Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat auf

Die Migration der DC wird im Skin-DC-Migration-Assay durch ASS (systemisch), Indometacin und Diflorasondiacetat signifikant gehemmt. Die topische Applikation von ASS und die kombinierte Verabreichung von Tepoxalin inhibieren die DC-Migration in das Medium nur schwach signifikant. Die alleinige topische Gabe von Tepoxalin hat keine Wirkung. Die Hemmung der Migration durch ASS (systemisch) und Diflorasondiacetat kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden. Dabei spielt die Modulation der MMP-9, ebenso wie die Inhibition von NF-κB und der

TNF-α-Sekretion eine zentrale Rolle. Auch über die Hemmung der PGE2-Synthese im Ohrgewebe kann die Migration der DC beeinflusst werden. Für Tepoxalin (kombinierte Verabreichung) kann vermutlich der gleiche Wirkungsmechanismus für die Migrationshemmung angenommen werden, da es ebenfalls die aktive Form der MMP-9 inhibiert und die TNF-α-Sekretion durch Hemmung von NF-κB reduziert.

Allerdings wurde das Ohrhomogenat nicht auf die PGE2-Konzentration nach Behandlung der Tiere mit Tepoxalin untersucht. Die ausbleibende Wirkung nach topischer Applikation von Tepoxalin auf die Migration kann eventuell auf eine zu geringe Konzentration zurückgeführt werden, da mit Ausnahme MHC-II⁺-Zellen in der Epidermis, keiner der Untersuchungsparameter durch Tepoxalin signifikant beeinflusst wurde. Die topische Applikation von ASS hemmt weder die MMP-9-Aktivität, noch die PGE2-Konzentration im Ohrhomogenat, so dass man auch hier davon ausgehen kann, dass die TDI-induzierte TNF-α-Sekretion und PGE2-Sekretion eventuell nur in den oberen Zellschichten gehemmt wird. Die Vermutung, dass ASS nur in den oberflächlich gelegenen Gewebearealen wirksam ist, wird durch die Ergebnisse des Franz-Zell-Versuches bekräftigt. Dieser wurde in Analogie zu den In-vivo-Versuchen durchgeführt und ergab dass nur 1% der aufgetragenen Gesamtmenge ASS nach 17 Stunden durch die Haut resorbiert wurde (s. 4.2.7). Da Indometacin keinen modulierenden Effekt auf die MMP-9-Aktivität ausübt, wäre es denkbar, dass Indometacin zu einem früheren Zeitpunkt die Migration durch Hemmung der PGE2-Synthese beeinflusst. Denn die Migration der DC wird durch PGE2 vor allem über den EP4-Rezeptor reguliert (s. 2.4.2.1) (KABASHIMA et al.

2003; GUALDE und HARIZI 2004). Indometacin hemmt sowohl in vivo die TDI-induzierte PGE2-Produktion in den Ohrhomogenaten als auch in vitro die PGE2 -Sekretion der DC signifikant. Desweiteren könnte auch die Hemmung von NF-κB und damit der TNF-α-Sekretion eine Rolle spielen. Denn schon TARAYRE et al. (1984) vermuteten, dass Indometacin, außer der COX-Inhibition, über einen zusätzlichen Wirkungsmechanismus verfügt. Eine Hemmung von NF-κB duch Gabe von hohen Dosen Indometacin konnte von PRECIADO et al. (2005) in humanen Keratinozyten zeigen. Da in diesem Modell sehr hohe Dosen Indometacin verwendet wurden, liegt diese Vermutung ebenfalls nahe.

5.3.3 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat im LLNA

Die nach Behandlung der Tiere mit ASS (systemisch), Indometacin und Diflorasondiacetat, im Vergleich zur Vehikelgruppe, signifikant leichteren Lymphknotengewichte lassen auf eine wirkungsvolle Hemmung der T-Zellproliferation schließen. Einhergehend mit den niedrigeren Lymphknotengewichten ist auch die Gesamtzellzahl der Lymphknoten nach Gabe von ASS (oral) und Indometacin schwach signifikant und durch Diflorasondiacetat signifikant reduziert. Die proliferationshemmende Wirkung von ASS wurde von HACKSTEIN et al. (2001) in der MLR gezeigt, in der die Stimulationsfähigkeit der ASS behandelten DC gegenüber T-Zellen herabgesetzt war und mit einer verminderten IL-2-Sekretion der T-Zellen einherging. Der gleiche Versuch wurde mit Indometacin (5 µmol/l) behandelten DC in der MLR durchgeführt, wobei allerdings weder die Allostimulationsfähigkeit der DC noch die IL-2-Produktion der T-Zellen durch Indometacin herabgesetzt wurde. Ein Effekt auf die Maturation der DC durch Indometacin konnte in vitro ebenfalls nicht gezeigt werden (HACKSTEIN et al. 2001).

Im Gegensatz dazu konnte in einer weiteren Untersuchungen eine Hemmung der T-Zellproliferation nach Koinkubation Indometacin behandelter DC mit T-Zellen ab 5 µmol/l Indometacin beobachtetet werden (BÄUMER persönliche Mitteilung 2005). Da Indometacin die Auslösung der Kontaktallergie und in vitro die DC-Migration wirkungsvoll unterbindet, allerdings nicht die Anzahl CD11⁺-Zellen sowie CD11c- und CD40-doppeltpositiver Zellen in vivo signifikant beeinflusst, ist davon auszugehen, dass Indometacin direkt auf die T-Zellen einwirkt. Aufgrund der hohen Dosierung von Indometacin in diesem Modell lassen sich die In-vitro-Ergebnisse aus der MLR von HACKSTEIN et al. (2001) nicht auf In-vivo-Verhältnisse übertragen. Eine Inhibition von NF-κB und damit verbunden der IL-2-Sekretion ist sehr wahrscheinlich. In Korrelation zu den Lymphknotengewichten und der Gesamtzellzahl ist der Anteil CD11c⁺-Zellen, als Marker für alle DC, sowie die CD11c⁺-und CD40⁺-Zellpopulation, die den dermalen und epidermalen DC entspricht, im Lymphknoten nach ASS (systemisch) und Diflorasondiacetat Behandlung niedriger als bei der Vehikelgruppe.

Die Ergebnisse decken sich mit denen des Skin-Migration-Assay, der Zymographie

sowie der PGE2-Konzentration in den Ohrhomogenaten. Indometacin hemmt weder die Anzahl der CD11c⁺-Zellen, noch die Migration der CD11c⁺-CD40⁺-Zellen in den Lymphknoten, obwohl die Migration der DC im Skin-DC-Migration-Assay signifikant nach Indometacin-Behandlung inhibiert wurde. Daher müssen eventuell die Ergebnisse des Skin-DC-Migration-Assay vorsichtiger beurteilt werden, da auch BÄUMER et al. (2005) für Ciomilast ex vivo eine signifikante Hemmung der DC-Migration zeigen konnten, aber nur eine tendenzielle DC-Migrationsinhibition in vivo.

Nach topischer Applikation von ASS sind die Lymphknoten schwach signifikant leichter, aber die Gesamtzellzahl im Lymphknoten ist nur tendenziell reduziert.

Ansonsten hat ASS nach topischer Verabreichung keinen Einfluss auf die CD11c⁺ -Zellen und CD11c,CD40 doppeltpositive Zellpopulation.

Tepoxalin hat nach topischer Applikation weder einen Einfluss auf das Lymphknotengewicht, die Gesamtzellzahl, den Anteil CD11c⁺-Zellen, noch auf die CD11c⁺-und CD40⁺-Zellpopulation. Nur durch die kombinierte Behandlung, also oral und topisch, wird die Lymphknotengesamtzellzahl schwach signifikant inhibiert, die Parameter Lymphknotengewicht, CD11c⁺-Zellen, CD11c⁺-CD40⁺-Zellen tendenziell gehemmt. Die Resultate der kombinierten Behandlung stehen nicht im Einklang mit den Versuchen zur Migration der DC und der densitometrischen Auswertung. Zudem konnten ZHOU et al. (1994) eine proliferationshemmende Wirkung von Tepoxalin auf T-Zellen zeigen sowie eine Inhibition der IL-2-Signalweiterleitung (s. 2.8.1).

Vermutlich ist der ausbleibende (topisch) bzw. geringe Effekt von Tepoxalin (topisch und oral) auf eine zu niedrige Dosierung zurückzuführen. Denn immerhin wird eine gewisse Wirkung sowohl auf die T-Zellproliferation als auch auf die Migration der DC in vivo durch die kombinierte Behandlung erreicht.

5.3.4 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und Diflorasondiacetat auf die MMP-9

Die Aktivität der MMP-9 wird von ASS (systemisch), Diflorasondiacetat und Tepoxalin (kombibierte Verabreichung) gehemmt. Wie schon unter 5.2.2. und 5.3.2.

diskutiert, wird die MMP-9 Aktivität hauptsächlich durch die Zytokine IL-1β und TNF-α, die von DC und Keratinozyten nach Antigenkontakt gebildet werden, reguliert. Da

ASS, Tepoxalin und Diflorasondiacetat in vitro die TNF-α-Sekretion hemmen konnten und zugleich Inhibitoren des Transkriptionsfaktors NF-κB sind, liegt die Vermutung nahe, dass dieser Mechanismus eine Rolle bei der Inhibition der MMP-9 einnimmt (AUPHAN et al. 1995; RITCHIE et al. 1995; AMANN und PESKAR 2002). Es konnte zudem gezeigt werden, dass ASS die MMP-9-Aktivität sowohl in vivo als auch in vitro moduliert (MURONO et al. 2000; ABIRU et al. 2002). Die fehlende Wirkung von Indometacin auf die MMP-9 korreliert mit der In-vitro-Studie von ZHANG et al. (1998) an Monozyten. Die Gründe für die ausbleibende Wirkung nach topischer Applikation von ASS als auch von Tepoxalin wurden schon unter 5.3.2 diskutiert. Wahrscheinlich wirkt auch Diflorasondiacetat direkt auf die MMP-9-Aktivität ein (ALJADA et al. 2001).

5.3.5 Einfluss von ASS, Indometacin, Tepoxalin und

Diflorasondiacetat auf MHC-II

-Zellen in der Epidermis

Nach Behandlung und Challenge der Tiere wurden in der Epidermis verbliebenen LC anhand des MHC-II-Komplexes angefärbt. Bei den MHC-II⁺-Zellen handelt es sich um LC, was durch eine spezifische Immunhistochemie (Langerin⁺) bestätigt wurde (STOITZNER et al. 2003). Die mittels TDI-induzierte Migration der LC aus der Epidermis konnte durch alle eingesetzten Testsubstanzen bis auf die kombinierte Verabreichung von Tepoxalin signifikant inhibiert werden. Es konnten nur 3 Proben der Indometacin und nur 5 der Diflorasondiacetat behandelten Tiere ausgewertet werden. MEINGASSNER et al. (2003) stellten in ihrer Studie nach topischer Applikation von 1% Hydrocortison, 0,01% Clobetasol und 0,1% Betamethason über 5 Tage eine starke Abnahme der MHC-II⁺-Zellen aufgrund von Apoptose fest. Auch ARAKI et al. (1999) konnte eine Abnahme der LC in der Epidermis 48 Stunden nach Dexamethasonbehandlung (1%) zeigen. Der Grund, warum in der vorliegenden Arbeit keine Abnahme der LC-Dichte festgestellt werden konnte, kann wahrscheinlich auf die Dosierung und den frühen Zeitpunkt (17 Stunden nach Behandlung) der Untersuchung zurückgeführt werden. Studien über die Wirkung von Immunmodulatoren auf die LC-Dichte in der Epidermis in der Challengephase wurden von ARAKI et al. (1999) und BÄUMER et al. (2005) durchgeführt. Beide konnten zeigen, dass die allergeninduzierte Abnahme der LC-Dichte durch topische

Applikation von Immunmodulatoren gehemmt wird. Allerdings existieren einige Unklarheiten über die Migration der LC. KISSENPFENNIG et al. (2005) zeigten, dass eingewanderte dermale DC schon 24 Stunden nach TRITC- (Tetramethylrhodamineicothiocyanat-) Behandlung im drainierenden Lymphknoten zu finden sind, während die meisten LC erst nach 4 Tagen eingewandert sind. In der Arbeit von STOITZNER et al. (2003) dagegen stieg die Anzahl der LC im Lymphknoten bereits 24 Stunden nach TNCB-Gabe deutlich an. Somit liegt die Vermutung nahe, dass die Mirgationskinetik der LC durch die Entzündungsreaktion beeinflusst wird und damit vom jeweiligen Allergen abhängig ist.

Die Migrationshemmung der LC steht im Einklang mit den Ergebnissen des Skin-DC-Migration-Assay. Die Wirkung der Testsubstanzen ist auch hier wahrscheinlich auf eine Hemmung der TNF-α- und IL-1β-Freisetzung durch Keratinozyten zurückzuführen. In der Folge wird E-Cadherin nicht herunterreguliert und die LC können nicht aus der Epidermis auswandern. Aufgrund der sonst nur moderaten Effekte von ASS (topisch) und Tepoxalin (topisch) ist es verwunderlich, dass die beiden Substanzen die Migration der LC bis zum Niveau der unbehandelten Kontrolle hemmen konnten. Es könnte dadurch erklärt werden, dass beide Substanzen nur oberflächlich wirksam waren.

Obwohl die topische Applikation von Tepoxalin die LC-Migration aus der Epidermis signifikant hemmt, konnte nach der kombinierten Verabreichung von Tepoxalin trotz der gleichen topischen Dosierung keine Hemmung der LC-Migration beobachtet werden. Dieses Ergebnis ist nur dadurch zu erklären, dass eventuell der Antikörper nicht richtig an die MHC-II-Oberflächenmoleküle gebunden wurde. Denn die kombinierte, also topisch-systemische Behandlung, hemmt signifikant sowohl die In-vitro-Migration der DC, als auch die Expression der MMP-9.