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Pharmakologische Beeinflussung muriner dendritischer Zellen durch
nichtsteroidale und steroidale Antiphlogistika
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Stefanie Claudia Krekeler
aus StarnbergHannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005
Die Arbeit wurde durch ein Promotionsstipendium der Wilhelm Schaumann- Stiftung gefördert.
Meinen lieben Eltern
gewidmet
2 Literaturübersicht... 12
2.1 Dendritische Zellen... 12
2.1.1 Herkunft und Entwicklung immaturer DC und DC-Vorläufer ... 13
2.2 Langerhans-Zellen und interstitielle dendritische Zellen... 15
2.3 Murine DC aus dem Knochenmark ... 17
2.4 Allergische Kontaktdermatitis ... 18
2.4.1 Haptene ... 19
2.4.2 Sensibilisierung ... 19
2.4.2.1 Antigenaufnahme und Migration der DC ... 19
2.4.2.2 Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen ... 22
2.4.2.3 TH-1-/TH-2-Differenzierung ... 23
2.4.3 Challenge ... 25
2.4.4 TDI-Kontaktallergie ... 27
2.5 Arachidonsäurekaskade... 28
2.6 Testsubstanzen ... 30
2.6.1 Acetylsalicylsäure... 30
2.6.1.1 Wirkung von Acetylsalicylsäure auf Immunzellen in vitro... 33
2.6.1.2 Wirkung von ASS auf Immunzellen in vivo... 34
2.6.2 Indometacin... 35
2.6.2.1 Wirkung von Indometacin auf DC in vitro... 36
2.6.3 Tepoxalin... 38
2.6.3.1 Wirkung von Tepoxalin auf Immunzellen ... 39
2.6.4 Diflorason 17,21-diacetat ... 40
2.6.4.1 Wirkung der Glukokortikoide auf Immunzellen in vitro... 41
2.6.4.2 Wirkung von Glukokortikoiden auf Immunzellen in vivo... 43
3 Material und Methoden... 44
3.1 Geräte und Reagenzien ... 44
3.1.1 Geräte für Versuche in der Zellkultur ... 44
3.1.2 Reagenzien für Versuche in der Zellkultur ... 44
3.1.3 Testsubstanzen... 45
3.1.4 TNF-α-ELISA/PGE2-ELISA ... 45
3.1.5 MTT-Test... 45
3.2 Geräte für In-vivo-Versuche ... 45
3.2.1 Geräte für FACS-Analyse... 46
3.2.2 Geräte für Zymographie ... 46
3.2.3 Reagenzien für Zymographie ... 47
3.2.4 Immunhistochemie ... 47
3.2.5 Franz-Zelle ... 48
3.2.6 Bedingungen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ... 48
3.2.7 Reagenzien für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ... 49
3.2.8 Hergestellte Puffer und Lösungen... 49
3.2.9 Versuchstiere ... 50
3.3 Versuchsübersicht... 51
3.4 In-vitro-Versuche ... 53
3.4.1 Gewinnung dendritischer Zellen... 53
3.4.2 MTT-Test... 55
3.4.3 Messung der PGE2- und TNF-α-Konzentration... 56
3.4.4 Franz-Zelle ... 56
3.4.5 Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ... 57
3.5 In-vivo-Versuche ... 58
3.5.1 TDI-Kontaktallergiemodell ... 58
3.5.2 Untersuchungen zur Migration dendritischer Zellen im TDI- Kontaktallergiemodell ... 59
3.5.2.1 Sensibilisierung ... 59
3.5.2.2 Challenge ... 59
3.5.3 Mouse-Ear-Swelling-Test (MEST)... 61
3.5.3.1 Local-Lymph-Node-Assay (LLNA) ... 62
3.5.3.2 Skin-DC-Migration-Assay ... 62
3.5.4 Fluorescence Activated Cell Sortening (FACS)... 63
3.5.5 Zymographie ... 65
3.5.5.1 Aufbereitung der Proben... 65
3.5.5.2 Protein-Assay ... 65
3.5.5.3 Zymographie... 65
3.5.6 Immunhistochemische Darstellung von MHC-II+-Zellen ... 66
3.6 Statistische Auswertung ... 68
4 Ergebnisse ... 69
4.1 In-vitro-Versuche ... 69
4.1.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion... 69
4.1.2 Einfluss der Testsubstanzen auf die PGE2-Sekretion ... 72
4.2 Ergebnisse der In-vivo-Versuche ... 75
4.2.1 Einfluss der Testsubstanzen in der Sensibilisierungphase ... 75
4.2.2 Ergebnis des LLNA ... 77
4.2.2.1 Lymphknotengewicht und Gesamtzellzahl... 77
4.2.2.2 Einfluss der Pharmaka auf den Anteil CD11c+-Zellen im Lymphknoten ... 78
4.2.3 Ergebnis des Skin-DC-Migration-Assay ... 79
4.2.4 Einfluss der Testsubstanzen auf die MMP-9-Aktivität ... 80
4.2.5 Einfluss der Testsubstanzen in der Challenge-Phase... 81
4.2.6 Ergebnis des MEST ... 81
4.2.7 Resorption von ASS in der Franz-Zelle ... 83
4.2.8 Ergebnis des Local-Lymph-Node-Assay ... 84
4.2.8.1 Einfluss der Pharmaka auf die Lymphknotengewichte und Gesamtzellzahl ... 84
4.2.8.2 Einfluss der Pharmaka auf die Migration CD11c+-Zellen ... 86
4.2.8.3 CD11c+-und CD40+-Zellen im Lymphknoten ... 88
4.2.9 Ergebnis des Skin-DC-Migration-Assay ... 90
4.2.10 Einfluss der Pharmaka auf die MMP-9-Aktivität ... 91
4.2.11 MHC-II+-Zellen in der Epidermis... 93
4.2.12 PGE2-Konzentration im Ohrgewebe... 95
4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse... 96
5 Diskussion ... 97
5.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die LPS-induzierte TNF-α- und PGE2- Sekretion dendritischer Zellen ... 97
5.1.1 Wirkung auf die TNF-α-Sekretion in vitro... 97
5.1.2 Beeinflussung der PGE2-Produktion in vitro... 98
5.2 Einfluss der Testsubstanzen auf DC in der Sensibilisierung ... 99
5.2.1 Einfluss von ASS und Diflorasondiacetat im MEST ... 99
5.2.2 Einfluss von ASS und Diflorasondiacetat auf die Migration der DC ...100
5.2.3 Einfluss von ASS und Diflorasondiacetat im LLNA ...101
5.2.4 Einfluss von ASS und Diflorasondiacetat auf die MMP-9 ...102
5.3 Einfluss der Testsubstanzen auf DC in der Challenge ...103
5.3.1 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat im MEST ...104
5.3.2 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat auf die Migration der DC...105
5.3.3 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat im LLNA ...107
5.3.4 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat auf die MMP-9 ...108
5.3.5 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat auf MHC-II+-Zellen in der Epidermis ...109
5.3.6 PGE2-Konzentration in den Ohrhomogenaten ...110
6 Zusammenfassung ...112
7 Summary ...114
8 Literaturverzeichnis ...116
9 Anhang ...147
9.1 Anhangstabellen...147
9.2 Veröffentlichungen ...161
Abkürzungsverzeichnis:
APC Antigen presenting cell
ASS Acetylsalicylsäure
DC Dendritic cell
DMSO Dimethylsulfoxid
ELISA Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
FCS Fetal calf serum
g Gramm
GM-CSF Granulocyte macrophage-colony stimulating factor
LC Langerhans cell
IFN Interferon
IgE Immunglobulin E
IL Interleukin
LLNA Local-Lymph-Node-Assay
Ln. Lymphonodus
LPS Lipopolysaccaride
mg Milligramm
MHC Major-Histocompatibility-Complex
ml Milliliter
nmol Nanomol
NSAID Nichtsteroidale Antiphlogistika PBS Phosphate Buffered Saline
PGE Prostaglandin E2
SAIDs Steroidale Antiphlogistika
Tab. Tabelle
TDI Toluen-2,4-diisocyanat
Trance R TNF- related activation-induced cytokine
µl Mikroliter
µmol Mikromol
1 Einleitung
Dendritische Zellen (DC) werden als antigenpräsentierende Zellen bezeichnet, da sie die Fähigkeit haben, eindringende Antigene zu erkennen, aufzunehmen, zu prozessieren und Immunzellen zu präsentieren. Nach Phagozytose des Antigens wandern sie in den drainierenden Lymphknoten und aktivieren antigenspezifische T- Zellen (LAMBRECHT 2001). Daher spielen DC eine wichtige Rolle bei der zellvermittelten und humoralen Immunantwort und somit auch bei allergischen Erkrankungen.
Ziel dieser Arbeit ist es, die Beeinflussung dendritischer Zellen durch nichtsteroidale und steroidale Antiphlogistika zu untersuchen. Als nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDs) werden Acetylsalicylsäure, Indometacin und Tepoxalin verwendet.
Diflorason-17,21-diacetat kommt als steroidales Antiphlogistikum zum Einsatz.
In vitro werden DC-Zellkulturen aus murinem Knochenmark angelegt, mit den Testsubstanzen inkubiert und anschließend mit Lipopolysaccariden (LPS) zur Reifung angeregt. Die Kulturüberstände werden auf eine Hemmung der LPS- stimulierten Zytokinproduktion untersucht. In vivo werden die Substanzen an BALB/c Mäusen in einem Kontaktallergiemodell mit Toluendiisocyanat (TDI) als Hapten untersucht. Die allergische Reaktion wurde an Mausohren ausgelöst. Wichtige Parameter sind dabei die Inhibition der Entzündungsreaktion, welche anhand der Ohrschwellung ermittelt wird, die Migration der DC in den regionalen Lymphknoten sowie die T-Zellproliferation. Über die Migration der DC aus der Haut geben der Skin- DC-Migrations-Assay, sowie die in der FACS-Analyse ermittelte Verteilung der CD11c+- und CD40+-Zellen Aufschluss. Anhand der Gewichte und der Gesamtzellzahl der regionären Lymphknoten wird auf die Proliferationsrate der T- Zellen rückgeschlossen.
2 Literaturübersicht
2.1 Dendritische Zellen
DC wurden erstmals von STEINMANN und COHN (1973) als ein “neuer Zelltyp in peripheren Lymphorganen der Maus“ beschrieben. Sie benannten die Zellen nach dem griechischen Wort dendron (Baum). Inzwischen wurden diese Zellen auch in nichtlymphatischen Geweben einschließlich der Haut, Lunge, Synovialflüssigkeit, dem Gastrointestinaltrakt und im Blut isoliert (THOMAS und LIPSKY 1996). Der erste Typ dendritischer Zellen wurde von Paul Langerhans schon 1868 in der Epidermis der Haut entdeckt, allerdings war die Funktion der Zelle unklar. Langerhans machte die Zellen mit Hilfe einer Goldchlorid-Färbetechnik sichtbar, die klassischerweise dazu benutzt wurde, Nervenzellen zu identifizieren. Aufgrund dieser Beobachtung wurden die Langerhans-Zellen (LC) für lange Zeit zu den Nervenzellen gerechnet.
Dank der elektronenmikroskopischen Untersuchungen von BIRBECK et al. (1961) wurde die LC zu den Mesenchymzellen, Histiozyten und sogar Makrophagen gezählt. Weitere Beweise für die Verwandtschaft mit Immunzellen erbrachten MUSKATELLIO (1962), BRADSHAW et al. (1963) und WOLFF (1963). Aufgrund ihrer Beobachtungen nahmen SILBERBERG et al. (1976) an, dass die Langerhans- Zelle zum Antigentransport fähig ist und somit eine Schlüsselstellung bei allergischen Erkrankungen innehat (ROMANI et al. 2003). Diese Vermutung wurde unter anderem von STINGL et al. (1978) belegt, der zeigen konnte, dass LC auch zur Antigenpräsentation in der Lage sind.
Den endgültigen Beweis für die Herkunft der LC aus dem Knochenmark konnten schließlich KATZ et al. (1979) erbringen. Seit 1985 zählen LC zur Familie der dendritischen Zellen (SCHULER und STEINMANN 1985). Seither sind DC zum Fokus weiterer Forschungen geworden. Dabei werden vor allem ihre Veränderungen während der Reifung, Migration und T-Zell-Aktivierung im Hinblick auf allergische Erkrankungen untersucht.
2.1.1 Herkunft und Entwicklung immaturer DC und DC-Vorläufer
Es existieren vier Gruppen von DC, die gemeinsam mit Granulozyten und Makrophagen kontinuierlich im Knochenmark aus hämatopoetischen Stammzellen gebildet werden (s. Abbildung 2-1). Für die Entwicklung und Differenzierung humaner DC sind der fms-like-tyrosinkinase-3-Ligand (FLT-3) und GM-CSF essentiell (PULENDRAN et al. 2001). Die Differenzierung der CD34+-Stammzellen in sogenannte Common Lymphoid Progenitors (CLP) und Common Myeloid Progenitors (CMP) stellt den Ausgangspunkt für die verschiedenen DC-Subtypen dar. Die Subtypen unterscheiden sich voneinander durch ihre Oberflächenmarker und Funktionen. CLP weisen zum Beispiel zusätzlich den IL-7-Rezeptor auf, während CMP das c-kit repräsentieren (STEINMANN 2003). Aus den humanen CMP-Vorläufern gehen CD34+CLA+- und CD34+CLA--Zellen hervor, die sich wiederum in CD11c+CD1a+- und CD11c+CD1a-- immature dendritische Zellen teilen (STRUNK et al. 1997). Immature Langerhans-Zellen entwickeln sich aus eingewanderten CD11c+CD1a+-DC, während interstitielle DC sich aus CD11c+CD1a-- Vorläuferzellen entwickeln (ITO et al. 1999). Bei der Einwanderung der LC- Vorläuferzellen in die Haut nimmt das cutaneous lymphocyte antigen (CLA) eine Schlüsselrolle ein (STRUNK et al. 1997). Es gilt als erwiesen, dass LC von myeloiden Vorläufern stammen. Dennoch beobachteten ANJUERE et al. (2000), dass LC der Maus sich auch aus intravenös verabreichten CD34low lymphoiden Zellvorläufern entwickeln können. Aus den hämatopoetischen Stammzellen entwickeln sich noch zwei weitere DC-Vorläuferformen (pre-DC); Monozyten (pre- DC1) und plasmazytoide DC (pre-DC2) (LIU 2001). Dabei dienen CMP den Monozyten als Vorläuferzellen, während die CLP Vorläufer der plasmazytoiden DC sind. Monozyten wiederum differenzieren sich in Abhängigkeit der äußeren Umstände zu Makrophagen oder zu DC (STEINMANN 2003). Der Werdegang einiger Monozyten und ihrer Subtypen ist im steady-state bereits vorbestimmt. So scheinen sich zum Beispiel CD16-Fcγ-Rezeptoren exprimierende Zellen in DC zu entwickeln (RANDOLPH et al. 2002). Während LPS und manche Bakterien, die LPS in ihrer Zellmembran aufweisen, die Weiterentwicklung phagozytierender Monozytenin DC blockieren können (ROTTA et al. 2003), differenzieren sich Monozyten in vitro mit GM-CSF und IL-4 zu DC (ROMANI et al. 1994; SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994). Im Gegensatz dazu differenzieren sich plasmazytoide DC in der Zellkultur weiter zu immaturen DC (im-DC2) mit Zusatz von IL-3 oder im Verlaufe einer Immunantwort auf virale Antigene (LIU 2001).
Hämatopoetische Stammzelle
CMP CLP
CD34+CLA+ CD34+D CLA-
Langerhans Zelle Interstitielle DC CD11c+ CD1a+ CD11c+CD1a-
Mono/ pre-DC1 IPC/ pre-DC 2
Abbildung 2-1 Entwicklung dendritischer Zellen nach LIU (2001)
2.2 Langerhans-Zellen und interstitielle dendritische Zellen
Obwohl LC nur 1-3% der epidermalen Zellpopulation ausmachen, bedecken sie ca.
25% der Hautoberfläche (LAMBRECHT 2001). Immature LC liegen in den suprabasalen Lagen der Epidermis und bilden mit ihren dünnen „dendritiformen“
zytoplasmatischen Zellfortsätzen ein regelmäßiges Netzwerk. Bedingt durch ihre Morphologie sind sie in der Lage, eindringende Antigene und auch körpereigene Antigene aufzunehmen, zu verarbeiten und von der Haut in den drainierenden Lymphknoten zu transportieren. Charakteristisch für LC sind die schläger- oder stabförmigen zytoplasmatischen Birbeck-Granula. Anhand dieser Organellen lassen sich LC in der Haut identifizieren. Desweiteren besitzen die Zellen den Langerin/CD207-Rezeptor. Dabei handelt es sich um ein Mannose spezifisches Typ C-Lektin, das nicht nur auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wird, sondern intrazelluär einen Teil der Birbeck-Granula darstellt (ROMANI et al. 2003). Anhand dieser Merkmale wurden LC erstmals in Zellkulturen von CD34+-Stammzellen, nach Vorbehandlung mit GM-CSF und TNF-α, entdeckt (CAUX et al. 1992). Unreife DC sind unfähig, T-Zellen zu aktivieren, da sie auf ihrer Oberfläche hauptsächlich Fcγ-, Fcε-Rezeptoren zur Antigenaufnahme und Chemokin-Rezeptoren (CCR)-1, CCR5 CCR6 besitzen. Eine wichtige Rolle nimmt der CCR6 als Rezeptor für das macrophage inflammatory protein (MIP)-3α ein, welches hauptsächlich von Keratinozyten und Endothelzellen gebildet wird. Bei Entzündungsreaktionen wird die MIP-3α-Bildung hochreguliert und somit die immaturen LC chemotaktisch zu den Entzündungsherden gelockt (ROMANI et al. 2003). Unter physiologischen Bedingungen migrieren immature DC (im Gegensatz zu pre-DC1 und pre-DC2) in den Lymphknoten, wobei sie keiner Maturation unterliegen (SHORTMAN 2000).
Dieser Vorgang dient wahrscheinlich der Toleranzinduktion von T-Zellen gegenüber körpereigenen Antigenen (SIXT et al. 2005). Die Halbwertszeit myeloider und lymphoider Subtypen liegt nur bei ein paar Tagen. Der Umsatz MHC-II+-Zellen aus der Haut liegt bei ca. 1 Monat (RUEDL et al. 2000). Dagegen werden LC erst nach Monaten oder Jahren in der Haut durch neue Vorläufer aus dem Blut ersetzt (MERAD et al. 2002). Allerdings ist der turn-over von DC, der durch TNF-related
activation-induced cytokine (Trance-R) und CD40 reguliert wird, während entzündlicher Vorgänge stark erhöht. Immature DC sind mit Toll-like- Rezeptoren (TLR) ausgestattet, die sie zur Antigenerkennung befähigen (KAISHO und AKIRA 2001). Nach erfolgtem Antigenkontakt unterliegen DC Veränderungen, der sogenannten Maturation, die sich auf die Morphologie, den Phänotyp und die Funktion der Zellen auswirkt. Dieser Vorgang geht einher mit der Hochregulation der Oberflächenmoleküle MHC-II, CD40, CD54, CD80, CD86 auf ihrer Zelloberfläche und der Sekretion der proinflammatorischen Enzyme wie IL-1, IL-6, IL-12, IL-18 und IL-23 (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994). Zudem verlieren LC bei der Wanderung in die Dermis ihre dendritische Morphologie und werden rund. Beim Eintritt in die afferenten Lymphgefäße verändern sie erneut ihre Form und werden als
„veiled cells“ bezeichnet. Zur Antigenpräsentation sind DC nur als interdigitierende Zellen im Lymphknoten fähig (KRASTEVA et al. 1999). Während der Maturation exprimieren DC den CCR7-Rezeptor, der ihre Migration durch Bindung an C6kine bzw. MIP-3β zu den Lymphgefäßen/ Lymphknoten steuert (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994). In den parakortikalen Regionen der Lymphknoten angelangt, werden die Antigene den T-Zellen präsentiert. In diesem Stadium können DC keine Antigene mehr aufnehmen. Dafür produzieren sie aber MIP3-β und dendritic cell-derived C-C chemokine (DCCK-1) für naive T-Zellen und monocyte- derived chemokine sowie thymus and activation regulated chemokine (TARC) für sessile T-Zellen (CYSTER 1999). Dadurch sind die Vorraussetzungen für einen schnellen Kontakt zwischen DC und T-Zellen geschaffen. Naive T-Zellen interagieren mit den DC über Adhäsionsmoleküle wie DC-Sign und CD54, die wiederum auf die intrazellulären Adhäsionsmoleküle-3 und CD11a/CD18 wirken (GEIJTENBEEK et al.
2000; GUNZER et al. 2000). Epidermale sowie dermale DC sind bis zu 3 Tage nach ihrer Einwanderung in den Lymphknoten nachweisbar, ab dem vierten Tag nimmt ihre Präsenz deutlich ab (RUEDL et al. 2000). Die phänotypischen Unterschiede von LC und interstitiellen DC sind in Tabelle 2-1 dargestellt.
Tabelle 2-1 Phänotypische Unterschiede und Funktion von LC und interstitiellen DC nach LIU (2001)
Langerhans-Zellen Interstitielle DC
E-Cadherin
Birbeck-Granula/ Lag-antigen Langerin
CD2a CD9 CD68 Factor XIIIa
Aktivierung von B-Zellen +/- CD 8-T-Zell Priming +++
Makropinozytose Bildung von IL-10
Aktivierung von B-Zellen + CD8-T-Zell Priming +
2.3 Murine DC aus dem Knochenmark
In der vorliegenden Arbeit wurden DC aus dem Knochenmark von Balb/c-Mäusen gewonnen. Die Isolierung der DC aus dem Knochenmark ist aufgrund der einfachen Gewinnung einer großen Menge an DC (5 x 106) mit einer Reinheit von bis zu 80%
eine verbreitete Methode und erfolgte in Anlehnung an LUTZ et al. (1999). Da myeloide DC in den verschiedenen Geweben nur in geringer Anzahl vorkommen, gestaltet sich ihre Isolierung langwierig und nicht besonders effektiv, da nur wenige Zellen in der Regel dabei gewonnen werden. So können zum Beispiel nur 6 x 104 LC aus der Epidermis eines Mäuseohres nach dem Protokoll von ORTNER et al. (1996) isoliert werden. Als optimaler Zeitraum für die Kultivierung der DC aus dem Knochenmark mit GM-CSF werden 7-8 Tage angegeben (INABA et al. 1992).
Sowohl die Reinheit als auch die Ausbeute der Zellen kann durch eine längere Kultivierung von 10-12 Tagen gesteigert werden. Analysen der DC- Oberflächenmoleküle MHC-II, CD11c und NLDC-145 mittels FACS ergaben einen Anstieg immaturer und maturer DC in der Kultur von 65% an Tag 8, über 75% an Tag 10 bis 88% an Tag 12. Allerdings nimmt ihre Fähigkeit zur Allostimulation von T- Zellen mit fortschreitender Kultivierungsdauer ab. Eine optimale Stimulation der T- Zellen wird von DC, die 8 bis 10 Tage lang generiert wurden, erreicht. Die DC entwickeln sich kontinuierlich aus einem MHC-II-/FITC-Dex--Vorläuferstadium über MHC-IIlow/FITC-Dex+-Zellen in MHC-II high/FITC-Dex--Zellen. Die Aufnahme von FITC-
Dex über den Mannoserezeptor ist ein Marker für immature DC von Mensch und Maus (SALLUSTO und LANZAVECCHIA 1994; LUTZ et al. 1999). Die Zellkultur enthält nach 10-12 Tagen drei verschiedene Zellpopulationen: adhärente Makrophagen, nichtadhärente immature und mature DC. Durch Inkubation der Zellen ab Tag 9-12 mit LPS oder TNF-α für 24 Stunden werden immature DC zu Reifung angeregt. Der gleiche Effekt kann durch Umsetzen der Zellen an Tag 10 für 24 Stunden in eine neue Petrischale mit Mediumwechsel und GM-CSF erreicht werden.
Allerdings kann die Anzahl der Zellen in Kultur durch LPS oder TNF-α wiederum verringert werden, da viele mature Zellen durch eine Überstimulation sterben. In dieser Arbeit wurden die DC an Tag 9 mit den Substanzen behandelt, da zu diesem Zeitpunkt eine genügend große Reinheit an immaturen DC vorhanden ist, und an Tag 10 wurden die Zellen zur Reifung durch LPS-Gabe und Umsetzen in eine neue Platte angeregt.
2.4 Allergische Kontaktdermatitis
Die allergische Kontaktdermatitis manifestiert sich in den meisten Fällen als Überempfindlichkeitsreaktion vom Spättyp (Typ IV). Die Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ IV wird durch haptenspezifische T-Zellen sowie Leukozyten, die sich in der entzündeten Haut ansammeln, ausgelöst. Eine Schlüsselrolle bei der Ansammlung der Zellen nehmen Chemokine ein (GOEBELER et al. 2001; BÄUMER et al. 2004).
Die klinische Phase ist meist durch Rötungen, Papeln und Pusteln der Haut gekennzeichnet. Voraussetzung für die Entwicklung der Dermatitis ist die Sensibilisierung, also der Erstkontakt mit dem Antigen, und die Differenzierung der T- Zellen in antigenspezifische T-Zellen sowie Gedächtniszellen. Dieses Stadium ist meist asymptomatisch, während sich in der Auslösephase, die durch erneuten Antigenkontakt induziert wird, klinische Symptome manifestieren.
2.4.1 Haptene
Verantwortlich für die Ausbildung einer Kontaktallergie sind in der Regel niedermolekulare Substanzen, sogenannte Haptene, mit Molekulargewichten von 100 bis 1000 Dalton.
Haptene (haptein = beschleunigen) sind zwar in der Lage, an Antikörper zu binden, jedoch lösen sie keine adaptive Immunantwort aus. Zur Auslösung einer Überempfindlichkeitsreaktion müssen sie erst an Proteine binden, die als “Carrier“
fungieren. Voraussetzung für die Bildung der Hapten-Carrier-Komplexe ist die Elektrophilität der Haptene, die es ihnen ermöglicht, an nukleophile Bindungsstellen der Hautproteine zu binden (LEPOITTEVIN und LEBLOND 1997). Anhand der Immunogenität eines Haptens unterscheidet man zwischen stark allergen wirksamen Substanzen wie Dinitrofluorbenzol (DNFB), Toluendiisocyanat (TDI) oder Oxazolon, und schwachen Allergenen, wie Metallsalzen. Bei starken Allergenen kann man davon ausgehen, dass jeder Kontakt mit einem solchen zur Kontaktallergie führt, während schwach wirksame nur bei einem geringen Prozentsatz der Bevölkerung eine Kontaktallergie auslösen. Die unterschiedlichen Reaktionen, die durch Allergene hervorgerufen werden, sind auch individuell bedingt (KRASTEVA et al. 1999).
2.4.2 Sensibilisierung
Die Sensibilisierung eines Organismus gegenüber einem Allergen erfolgt mit dem ersten Antigenkontakt und ist beim Menschen nach 8-15 Tagen, bei der Maus nach 5-7 Tagen abgeschlossen (KRASTEVA et al. 1999).
2.4.2.1 Antigenaufnahme und Migration der DC
Die Hautbarriere penetrierende Antigene werden von immaturen LC, die mit ihren dendritiformen Zellausläufern ein dreidimensionales Netzwerk bilden, aufgefangen (KRASTEVA et al. 1999). Die Antigenaufnahme kann durch verschiedene Mechanismen stattfinden: Erstens kann Antigenmaterial durch Langerin (C-Typ Lektin Carbohydrat) vermittelte Endozytose internalisiert werden. Desweiteren können Flüssigkeiten und Lösungen mit Hilfe eines Aktin-Skeletts durch
Makropinozytose aufgenommen werden und LC sind in der Lage, durch Phagozytose Partikel, unter anderem apoptotische Zellen oder Bakterien, aufzunehmen (LAMBRECHT 2001). Nach erfolgter Antigenaufnahme und Sekretion proinflammatorischer Zytokine durch Keratinozyten beginnen LC sich morphologisch, phänotypisch und funktionell zu verändern (GRABBE und SCHWARZ 1998). Dieser Vorgang wird als Maturation bezeichnet (KRASTEVA et al. 1999). Die phänotypischen Veränderungen gehen einher mit dem Verlust von Antigenaufnahmerezeptoren und der Verringerung endozytotischer Aktivität. Dafür werden verstärkt Adhäsions- und kostimulatorische Moleküle, vor allem CD54 (ICAM-1), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD40 heraufreguliert (LIU 2001). MHC-II ist der wichtigste Marker für maturierende Zellen. Für die Aufnahme der Antigene durch MHC-II-Moleküle wird der Rezeptor in den ersten 3 Stunden nach Antigenkontakt heruntergefahren und verstärkt intrazellulär gebildet (BECKER et al.
1992a; BECKER et al. 1992b). Erst 24 Stunden später wird MHC-II verstärkt auf der Zelloberfläche der LC exprimiert (HANAU et al. 1989; AIBA und KATZ 1990).
Begleitet werden diese Vorgänge durch die Sekretion der Zytokine IL-1, IL-6, und IL- 12. Desweiteren spielen TNF-α und IL-1β bei der Aktivierung und Migration der LC eine wichtige Rolle (CUMBERBATCH und KIMBER 1992). Sowohl TNF-α als auch IL-1β steuern durch autokrine und parakrine Sekretion die Bildung von Cyclooxygenase-2 (COX-2) in LC und Keratinozyten (KIMBER et al. 2000;
KABASHIMA et al. 2003). Über den Cyclooxygenaseweg werden wiederum Prostaglandine gebildet (s. Abbildung 2-4). Es besteht ein komplexes Zusammenspiel zwischen Zytokinen und Prostaglandin E2 (PGE2). Prostaglandine üben viele, oft auch gegensätzliche Funktionen aus, so regulieren sie unter anderem die Maturation, Zytokinproduktion, TH-Zellantwort, Expression von Chemokinrezeptoren, die Migration und Apoptose von DC. Die vielfältigen Effekte sind abhängig vom Maturationsstatus und der Lokalisation der DC (GUALDE und HARIZI 2004).
PGE2 entsteht durch Cyclooxygenasen aus freigesetzter Arachidonsäure und kann an 4 verschiedene G-Protein gekoppelte Rezeptoren (EP1-4) binden. Obwohl alle 4 Rezeptoren auf der Oberfläche von LC nachweisbar sind, spielen hauptsächlich der
EP2- und insbesondere der EP4-Rezeptor bei der Maturation und Migration eine Rolle. Durch Bindung an den EP4-Rezeptor wird sowohl die Maturation als auch die Migration verstärkt. Der Effekt auf die Migration der LC ist nur indirekt auf PGE2
zurückzuführen, da es die Chemotaxis der LC gegenüber MIP-3β erhöht, aber nicht selbst die Migration induziert (KABASHIMA et al. 2003). In vitro konnten anhand von Monozyten abstammender DC die Induktion von CCR7, dem Rezeptor für MIP-3β gezeigt werden (LUFT et al. 2002; SCANDELLA et al. 2002). Durch die während der Maturation erlangten Fähigkeiten, können die ehemals sessilen LC aus der Haut in die Lymphgefäße und von dort in die parakortikalen Bereiche der regionalen Lymphknoten migrieren. Ziel ist es, den dort ansässigen T-Zellen die Allergene über MHC-I bzw. MHC-II zu präsentieren (KRASTEVA et al. 1999; KIMBER und DEARMAN 2002). Allerdings müssen LC, bevor sie in die Lymphgefäße einwandern können, diverse Gewebsschichten und die Basalmembran durchdringen. Dazu wird während der Maturation das Adhäsionsmolekül E-Cadherin auf der Oberfläche der LC durch TNF-α herunterreguliert, so dass die LC sich aus der Epidermis lösen können (SCHWARZENBERGER und UDEY 1996). Desweiteren vermitteln α6- Integrine und CD44 die Migration durch die extrazelluläre Matrix. Mit Hilfe der Matrix- Metalloproteinase-9 (MMP-9), die durch TNF-α und IL-1β auf der Oberfläche der LC exprimiert wird, können die DC mittels Proteolyse von Collagen IV die Basalmembran durchdringen (KOBAYASHI et al. 1999; RATZINGER et al. 2002).
Der Eintritt der LC in die Lymphgefäße und ihre Wanderung zu den Lymphknoten wird durch CCR7 vermittelt. In den Lymphknoten werden die chemotaktischen Faktoren 6Ckine (CCL21) und MIP-3β (CCL19) gebildet, die an den Oberflächenrezeptor CCR7 binden und damit die LC anlocken (FÖRSTER et al.
1999; GUALDE und HARIZI 2004).
ITANO und JENKINS (2003) konnten zeigen, dass nach Kontakt mit löslichem Antigen im Lymphknoten zwei zeitlich getrennte “Wellen“ der Antigenpräsentation stattfinden, die unterschiedliche T-Zell-Antworten hervorrufen. Diese erste Welle der Antigenpräsentation wird über das sogenannte “Conduit“-System ermöglicht. Dabei handelt es sich um ein retikuläres Netzwerk mit eingelagerten immaturen dendritischen Zellen, das die afferenten Lymphgefäße mit postkapillären Venolen
(high endothelial venules) verbindet. Über dieses Transportsystem werden Moleküle unter 70 kD in die postkapillären Venolen transportiert. Kleinere Moleküle erreichen so innerhalb weniger Minuten die DC des Conduit-Systems. Im Conduit-System nehmen die DC diese Moleküle auf, wandern in den Lymphknoten und präsentieren dort die Haptene. Die größeren Moleküle gelangen über die Sinus in die afferenten Lymphgefäße (SIXT et al. 2005). Die zweite Antigenpräsentation im Lymphknoten findet erst 8-12 Stunden nach Antigenaufnahme durch DC der Haut statt (ITANO und JENKINS 2003).
2.4.2.2 Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Zellen
In der T-Zell-Region des Lymphknotens angekommen, präsentieren mature DC das Antigen naiven T-Zellen. Mature DC können in diesem Stadium keine Antigene mehr aufnehmen, sind aber mit zellulären Mechanismen ausgestattet, die ihnen die Interaktion mit T-Zellen erlauben. Um möglichst viele der kontinuierlich im Blut und den lymphatischen Organen zirkulierenden T-Zellen anzulocken, produzieren antigenpräsentierende DC MIP-3β und DCCK. Denn je mehr naive T-Zellen mit den DC interagieren, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit der Antigenerkennung. Auch ruhende T-Zellen werden mit Hilfe des monocyte-derived chemokine und des Thymus and activation regulated chemokine angelockt (CYSTER 1999). Naive T- Zellen verfügen über die intrazellulären Adhäsionsmoleküle-(ICAM-) 3 und CD11a/CD18, mit denen sie an DC-SIGN und CD54 der antigenpräsentierenden Zellen binden (GEIJTENBEEK et al. 2000; GUNZER et al. 2000) Diese unspezifische Bindung erlaubt naiven T-Zellen die vielen MHC-II-Moleküle auf der Oberfläche antigentragender DC zu prüfen und auf ihr spezifisches Peptid zu untersuchen (GUNZER et al. 2000; LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000) Erkennt die naive T- Zelle ihren spezifischen Peptid-MHC-Liganden, bindet sie diesen mit ihren T- Zellrezeptoren. Allerdings reicht die Bindung allein nicht für eine Aktivierung der T- Zelle aus. Es muss noch zu einem zweiten Signal kommen, indem die kostimulierenden Oberflächenmoleküle CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) und CD28 der naiven T-Zelle binden (INABA et al. 1994; LARSEN et al. 1994). Charakteristisch für
aktivierte T-Zellen ist die Produktion großer Mengen an IL-2 und die Expression hochaffiner IL-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, wodurch autokrin die T-Zell- Proliferation vorangetrieben wird (AUSTYN et al. 1983; JANEWAY und TRAVERS 1997). Um eine überschießende T-Zell-Antwort zu verhindern, wird auf der Oberfläche von T-Zellen CTLA-4 exprimiert, der über Bindung an B-7 zum einen die IL-2-Produktion limitiert und zum anderen aktivierte Nachkommen der T-Zelle weniger empfänglich für antigenpräsentierende Zellen macht (JANEWAY und TRAVERS 1997). Durch die Aktivierung kommt es zu einer kontinuierlichen Teilung der T-Zellen in T-Effektor- und T-Gedächtniszellen (s. Abbildung 2-2) (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000).
2.4.2.3 TH-1-/TH-2-Differenzierung
Die Kontaktallergie und Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ IV unterscheiden sich insoweit, dass die Entzündungsreaktion bei Typ IV-Allergien über MHC-II geprimte CD4-T-Zellen vermittelt wird, während bei der Kontaktallergie sowohl CD4+- als auch CD8+-T-Zellen involviert sind (CHER und MOSMANN 1987).
Die TH-1-Antwort zeichnet sich durch eine zellvermittelte Immunantwort (zytotoxische CD8+-T-Zellen) aus, während die TH-2-Antwort hauptsächlich über IgE und humorale Immunmechanismen vermittelt wird (CUMBERBATCH et al. 2003). Die TH-1-/TH-2-Polarität wird maßgeblich von der Allergenpräsentation, dem umgebenden Zytokinmilieu (IL-12, IL-4) und der Dauer der T-Zellrezeptor-Stimulation bestimmt. In Abhängigkeit der Allergene präsentieren mature DC diese entweder über den MHC-I- oder MHC-II-Komplex (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000).
Findet die Präsentation der Haptene über MHC-I in Abwesenheit von T-Helferzellen statt, so entstehen CD8+-T-Effektorzellen, die sich zu zytotoxischen Effektorzellen weiter entwickeln (ZINKERNAGEL 1996; KRASTEVA et al. 1999). Eine Schlüsselrolle bei der Differenzierung von CD8+-Zellen und damit der Entwicklung einer TH-1-Antwort nimmt IL-12 ein. Für einen Zeitraum von 8-14 Stunden wird IL-12 nach Stimulation mit LPS, Bakterien oder Viren von DC produziert. Während IFN-γ ebenfalls zu einer Steigerung der IL-12-Sekretion führt, wird sie durch PGE2 und IL-
10 gehemmt (SEMPER et al. 2001). Auch andere Zytokine wie IL-18 und IFN-α führen zu einer TH-1-Polarität (LANZAVECCHIA und SALLUSTO 2000). Zu den Kontaktallergenen, die eine TH-1-Immunantwort auslösen, gehören DNFB, Trinitrophenyl (TNP) und Oxazolon (KRASTEVA et al. 1999).
Eine TH-2-Immunantwort wird dagegen ausgelöst, wenn CD4+-Lymphozyten über den Peptid-MHC-II-Komplex geprimt werden und sich in TH1- (T1-Helferzellen) oder TH2-Zellen (T2-Helferzellen) weiterdifferenzieren. Helferzellen sind verantwortlich für humorale Abwehr und produzieren IFN-γ, IL-4, IL-5 und IL-13 (ROMAGNANI 1994;
ABBAS et al. 1996). CD4+-Helferzellen sind in der Lage, B-Zellen zu aktivieren, die das Antigen über IgM-Rezeptoren aufnehmen und als Peptid-MHC-II-Komplex präsentieren, indem sie mittels CD40 L an sie binden und unter IL-4-Einfluss zur IgE- Produktion anregen (JANEWAY und TRAVERS 1997). Während IL-4 für die Antikörperproduktion unerlässlich ist, wird die IgE-Produktion durch IFN-γ gehemmt (DELPRETE et al. 1988; PENE et al. 1988).
Beispiele für Allergene, welche eine TH-2-Immunantwort hervorrufen sind Trimelliticanhydrid (TMA) und Toluendiisocyanat (TDI) (DEARMAN et al. 1996;
CUMBERBATCH et al. 2003). Die Produktion von IgE ist abhängig von der Konzentration des Allergens, der Aufnahme in den Organismus und dem Zeitpunkt der IgE-Bestimmung. Allerdings spielt es keine Rolle, ob das Allergen aerogen oder über die Haut aufgenommen wird. Potente IgE induzierende Allergene, erhöhen den IgE-Spiegel im Blut für eine längere Zeitspanne (POTTER und WEDERBRAND 1995). Durch Aktivierung der T-Zellen entstehen Antigen spezifische T-Effektor- und T-Gedächtniszellen, die sich über die Lymphgefäße im Kreislauf verteilen. Die Ausstattung mit dem cutaneous lymphocyte antigen (CLA) befähigt die T-Zellen aus den Lymphknoten über die postkapillären Venolen in die Dermis auszuwandern, wo sie bei einem erneuten Antigenkontakt die Entzündungsantwort regulieren können (PICKER et al. 1993).
Primärantwort Antigen-MHCII-Komplex
Naive T-Zelle
Erneuter Antigenkontakt
Challenge
Ruhende
Gedächtniszellen Effektorzellen
Abbildung 2-2 T-Zell Differenzierung nach SALLUSTO und LANZAVECCHIA (2001)
2.4.3 Challenge
Erneuter Antigenkontakt nach abgeschlossener Sensibilisierung führt zur Ausbildung einer zeitlich eingeschränkten Entzündungsreaktion in der Epidermis und Dermis (KRASTEVA et al. 1999). Die Auslösephase der Kontaktallergie ist grundsätzlich von den antigenspezifischen T-Zellen in der Haut abhängig (s. Abbildung 2-3).
Präsentieren LC bzw. dermale DC den, in der Haut zirkulierenden, CLA+ CD8+-T- Zellen das spezifische Allergen, führt dies zu deren Aktivierung und der Produktion der Zytokine IL-1, IL-2, IFN-γ und TNF-α (STEINMANN et al. 1993). Auch Keratinozyten werden zur Freisetzung von Zytokinen angeregt, was wiederum zu einer Aktivierung des Endothels und einer verstärkten Expression von MHC- Molekülen sowie Adhäsionsmolekülen wie ICAM-I führt (BARKER et al. 1991). Die aktivierten Endothelzellen regulieren in den postkapillären Venolen die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten, Monozyten und T-Zellen aus dem Blutstrom in die Haut durch die Ausbildung von Selektinen, Integrinen und Chemokinen und prägen damit das histologische Bild (SMITH und BARKER 1993).
Typisch für das Entzündungsgeschehen der Kontaktallergie ist die Ödem- und Vesikelbildung. Beides ist auf die zytotoxische Wirkung der CD8+-T-Zellen zurückzuführen ist (KRASTEVA et al. 1999). Die CD4+-Zellen vermittelte TH-2- Antwort dagegen wirkt der Entzündungsreaktion, die durch CD8+-T-Zellen forciert
wird, durch Freisetzung von IL-4 und IL-10 entgegen (XU et al. 1996). Bei IL-10 handelt es sich um ein immunsuppressives Zytokin, welches von verschiedenen Zellen, einschließlich Keratinozyten, gebildet wird. Seine immunsuppressive Wirkung ist auf eine Hemmung der Antigenpräsentation und damit der Entzündungsreaktion sowohl bei Kontaktallergien als auch Überempfindlichkeiten vom Spättyp zurückzuführen (SCHWARZ et al. 1994; LEE und BURCKART 1998). Desweiteren wird das in der TH-1-Antwort vorherrschende Zytokin IFN-γ durch IL-10 gehemmt (FIORENTINO et al. 1991). Die Wirkung von IL-4 ist bislang nicht vollständig geklärt.
In der Literatur werden sowohl proinflammatorische Effekte von IL-4 beschrieben, als auch eine Hemmung der Entzündungsreaktion (GAUTAM et al. 1992; ASHERSON et al. 1996). Für letzteres spräche auch die relative späte Nachweisbarkeit (9-24 Stunden nach Challenge) der IL-4-mRNA im Entzündungsgeschehen (ASADA et al.
1997).
Abbildung 2-3 Legende nach KRASTEVA et al. (1999)
2.4.4 TDI-Kontaktallergie
In dem hier verwendeten Sensibilisierungprotokoll wurde das “chemical respiratory allergen“ TDI verwendet. Dieses löst eine allergische Reaktion aus, die sich aus einer Überempfindlichkeiten vom Typ IV und einer IgE-Sofortreaktion zusammensetzt, und stellt ein klassisches Allergen für eine TH-2-Antwort dar. Durch Applikation von TDI, unabhängig vom Verabreichungsweg, werden 6-12-fach höhere haptenspezifische IgE-Spiegel im Blut von Balb/c Mäusen erreicht als bei unbehandelten Kontrolltieren. Maximale IgE-Konzentrationen sind dabei am 11. Tag nach erstmaliger Gabe nachweisbar. Im Vergleich dazu bewirkt Dinitrochlorbenzol (DNCB), welches ein starkes Kontaktallergen ist und eine TH-1-Antwort vermittelt, nur einen geringen Anstieg der IgE-Konzentration im Blut, der maximal zweifach höher ist als der Kontrollwert (POTTER und WEDERBRAND 1995). In Vergleichstudien zwischen DNCB und TMA (welches auch ein “chemical respiratory allergen“ ist) stellte man fest, dass die Mobilisierung und damit die Migration von LC durch DNCB schneller vonstatten geht. Deshalb wird eine Beziehung zwischen der Migrationskinetik und der Art der TH-Antwort vermutet (CUMBERBATCH et al. 2003).
BÄUMER et al. (2004) stellten bei ihren Untersuchungen zur Kontaktallergie fest, dass bei DNCB in der Auslösephase CD8+-Zellen zu finden sind, während durch TDI vorherrschend CD4+-Zellen das Entzündungsgeschehen vermitteln und im Gewebe die Konzentrationen von IL-4 (TH-2 spezifisches Interleukin) erhöht sind. Ein ähnliches Bild ergibt sich bei dem Kontaktallergen Fluoresceinisothiocyanat (KIMBER und DEARMAN 2002). Bislang ging man davon aus, dass sich bei den Effektorzellen im Kontaktallergiemodell um CD8+-T-Zellen handelt und CD4+-T-Zellen die eine regulatorische Funktion einnehmen. Diese Theorie trifft aber nicht auf alle Kontaktallergien zu, sondern variiert in Abhängigkeit vom Allergen.
2.5 Arachidonsäurekaskade
Entzündungs- und Schmerzprozesse werden im Körper unter anderem durch Prostaglandine (Eicosanoide) vermittelt, die im Arachidonsäurezyklus durch die katalytische Aktivität der Cyclooxygenasen (COX-1, COX-2) aus ungesättigten Fettsäuren entstehen.
Durch Einwirkung physiologischer und pathologischer Stimuli auf Gewebsschichten wird enzymatisch Arachidonsäure aus Membranphospholipiden freigesetzt und durch Cyclooxygenasen in Prostaglandine umgesetzt (s. Abbildung 2-4). Von den zwei Isoformen der Cyclooxygenase wird die COX-1 konstitutiv exprimiert und ist für die Aufrechterhaltung homöostatischer Prozesse wie der Schleimproduktion im Magen, der Regulation der Nierendurchblutung verantwortlich. Eine kontinuierliche Exprimierung der COX-2 findet nur im Gehirn, der Niere und im Uterus statt.
Ansonsten wird die COX-2 erst nach Aktivierung der Zellen z.B. durch Cytokine (IL-1, TNF-α, IFN-γ), Mitogene oder LPS-induziert. Aus diesem Grund nimmt man an, dass die COX-2 eine Schlüsselrolle bei Entzündungsreaktionen für die Prostaglandinproduktion einnimmt (GUALDE und HARIZI 2004). Die wichtigsten Wirkungen von PGE2 auf die DC-Funktion sind in Tabelle 2-2 dargestellt.
Tabelle 2-2 Wirkung von PGE2 auf DC nach (GUALDE und HARIZI 2004)
PGE2
Dendritische Zellen
- IL 10 ↑ - IL-12; IL-6, ↓ - IL-1-β, TNF-α ↓;
- MHC-II ↓
- DC-Migration über CCR7/ CCL21, CCL19 ↑
Abbildung 2-4 Arachidonsäurezyklus nach (GUALDE und HARIZI 2004) PGE = Prostaglandine
LT = Leukotriene TX = Thromboxan
Phospholipase Steroide
Membranphospholipide
Arachidonsäure
PGG2 PGH2
Cyclooxygenase
(COX-1, COX-2) NSAID
Stimulus Ca2+
Steroide
TXA2, PGI2,PGD2, PGE2
Lipoxygenase
5-Hydroxy- peroxyeicosa- tetraensäure
LTA4
LTC4
LTD4
LTE4
LTB4
PGF2α
2.6 Testsubstanzen 2.6.1 Acetylsalicylsäure
Schon seit 2000 Jahren sind die therapeutischen Effekte salicinhaltiger Weidenrinde bekannt. Bei Salicin handelt es sich um ein Salicylalkoholglykosid, aus dem 1838 erstmals Salicylsäure gewonnen wurde. In den Pflanzen entsteht Salicylsäure durch Hydroxylierung von Benzoesäure (LEON et al. 1995).
Abbildung 2-5 Strukturformel von Acetylsalicylsäure
Salicylsäure wird bei rheumatischen Erkrankungen schon seit 120 Jahren gezielt eingesetzt (STRICKER 1876). Allerdings konnte der die PGE-Synthese hemmende Wirkungsmechanismus von Salicylaten und Acetylsalicylsäure (ASS), erst von VANE (1971) aufgeklärt werden. ASS (s. Abbildung 2-5) wird seit 1899 unter dem Namen Aspirin® verwendet und ist das bekannteste und am meisten genutzte analgetische und entzündungshemmende Medikament (D'ACQUISTO et al. 2002).
Pharmakologisch zählt ASS zu den NSAID, die als Gruppe aromatischer organischer Säuren (ohne Steroidgerüst) mit antiinflammatorischer, analgetischer und antipyretischer Wirksamkeit definiert werden. Es werden 2 Gruppen unterschieden:
1. Wirkstoffe mit einer deutlich zentralen analgetischen und antipyretischen, jedoch geringen entzündungshemmenden Wirkung. z. B. Paracetamol
2. Wirkstoffe, die vorwiegend peripher wirken und ausgeprägt inflammatorisch aber nur geringgradig antipyretische wirken. z. B. Salicylate (KIETZMANN et al. 2002)
Unmittelbar nach oraler Einnahme wird ASS in Salicylsäure deacetyliert, welche dann zu 80% an Plasmaproteine gebunden wird. Abhängig von der Konzentration beträgt die Halbwertszeit für ASS 15 Minuten, während Salicylate bis zu 30 Stunden im Blut wirksam sind (NEEDS und BROOKS 1985). Limitiert wird die Halbwertszeit von ASS durch Glucuronidierung oder Konjugation mit Glycin. Für eine wirksame entzündungshemmende Therapie müssen die Plasmawerte der Salicylate 150-300 µg/ml erreichen. Bei Gabe höherer Konzentrationen muss mit Nebenwirkungen wie Tinnitus, Hyperventilation und Azidose gerechnet werden (INSEL 1996).
Die Fähigkeit von ASS, die Prostaglandinsynthese zu hemmen, ist die grundlegende Basis der entzündungshemmenden Effekte der Salicylate. Der Wirkungsmechanismus beruht auf einer irreversiblen Acetylierung essentieller Aminosäuren auf der aktiven Seite der Cyclooxygenasen. Eine Bindung von Arachidonsäure an das Enzym ist nicht mehr möglich (DEWITT et al. 1990; ROTH und CALVERLEY 1994). Dieser Vorgang erfolgt nichtselektiv für COX-1 und COX-2.
Es ist zu beachten, dass die therapeutischen Plasmaspiegel von ASS bei Patienten mit chronisch entzündlichen Erkrankungen deutlich höher sind als die, die notwendig wären, um die Prostaglandinsynthese zu hemmen. Erstmals konnten KOPP und GOSH (1994) die Inhibierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, unabhängig von der Wirkung auf die Prostaglandinsysnthese, zeigen. Folgestudien bestätigten diese Ergebnisse (MITCHELL et al. 1997; HACKSTEIN et al. 2001; AMANN und PESKAR 2002). NF-κB reguliert die Transkription einer ganzen Reihe von Genen, die für proinflammatorische Enzyme, Chemokine, Zelladhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren und Immunrezeptoren codieren (D'ACQUISTO et al. 2002). In Abhängigkeit vom jeweiligen Zelltyp und Auslöser kann über NF-κB die Apoptose von Zellen sowohl induziert als auch gehemmt werden (TEGEDER et al. 2001). Das klassische NF-κB-Molekül ist ein Heterodimer, dass aus den Untereinheiten NF-κB1 und Rel A besteht und im Zytoplasma ruhender Zellen als inaktiver Komplex, der an hemmende Proteine (IκB) gebunden ist, vorliegt (LEE und BURCKART 1998). Durch verschiedene Stimuli, wie TNF-α, IL-1 oder LPS, wird ein inhibitorischer κB-Kinase- Komplex (IKK) aktiviert, wodurch IκB proteolysiert und NF-κB freigesetzt wird. NF-κB wandert daraufhin aus dem Zytoplasma in den Kern, bindet dort an die κB-Stellen
der Promotor Regionen von Zielgenen und reguliert somit deren Transkription (s.
Abbildung 2-6) (AMANN und PESKAR 2002). ASS und Salicylate hemmen die durch Zytokine oder LPS-induzierte Phosphorylierung und Freisetzung von IκBα (PIERCE et al. 1996). Zudem sind die Substanzen in der Lage, direkt an IκBβ zu binden, so dass die ATP-Aufnahme kompetitiv gehemmt wird (YIN et al. 1998). Neuere Studien zeigen, dass Salicylate nicht nur NF-κB, sondern auch verschiedene andere zelluläre Kinasen hemmen können. Dies liegt daran, dass die durch NF-κB induzierte Transkription auch von der Koaktivierung anderer Transkriptionsfaktoren abhängig ist. Ein Beispiel dafür ist das Aktivator Protein-1 (AP-1), das ebenfalls durch ASS und Salicylate gehemmt werden kann (DONG et al. 1997). Es handelt sich um einen Proteinkomplex der durch UV-Licht, Wachstumsfaktoren, TNF-α und IL-1 aktiviert wird und Gene, die unter anderem für Immunität oder entzündliche Vorgänge verantwortlich sind, reguliert. AP-1 und NF-κB haben zum Teil die gleichen Zielgene und die Transkription vieler dieser Gene wird nur durch die gemeinsame Aktivierung von AP-1 und NF-κB gestartet (TEGEDER et al. 2001). So wird zum Beispiel durch die gemeinsame Hemmung von AP-1 und NF-κB auch die Expression der MMP-9 durch ASS und Salicylate gehemmt (MURONO et al. 2000).
Abbildung 2-6 Transkriptionsfaktor NF-κB (D'ACQUISTO et al. 2002)
2.6.1.1 Wirkung von Acetylsalicylsäure auf Immunzellen in vitro
Die Maturation der DC spielt eine wichtige Rolle für das Auswandern der Zellen und die Antigenpräsentation. So untersuchten HACKSTEIN et al. (2001) in vitro DC hinsichtlich ihrer Oberflächenmoleküle, ihrer Zytokinproduktion und Fähigkeit zur T- Zell-Stimulation. Dazu wurde aus dem Knochenmark von B10-Mäusen DC generiert und ab dem zweiten Tag mit ASS in unterschiedlichen Konzentrationen (0,5 mmol/l, 1 mmol/l, 2,5 mmol/l) behandelt. Am siebten Tag wurden die CD11c+-Zellen gewonnen und hinsichtlich ihrer Expression der Oberflächenmoleküle CD40, CD80, CD86 und MHC-II nach LPS-Gabe am sechsten Tag untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass schon 0,5 mmol/l ASS zu einer Reduzierung der Oberflächenmoleküle führen. Die beobachtete Wirkung von ASS war dosisabhängig und betraf vor allem
die Ausbildung von MHC-II und CD86. Untersuchungen von Kulturüberständen auf IL-10- und IL-12-Produktion ergaben, dass DC selbst nach LPS-Gabe zu keiner Sekretion von IL-10 fähig sind. Die durch Zugabe von GM-CSF, IL-4 und LPS verstärkte IL-12p70-Produktion der DC konnte bei ASS behandelten DC nicht beobachtet werden. In der Mixed-Leukocyte-Reaction (MLR), einem Test zur Untersuchung der Stimulation naiver T-Zellen durch DC, war die Fähigkeit dieser DC, T-Zellen zur Proliferation anzuregen, deutlich abgeschwächt und ging mit einer verminderten IL-2 Produktion einher. Die inhibitorischen Effekte von ASS beruhten nicht auf einer verminderten Zellvitalität (HACKSTEIN et al. 2001). In früheren Versuchen von MAZZEO et al. (1998) wurde anhand von humanen THP-1- Monozyten, die mit 1-5 mmol/l ASS behandelt wurden, eine Hemmung des Zytokins IL-12 p40 gezeigt, das als Reaktion auf verschiedene Stimuli gebildet wurde. Dieser Effekt beruht auf einer Hemmung der Aktivierung von NF-κB, welches durch Bindung an CD40 oder durch LPS aktiviert wird (MACKMAN et al. 1991; BERBERICH et al.
1994).
Auch MATASIC et al. (2000) beschrieben in ihren Versuchen die verminderte T-Zell- Stimulation ASS behandelter immaturer humaner monocyte derived DC, sowie die Hemmung der p40 Untereinheit von IL-12. Die Behandlung der DC mit ASS hemmt in vitro sowohl ihre Maturation als auch ihre Fähigkeit naive T-Zellen zur Proliferation anzuregen.
2.6.1.2 Wirkung von ASS auf Immunzellen in vivo
Aufschluss über die In-vivo-Effekte von ASS auf DC gibt eine Studie von HACKSTEIN et al. (2001). In einem Allergiemodell wurden DC mit Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) „gepulst“, also DC mit TNBS beladen und subkutan jeweils in die dorsale Ohrhälfte von Mäusen einer Gruppe injiziert. Eine andere Mäusegruppe erhielt mit ASS präinkubierte, aber mit TNBS gepulste DC.
Nach erfolgter Challenge sieben Tage später wurden die Effekte der ASS behandelten DC anhand der Ohrdicke der Tiere ermittelt. Während die TNBS behandelten Zellen eine starke T-Zell vermittelte Immunantwort hervorriefen, konnte
bei den Tieren, die mit ASS vorbehandelte DC erhielten, keine Überempfindlichkeitsreaktion anhand einer Ohrschwellung gezeigt werden. Da Negativkontrollen mitgeführt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass die TNBS ausgelöste Überempfindlichkeitsreaktion antigenspezifisch ist. Um sicherzustellen, dass die Behandlung mit ASS nicht die Migration der DC hemmt und dadurch die Reaktion ausbleibt, wurden die DC mit grünem Fluoreszenzfarbstoff markiert und mittels konfokaler Lasermikroskopie in den parakorticalen Bereichen der Lymphknoten nachgewiesen.
2.6.2 Indometacin
Das Indolessigsäurederivat Indometacin (s. Abbildung 2-7) gehört zu den am stärksten wirksamen nichtsteroidalen Antiphlogistika. Es zeichnet sich durch ein hohes analgetisches und antiphlogistisches Potential aus.
Abb 2-7 Strukturformel von Indometacin
Der Wirkungsmechanismus beruht auf einer reversiblen Hemmung der Cyclooxygenasen (HARIZI et al. 2001). Die Wirkung auf die COX-Aktivität ebenso wie die antiinflammatorische Wirkung von Indometacin ist deutlich stärker als die von ASS (FLOWER und VANE 1972; WHITTLE 1977). Bislang ging man davon aus, dass Indometacin keinen Einfluss auf IKK bzw. NF-κB ausübt (TEGEDER et al.
2001). Allerdings konnte in einer aktuellen Studie von (PRECIADO et al. 2005)
gezeigt werden, dass die Aktivierung von NF-κB in humanen Keratinozyten durch Gabe von 5 µg/ml und 20 µg/ml Indometacin signifikant gehemmt wird. Der genaue Wirkungsmechanismus der NF-κB-Hemmung ist noch nicht bekannt. In der Humanmedizin ist für die topische Anwendung unter anderem Elmetacin® zur Behandlung von Schmerzen, Entzündungen, Schwellung bei degenerativen Gelenkerkrankungen und rheumatischen Erkrankungen der Weichteile zugelassen.
In der Tiermedizin gibt es kein zugelassenes Präparat. Nach oraler Gabe wird Indometacin vollständig resorbiert und zu 90% an Plasmaproteine gebunden. Beim Menschen liegt die therapeutische Dosis bei 1-3 mg/kg. Bei Hund und Pferd ist die systemische Verabreichung dieser Mengen mit schweren Nebenwirkungen (perforierende Magen-Darm-Ulzera, Leukopenie, zentralnervöse Störungen etc.) verbunden. Topische Applikation von Indometacin führt zu niedrigen Konzentrationen im Plasma (< 0,1 µg/ml), aber es werden ausreichende Wirkstoffkonzentrationen im Entzündungsgebiet schon nach 2 Stunden erreicht (NOWACK et al. 1987;
UNGEMACH 2002).
2.6.2.1 Wirkung von Indometacin auf DC in vitro
HARIZI et al. (2002) untersuchten die Wirkung von Indometacin auf die Maturation dendritischer Zellen. Im Hinblick auf die Expression der Oberflächenmoleküle CD80, CD86, CD40, MHC-II und CD11c hatte Indometacin keinen Einfluss. Damit stimmen sie mit den Ergebnissen von (HACKSTEIN et al. 2001) überein, der bei Konzentrationen von 5 µmol/l Indometacin auch keine Hemmung der Maturation feststellen konnte, obwohl in diesen Konzentrationen sowohl die COX-1 als auch COX-2 gehemmt wurden. In diesen Konzentrationen hat Indometacin in der Zellkultur auch keinerlei Wirkung auf die IL-12-, TNF-α- oder IL-6-Freisetzung der DC nach LPS-Stimulation. Erst bei höheren Konzentrationen im mikromolaren Bereich hemmt Indometacin die TNF-α-Produktion (JÒZEFOWSKI et al. 2002). Da die Zellreifung dendritischer Zellen durch Indometacin nicht beeinträchtigt wird, sind die Zellen in der MLR zur Allostimulation fähig (HACKSTEIN et al. 2001). Die wichtigsten
unterschiedlichen Wirkungen von ASS und Indometacin sind in Tabelle 2-3 dargestellt.
Tabelle 2-3 Wirkung von ASS und Indometacin auf DC
DC ASS Indometacin
CD80, CD86, CD40,
MHC-II Hemmung der Expression Keine Hemmung der Expression IL10
IL12p40 Hemmung der Sekretion Keine Wirkung auf IL-12 Allostimulation von T-Zellen
durch DC Hemmung Keine Hemmung
2.6.3 Tepoxalin
Tepoxalin (s. Abbildung 2-8) gehört ebenfalls zu den NSAID und ist analgetisch wie antiphlogistisch wirksam. Tepoxalin hemmt dual sowohl die Cyclooxygenase als auch die 5-Lipoxygenase und damit die Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen (RITCHIE et al. 1995).
Abbildung 2-8 Strukturformel von Tepoxalin
Leukotriene entstehen aus dem Arachidonsäurezyklus (s. Abbildung 2-4) über das Enzym 5-Lipoxygenase. Leukotriene wirken chemotaktisch auf Entzündungszellen und steigern die Gefäßpermeabilität bei Entzündungen und allergischen Reaktionen, insbesondere bei Asthma bronchiale und anderen Hypersensibilitätsreaktionen vom Soforttyp (BERTOLINI et al. 2001). Dabei scheint Leukotrien B4 als stark wirksamer chemotaktischer Mediator eine Schlüsselrolle einzunehmen. Ein weiterer Wirkungsmechanismus von Tepoxalin ist die Inhibition von NF-κB (KAZMI et al.
1995). Es wurde früher angenommen, dass Leukotriene wichtige Faktoren für die IL- 2-Synthese sind, und somit die Tepoxalin bedingte Inhibition von IL-2 auf die
Hemmung der Lipoxygenase zurückzuführen ist (DORNAND et al. 1987). Heute weiß man, dass die Produktion von IL-2 eine Folge der Aktivierung von NF-κB ist. KAZMI et al. (1995) konnten eine dosisabhängige Inhibierung von NF-κB durch Tepoxalin in Jurkat- und HeLa-Zellen zeigen. Eine Aktivierung von AP-1 fand nicht statt. Im Gegensatz zu den anderen NSAID ist Tepoxalin nur im geringen Maße ulzerogen wirksam. Diese Eigenschaft ist wahrscheinlich auf die nur schwache Hemmung der Cyclooxygenase im Magen und der Inhibition der Leukotriensysnthese zurückzuführen (WALLACE et al. 1991). Denn ulzerative Veränderungen gehen mit erhöhten Konzentrationen von Leukotrienen, insbesondere von Leukotrien B4 einher (KIRCHNER et al. 1997).
Bislang ist Tepoxalin als Zubrin® nur für Hunde zur Behandlung von entzündlichen und schmerzhaften Skelett- und Muskelerkrankungen zugelassen. Die empfohlene Dosierung liegt 10 mg/kg.
2.6.3.1 Wirkung von Tepoxalin auf Immunzellen
In der Studie von RITCHIE et al. (1995) wurde die Wirkung von Tepoxalin auf verschiedene Zytokine, den Transkriptionsfaktor NF-κB und die Zellaktivierung anhand von humanen Blutzellen untersucht. Dazu wurden aus dem Blut der Probanden mononukleäre Zellen gewonnen, gewaschen, auf 96-Well-Platten verteilt und insgesamt für 72 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit verschiedenen Stimulantien [OKT3 und Tetradecanoylphorbolacetat (TPA)] behandelt und auf Proliferation der Zellen mit 3H-Thymidin untersucht. In dieser Studie hemmte Tepoxalin dosisabhängig die Proliferation von Lymphozyten mit einer IC50 von 6 μmol/l. Die Untersuchung der Überstände im ELISA ergab eine Inhibition der OKT3/TPA induzierten Sekretion der Zytokine IL-2, IL-6 und TNF-α im Bereich einer IC50 von 10-12 μmol/l. Die Zugabe von nur 0,52 μmol/l reichen aus, die Leuktrien B4- Produktion zu hemmen. Zytotoxische Effekte von Tepoxalin auf die Zellen wurde erst bei 100 μmol/l beobachtet.
Aufgrund der immunsuppressiven Wirkung verglichen ZHOU et al. (1994) die Wirkung von Tepoxalin mit Cyclosporin A anhand der Proliferation von T-Zellen, die
entweder mit OKT-3, TPA, IL-2 oder TPA mit Ionomycin stimuliert wurden. Dabei stellen sie fest, dass Tepoxalin in den OKT-3-stimulierten Zellen zwar die Proliferation hemmte, aber nicht, wie Cyclosporin, über eine Inhibition der IL-2- Produktion, sondern durch Unterdrückung der Signalweiterleitung von IL-2.
2.6.4 Diflorason 17,21-diacetat
Aufgrund ihrer antiinflammatorischen und immunsuppressiven Wirkung werden Kortikosteroide schon seit Jahrzehnten bei Autoimmunkrankheiten und allergischen Erkrankungen, wie zum Beispiel bei Asthma und atopischer Dermatitis eingesetzt (MATYSZAK et al. 2000; SIDBURY und HANIFIN 2000). Die Anwendung von Kortikosteroiden ist beschränkt aufgrund der Nebenwirkungen, wie Striae, Verdünnung der Epidermis und Dermis sowie Akne (MEINGASSNER et al. 2003).
Abbildung 2-9 Diflorason 17,21-diacetat
Topische Kortikosteroide lassen sich anhand ihrer Wirksamkeit in schwach wirksame, mittelstarke, starke und sehr starke Kortisone einteilen (LUBACH und KIETZMANN 1992). Diflorasondiacetat (s. Abbildung 2-9) gehört zu den stark wirksamen Dermatokortikoiden und findet seine klinische Anwendung in der Dermatologie zur Behandlung von Psoriasis, chronischen Ekzemen und seborrhoischem Ekzem des Kopfes (Florone®) in einer 0,05% Konzentration (PACKMAN 1992).
Die immunsuppressive Wirkung von Glukokortikoiden ist schon lange bekannt und wird unter anderem bei Transplantation von Geweben ausgenutzt. Sie beruht unter anderem auf einer Hemmung der chemotaktisch bedingten Leukozyteninfiltration, der IL-2-Freisetzung und damit der T-Lymphozytenproliferation, sowie einer Hemmung der IL-2-, IL-3-, IL-4-, IFN-γ - und GMCSF-Bildung durch T-Lymphozyten und der TNF-Produktion in Makrophagen (BLOCK et al. 1982; LUBACH und KIETZMANN 1992). Zudem hemmen Glukokortikoide die Phospholipase A2 und verhindern damit die Freisetzung von Prostaglandinen und Leukotrienen. Auch die Induktion der COX- 2 wird durch steroidale Antiphlogistika gehemmt (MASFERRER et al. 1990). Auf molekularer Ebene steigern Kortikosteroide die Expression von IκBα, wodurch die Translokation von NF-κB im Zytoplasma und damit die Aktivierung von Immungenen verhindert wird (BECKER et al. 1992b; AUPHAN et al. 1995; SCHEINMANN et al.
1995). Ein weiterer Mechanismus beruht auf der Interaktion zwischen NF-κB- Molekülen und dem Glukokortikoidrezeptor. Die Bindung von Glukokortikoiden an den Glukokortikoidrezeptor im Kern hemmt die aktivierte Rel/A Untereinheit, indem es die Transaktivierungsdomäne von NF-κB verändert (RAY und PREFONTAINE 1994; BROSTJAN et al. 1996). Somit kann NF-κB nicht mehr an die Zielgene binden.
Es ist auch denkbar, dass der Glukokortikoid-Rezeptorkomplex durch direkte Bindung an NF-κB im Zytoplasma die Translokation hemmt (ADCOCK et al. 1996).
Die topische Gabe von Diflorasondiacetat bewirkt histologisch eine Dickenabnahme der Epidermis und eine Abflachung der epidermalen-dermalen Zellverbindungen. In der Grundsubstanz reduziert sich die Menge an Glykosaminglykanen sowie die Dichte von Kollagenen und elastischen Fasern (LEHMANN et al. 1983).
2.6.4.1 Wirkung der Glukokortikoide auf Immunzellen in vitro
MATYSZAK et al. (2000) zeigten, dass immature, aus dem Knochenmark von Mäusen generierte DC nach einer Behandlung mit Dexamethason (10-6 mol/l) im Vergleich zu unbehandelten DC deutlich weniger MHC-II- und B7-2- Oberflächenmoleküle aufweisen. Auf die Expression der B7-1- und CD40-Moleküle hatte Dexamethason keinen Einfluss. Insgesamt war die Reifung der Zellen nach
LPS-Stimulation jedoch verzögert. Zudem ist die Allostimulationsfähigkeit in der MLR mit Dexamethason generierter DC gegenüber T-Zellen verringert. Dies äußert sich in einer geringeren Proliferationsrate und verminderter IL-2-Sekretion. Die Effekte der Kortikosteroide beschränken sich offensichtlich auf immature DC, da Zellen, in denen erst der Reifungsprozess mittels LPS initiiert wurde und die danach mit Dexamethason behandelt wurden, keine Veränderungen des Phänotypes aufweisen.
Die Möglichkeit der Apoptoseinduktion wurde in der FACS-Analyse mittels Annexin V und Propidium-Iodid-Färbung ausgeschlossen. In weiteren Untersuchungen konnten MATYSZAK et al. (2000) eine Hemmung der IFN-γ sezernierenden T-Zellen und der IFN-γ-Produktion zeigten. Die Hemmung dieser T-Zellen war in einem deutlich stärkeren Maße betroffen als die Hemmung der IL-4 produzierende T-Zellen. Die Effekte von Dexamethason sind wahrscheinlich auf eine Hemmung der TH-1-Antwort zurückzuführen, was auch im Einklang mit den Beobachtungen ist, dass Behandlungen mit Kortikosteroiden in vivo Überempfindlichkeiten vom Spättyp reduzieren (BECK et al. 1993; MATYSZAK und PERRY 1996; WANDINGER et al.
1998).
Auch MATASIC et al. (1999) untersuchten die Effekte von Dexamethason auf humane DC. Die Zellen wurden aus dem Blut gewonnen und mit GM-CSF und IL-4 inkubiert, bis sie sich in immature DC differenziert hatten. Auch hier wurde durch Dexamethason Zusatz (2-20 nmol/l) die Reifung immaturer DC gehemmt. Die Ausbildung der Oberflächenmoleküle CD40 und CD80 wurde runterreguliert, während CD14 und CD36 verstärkt exprimiert wurden. Desweiteren hemmt Dexamethason in maturen Zellen die IL-12-Sekretion. Mittels Gel Mobility Shift Assay konnte in den Zellen eine reduzierte NF-κB-Aktivierung gezeigt werden, die nicht mit einer Apoptose-Induktion einherging. Im Gegensatz dazu führt die Hemmung von NF-κB in B- und T-Zellen zur Apoptose (WU et al. 1996; BELLOSILLO et al. 1998).
2.6.4.2 Wirkung von Glukokortikoiden auf Immunzellen in vivo
Bereits BURROWS und STOUGHTON (1976) konnten eine Verhinderung der Sensibilisierung durch Kortikosteroide zeigen. CUMBERBATCH et al. (1999) untersuchten in einem Oxazolon Kontaktallergiemodell die Wirkungen von Dexamethason auf die Migration von LC. Die Anzahl der LC in den regionalen Lymphknoten konnte durch intraperitoneale Gabe von Dexamethason [0,1 µg, 1 µg, 25 µg jeweils pro Maus (20 g)] und anschließender Sensibilisierung mit Oxazolon (Ohrhaut) dosisabhängig um bis zu 80% reduziert werden. Die Migration von LC wird in der Sensibilisierungsphase maßgeblich von den Zytokinen TNF-α und IL-1β induziert. Da Dexamethason in dem Oxazolon-Kontaktallergiemodell keinen Einfluss auf eine durch TNF-α-induzierte Migration hatte, aber eine durch IL-1β-Gabe induzierte Ansammlung der DC in den Lymphknoten hemmte, kamen CUMBERBATCH et al. (1999) zu dem Schluss, dass LC durch Dexamethason nicht direkt beeinflusst werden, sondern indirekt durch Hemmung der Zytokine TNF-α und IL-1β, die sowohl auf transkriptionaler als auch auf posttranskriptionaler Ebene stattfindet. Von der Hemmung sind auch die Zytokine IL-6, IL-10, IL-12 betroffen (KERN et al. 1988; WAAGE und BAKKE 1988; KUNICKA et al. 1993). Eine Erklärung für die Hemmung der IL-1β-induzierten Migration ist der Umstand, dass IL- 1β ein weiteres Signal, nämlich TNF-α, benötigt, um die Migration auszulösen. IL-1β wird bei entzündlichen Vorgängen verstärkt von LC gebildet, wodurch parakrin die TNF-α-Produktion in Keratinozyten und folglich die Migration der LC angeregt wird (ENK und KATZ 1992; HEUFLER et al. 1992; ENK et al. 1993). Weiterhin wurde mittels immunhistochemischer Färbung die Anzahl der LC in der Epidermis bestimmt.
Durch Oxazolonbehandlung wird die Anzahl der LC deutlich reduziert. Keine Veränderung in der Anzahl der LC konnte durch intraperitoneal verabreichtes Dexamethason gezeigt werden. Allerdings bewirkt die topische Applikation von Kortikosteroiden bei Meerschweinchen und Mäusen eine Abnahme der LC in der Epidermis (BELISTO et al. 1982; MEINGASSNER et al. 2003). Die Abnahme der LC in der Epidermis ist auf Apoptose und nicht auf eine Auswanderung der Zellen zurückzuführen (MEINGASSNER et al. 2003).
3 Material und Methoden
3.1 Geräte und Reagenzien
3.1.1 Geräte für Versuche in der Zellkultur
Polypropylen-Röhrchen 15 ml/50 ml Greiner, Frickenhausen
Polystyrol-Petrischalen,
100 mm x 20 mm tissue culture dish cell+, Sarstedt Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen Kühlzentrifuge Centrifuge 5804 R, Eppendorf,
Hamburg
Brutschrank US AutoFlow, Zapf, Sarstedt
Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena
6-, 12-, 24-, 96-Well-Platten Greiner, Frickenhausen
Feinwaage Sartorius 2002 MP1, Sartorius, Göttingen
Neubauer-Zählkammer Albert Sass
Photometer MicoplateReader MRX, Dynatech
3.1.2 Reagenzien für Versuche in der Zellkultur
RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin
Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe Fetales Kälberserum (10 %) Biochrom, Berlin
β-Mercaptoethanol Sigma, Steinheim Granulocyte macrophage-
colony stimulating factor R&D System, Minneapolis, USA Natrium–Ethylendiamintetra-
essigsäure Merck, Darmstadt
Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt Lipopolysaccarid (LPS) Merck, Darmstadt
Ammoniumchlorid Merck, Darmstadt Ethylendiamintetraessigsäure Aldrich, Steinheim Kaliumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt
Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen
Trypan-Blau Sigma, Steinheim
Ethanol Sigma, Steinheim
Natriumhydroxid Merck, Darmstadt
Hepes -Puffer Sigma, Steinheim
3.1.3 Testsubstanzen
Acetylsalicylsäure Sigma-Aldrich, Steinheim
Salicylsäure Sigma, Steinheim
Indometacin Sigma-Aldrich, Steinheim Diflorasondiacetat
Reinsubstanz Basotherm, Bieberach a. d. Riss
Tepoxalin Zubrin®, Essex, München
3.1.4 TNF-α-ELISA/PGE
2-ELISA
DuoSet Mouse PGE2-ELISA R&D Systems, Minneapolis, USA Polystyrol-Nunc-Immuno-Platte Nunc GmbH, Wiesbaden
3.1.5 MTT-Test
CellTiter 96 AQueosOne solution cell proliferation Assay Promega, USA
3.2 Geräte für
In-vivo-VersucheEthanol Sigma-Aldrich, Steinheim
DMSO Merck, Darmstadt
Hydroxyethylcellulose Caesar & Loretz GmbH, Gilden
TDI Sigma, Steinheim
Aceton Sigma-Aldrich, Steinheim
Pipette 20 µl Eppendorf, Frickenhausen
