600 800 1.000 1.200
0 0 0,126 1,265
³H-Thymidin (cpm)x10³
g/l Blei Kontrolle DNCB Kontrolle
TDI
4.2.6. Einfluss von Blei auf die IL4-Produktion im Kontaktallergiemodell Aus den Homogenaten der im Versuch gewonnenen sensibilisierten Mäuseohren ist der Gehalt an IL-4 gemessen worden. Die Abb.4.19 gibt einen Überblick aller sieben Gruppen, wobei nur bei TDI und TDI + 1,265 g/l Blei im Vergleich zur Kontrolle ein signifikant höherer IL4-Gehalt induziert wird. Innerhalb der TDI-Gruppe ist kein Unterschied zu sehen. Die IL4-Produktion durch die DNCB-Gruppe liegt auf Kontrollniveau und hat im Zusammenhang mit Blei keinerlei Wirkungen auf die IL4-Produktion durch die DC.
Abb.4.19 IL-4-Produktion aus in vivo gewonnenen Ohren und deren Homogenate,
schwach signifikante Induktion der IL-4-Produktion durch TDI, sowie TDI+1,265 g/l Blei gegenüber der Kontrolle, in der DNCB-Gruppe ist keine IL4-Induktion erkennbar; die Probenanzahl beträgt n=6; * p< 0,01; Einzelwerte siehe
Tab.9-14 im Anhang
Zu allen aufgeführten Ergebnissen sind in dem Kapitel Anhang zusammen mit Ergebnissen aus weiteren Versuchen alle Einzelwerte dargestellt.
0 50 100 150 200 250 300
0 0 0,126 1,265 0 0,126 1,265
IL-4 (pg/ml)
g/l Blei
Kontrolle TDI DNCB
*
*
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Zellfunktionen von murinen DC und T-Zellen durch Schwermetalle zu gewinnen. Als Schwermetalle sind Blei und Mangan, in den Vorversuchen zusätzlich Zink, Kupfer und Cadmium, zum Einsatz gekommen. Die In-vitro-Untersuchungen sind durch In-vivo-Untersuchungen anhand zweier Kontaktallergiemodelle ergänzt worden, in denen ein durch TDI bzw. DNCB induziertes Allergiegeschehen an bleibelasteten Mäusen untersucht wurde.
5.1 Einfluss der Schwermetalle auf die DC- und T-Zellfunktionen
5.1.1. Einfluss der Schwermetalle auf die Vitalität sowie auf die p38-Aktivierung
Durch die Inkubation der DC und T-Zellen mit Mangan und Blei in den Konzentrationen 1, 10 und 100 µmol/l wird die Vitalität nicht beeinträchtigt. Dieses bestätigt die Ergebnisse von SMITH und LAWRENCE (1988), sowie KOWOLENKO et al. (1991).
Es konnte gezeigt werden, dass es bei den DC zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Aktivierung der MAPKinase p38 durch Blei kommt. p38 wird zum einen durch LPS aktiviert, was als Positivkontrolle genutzt wurde, und andererseits durch Blei in den Konzentrationen 10 und 100 µmol/l.
Diese Aktivierung der MAPKinasen ist ein Zeichen der DC-Maturation einhergehend mit einer Phänotypveränderung und Produktion diverser Zytokine (vor allem TNF-α). Es gibt insgesamt drei MAPKinasen, die durch Streßstimuli oder inflammatorische Zytokine (JNK und p38) bzw. Aktivierung von Tyrosinkinasen (ERK) phosphoryliert werden. Allen drei ist gemeinsam, dass sie über einen Signalweg aktiviert werden, bei dem es zur Phosphorylierung unterschiedlicher
Substrate, u.a. Proteinkinasen, Phospholipasen und Transkriptionsfaktoren, kommt.
Diese intrazelluläre Signalkaskade kann zur Zellproliferation, -differenzierung oder Apoptose führen.
Studien mit dem p38-Inhibitor SB203580 an zuvor mit Nickel stimulierten DC zeigen, dass die Expression von CD83 und CD86, sowie die Induktion der Zytokine TNF-α, IL-6 und IL-12 durch diesen Inhibitor gehemmt werden können (AIBA et al.
2003). Dies lässt auf eine Abhängigkeit der p38-Aktivierung schließen. Insgesamt können alle drei MAPKinasen gleichzeitig aktiviert werden, was zur Expression verschiedener Oberflächenmoleküle und Produktion diverser Zytokine führt, die im Anschluß für eine Differenzierung der T-Zellantwort sorgen.
In den eigenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Blei zur Phosphorylierung von p38 führt und nachfolgend eine intrazelluläre Kaskade ausgelöst wird. Aufgrund eigener Ergebnisse (siehe 5.1.3.+5.) lässt sich in diesem Zusammenhang die Vermutung stellen, dass durch die p38-Aktivierung eine CCR7- und CD80-Expression induziert wird. Vermutlich ist die Expression von CD86 von der Aktivierung weiterer MAPKInasen abhängig, die wiederum auf bestimmte Stimuli in Form von Zytokinen angewiesen ist. Hier könnte ebenso die ausbleibende TNF-α-Sekretion eine größere Rolle spielen (siehe 5.1.2.). BOISLEVE et al. (2004) zeigen in diesem Zusammenhang eine Expression von CD86 der DC, die mit TNF-α stimuliert wurden, obwohl sie zuvor mit spezifischen Inhibitoren aller drei MAPKinasen behandelt wurden. Eine weitere Ursache für eine ausbleibende MAPKinasen-Aktivierung könnte die ausgewählte Schwermetallkonzentration sein. In eigenen Versuchen sind Konzentrationen von 10 und 100 µmol/l eingesetzt worden.
BOISLEVE et al. (2004) sehen nach Inkubation mit 500 µmol/l Nickel eine Aktivierung aller drei MAPKinasen.
5.1.2. Einfluss von Blei und Mangan auf die TNF-α-Produktion durch DC Blei und Mangan führen nur in Verbindung mit LPS zu einer erhöhten TNF-α-Sekretion. Werden DC nur mit den Schwermetallen inkubiert, kommt es nicht zu einer gesteigerten TNF-α-Produktion. TNF-α spielt als proinflammatorisches Zytokin eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Maturation, sowie der Expression diverser
Oberflächenmoleküle von DC (AIBA 1998). Neben den DC sind Keratinozyten, aktivierte Makrophagen und T-Zellen in der Lage, TNF-α zu produzieren, um im Entzündungsgeschehen weitere Zellen zu mobilisieren (SPIEKSTRA et al. 2005).
Die zuvor beschriebene Aktivierung von p38 läßt eine erhöhte Produktion von TNF-α durch Schwermetalle vermuten. DE SMEDT et al. (2001) beschreiben ebenfalls eine TNF-α-Induktion durch Nickel in den Konzentrationen 10 und 100 µmol/l. Sie verweisen aber gleichzeitig auf Studien von ENK und KATZ (1992) sowie MANOME et al. (1999), die eine gesteigerte TNF-α-Produktion nach Inkubation mit höheren Konzentrationen (300 µmol/l) von Nickel bzw. Mangan feststellten. In den eigenen Untersuchungen wurden Konzentrationen im Bereich von 1 bis 100 µmol/l Blei bzw. Mangan verwendet. Damit liegen diese Werte unter den Konzentrationen, die von ENK und KATZ (1992), sowie MANOME et al. (1999) zum Einsatz kamen. Dies lässt die Vermutung zu, dass die Konzentration der Schwermetalle ausschlaggebend für eine TNF-α-Induktion ist. In einer Studie von SHI et al. (2005) wird außerdem eine TNF-α-Aktivierung auf RNA-Ebene ohne nachweisliche Proteinsynthese dargestellt. Es wäre zu klären, ob es bei eigenen Versuchsansätzen ebenfalls zu einer Aktivierung auf RNA-Ebene durch höhere Schwermetallkonzentrationen kommt, da eine nachweisbare TNF-α-Ausschüttung in Kulturüberständen bislang ausblieb.
5.1.3. Einfluss von Blei und Mangan auf die CCR7-Expression
Mittels Durchflußzytometrie konnte gezeigt werden, dass es durch Inkubation mit Blei (100 µmol/l) bzw. Mangan (10 µmol/l) zu einer gesteigerten Expression von CCR7 kommt. Es sollte hier jedoch vielmehr die grundsätzliche Interaktion von Schwermetallen und DC gezeigt werden. Im Ergebnis zeigt sich lediglich die Tendenz einer steigenden CCR7-Expression durch Schwermetallinkubation.
CCR7 gilt als ein Oberflächenmolekül, das nur von reifen DC nach Aktivierung von der MAPKinase p38 exprimiert wird. Dieser Rezeptor ermöglicht es den DC, nach Antigenaufnahme in den drainierenden Lymphknoten zu wandern, um dort über T-Zell-Interaktion eine Immunantwort zu initiieren (BOISLEVE et al. 2004;
Im Zusammenhang mit dem Migrationsassay (siehe 5.1.4.) konnte ein stimulierender Effekt der beiden Schwermetalle auf die DC gezeigt werden. Dieser wird durch die erhöhte CCR7-Expression nochmals unterstützt. BOISLEVE et al.
(2004) beschreiben die Induktion von CCR7 nach Inkubation der DC mit 500 µmol/l Nickel, sowie mit TNF-α (500 U/ml). Der Schwerpunkt ihrer Untersuchungen liegt in der Beeinflussung der CCR7-Induktion durch die MAPKinase p38 (siehe 5.1.1.).
RITTER et al. (2004) zeigen, dass CCR7 ein eindeutiger Hinweis für die Maturation der DC ist. Sie stimulieren DC mit LPS oder TNF-α und weisen die Expression von CCR7 neben den Aktivierungsmarkern CD86, CD40 und MHCII in der Durchflußzytometrie nach.
Ein zusätzlicher Stimulus für die CCR7-Expression scheint die Migration per se zu sein. Vergleicht man den Anteil CCR7-positiver DC vor und nach der Migration in der Boyden Chamber, fällt auf, dass es zu einem Anstieg von CCR7 kommt.
Vermutlich lässt sich dieser Effekt mit dem Zusatz von MIP-3β zur Kultur erklären.
Diese Substanz ist der Ligand von CCR7 und wird in vivo von maturierten DC und von Stromazellen in der T-Zellregion im Lymphknoten sezerniert, um antigenführende DC zu naiven T-Zellen zu leiten (RIOL-BLANCO et al. 2005).
Hieraus folgt, dass zunächst eine Induktion der DC-Maturation durch Schwermetalle erfolgt, und die DC schließlich auf die chemotaktische Substanz MIP-3β reagieren. Daraufhin wird der MIP-3β-Rezeptor CCR7 auf den DC exprimiert und die Zellen sind in der Lage auszuwandern. Die Bedeutung der DC-Maturation hinsichtlich der Migration, und damit einhergehend das Erzeugen eines proinflammatorischen Zustands, zeigt sich in Untersuchungen von VANBERVLIET et al. (2002). Hier wurde gezeigt, dass die beiden CCR7-Liganden MIP-3β und CCL21 keinerlei Wirkung auf das Migrationsverhalten immaturer DC haben.
5.1.4. Beeinflussung der DC-Migration durch Schwermetalle
In einem Migrationsassay kann ein signifikanter Anstieg der Migrationsrate der DC nach Inkubation mit Blei bzw. Mangan in der jeweils höchsten Konzentration (100 µmol/l) im Vergleich zur Kontrolle gezeigt werden. AIBA et al. (2000) zeigen
diesen Effekt anhand dendritischer Zellen, die zuvor mit Nickel (300 µmol/l) bzw. LPS stimuliert wurden. In einem Migrationsassay wird - ebenso wie in dieser Arbeit - eine erhöhte Migrationsbereitschaft auf das Chemokin MIP-3β dargestellt. Diese erhöhte DC-Migration findet in Abhängigkeit einer gesteigerten MIP-3β-Konzentration statt und nicht wie in der vorliegenden Arbeit von einer steigenden Blei- bzw. Mangan-konzentration; die MIP-3β-Konzentration ist mit 50 ng/ml in allen Versuchsansätzen konstant.
Voraussetzung für eine DC-Migration ist die Auslösung ihrer Maturation.
Nachdem die DC Antigene entdeckt haben, werden diese gebunden und per rezeptorvermittelter Endozytose internalisiert. Es erfolgt eine Veränderung des DC-Phänotyps einhergehend mit verstärkter Expression costimulatorischer Moleküle (CD80, CD86, MHCII, CD40) und Ausschüttung unterschiedlicher Zytokine (z.B. IL-6, IL-12, IL-1β, TNF-α, CCL2) (AIBA 1998).
Die eigenen Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Schwermetalle Blei und Mangan in höheren Konzentrationen einen Stimulus für die DC darstellen und die Maturation in Form einer gesteigerten Migrationsbereitschaft der DC beeinflussen. Die DC sind nun in der Lage, auf MIP-3β zu reagieren und antworten mit einer gesteigerten Migrationsbereitschaft. Es ist gezeigt worden, dass das Auswandern der DC zum drainierenden Lymphknoten in vivo im Zusammenhang mit der Expression des CCR7-Rezeptors steht (FORSTER et al. 1999; AIBA et al. 2000;
BOISLEVE et al. 2004). Die geringe Migration der unbehandelten DC ist als Spontanmigration zu deuten und ist Ausdruck der physiologischen steady state migration. Diese DC weisen im Gegensatz zu den mit Schwermetallen behandelten
BOISLEVE et al. 2004). Die geringe Migration der unbehandelten DC ist als Spontanmigration zu deuten und ist Ausdruck der physiologischen steady state migration. Diese DC weisen im Gegensatz zu den mit Schwermetallen behandelten