der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Gewebsreaktionen auf Injektion des Flagellaten Trypanoplasma borreli in die Muskulatur
genetisch verschiedener Karpfen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Martina Borchardt
aus Göttingen
Hannover 2002
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Dieter Steinhagen
2. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 05. Juni 2002
1 EINLEITUNG...11
2 LITERATURÜBERSICHT ...12
2.1 Anatomie der Skelettmuskulatur des Karpfens... 12
2.2 Histologie der Skelettmuskulatur des Karpfens ... 14
2.3 Wundheilung und Regeneration des Muskelgewebes ... 17
2.4 Entzündung und unspezifische zelluläre Immunreaktionen bei Fischen... 20
2.4.1 Morphologie und Zytochemie der Leukozyten des Karpfens ... 26
2.4.1.1 Lymphozyten ... 27
2.4.1.2 Thrombozyten... 28
2.4.1.3 Neutrophile Granulozyten ... 28
2.4.1.4 Heterophile Granulozyten... 29
2.4.1.5 Eosinophile Granulozyten ... 29
2.4.1.6 Basophile Granulozyten... 29
2.4.1.7 Monozyten / Makrophagen... 30
2.5 Trypanoplasma borreli... 32
2.5.1 Biologie und Entwicklung... 32
2.5.2 Auftreten und Bedeutung ... 33
2.5.3 Pathologie... 34
2.5.4 Pathohistologie... 35
2.5.5 Immunität und Resistenz... 36
2.5.6 Diagnose und Behandlung ... 37
3 MATERIAL UND METHODEN...38
3.1 Versuchstiere... 38
3.2 Parasiten ... 39
3.4 Bestimmung der Parasitämie... 39
3.5 Gewinnung der Gewebeproben... 40
3.6 Probenbearbeitung für die Lichtmikroskopie ... 42
3.6.1 Histologische Präparate... 42
3.6.2 Tupfpräparate ... 43
3.6.2.1 Panoptische Färbung... 43
3.6.2.2 Myeloperoxidase-Färbung... 44
3.6.2.3 Unspezifische Esterase-Färbung... 44
3.7 Versuchsaufbau ... 45
4 ERGEBNISSE...47
4.1 Infektionsverlauf... 47
4.2 Lichtmikroskopische Ergebnisse... 47
4.2.1 Kontrollfische... 48
4.2.2 Infizierte Trypanoplasma borreli-empfängliche Karpfen... 52
4.2.3 Infizierte Trypanoplasma borreli-resistente Karpfen ... 55
5 DISKUSSION...68
5.1 Infektionsverlauf... 68
5.2 Wundheilung und Regeneration ... 68
5.3 Kinetik der Entzündung ... 70
6 ZUSAMMENFASSUNG ...77
7 SUMMARY ...79
8 LITERATURVERZEICHNIS...81
Abb. 1 A-D: Die Faltmuster der Myomeren eines typischen Knochenfisches 13 Abb. 2a: Querstreifung in starker lichtmikroskopischer Vergrößerung
beim nicht kontrahierten Muskel 16
Abb. 2b: Anordnung der Myosin- und Aktinfilamente im Querschnitt
der Myofibrille in Höhe des A-Streifens 16
Abb. 3: Zeitlicher Verlauf erhöhter Gefäßpermeabilität und Migration
neutrophiler Granulozyten in der akuten Phase der Entzündung 22 Abb. 4: Prozentuale Verteilung der Leukozyten im Blut gesunder Karpfen 31 Abb. 5a: Differenzierung von Leukozyten Trypanoplasma borreli-empfänglicher
Kontrollkarpfen auf Tupfpräparaten der Muskulatur 58 Abb. 5b: Differenzierung von Leukozyten Trypanoplasma borreli-empfänglicher
infizierter Karpfen auf Tupfpräparaten der Muskulatur 58 Abb. 6a: Differenzierung von Leukozyten Trypanoplasma borreli-resistenter
Kontrollkarpfen auf Tupfpräparaten der Muskulatur 59 Abb. 6b: Differenzierung von Leukozyten Trypanoplasma borreli-resistenter
infizierter Karpfen auf Tupfpräparaten der Muskulatur 59 Abb. 7: Histologisch unverändertes epaxiales Muskelgewebe eines Karpfens
im Querschnitt 61
Abb. 8: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 7 61
Abb. 9: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 7 61
Abb. 10: Querschnitt durch das Muskelgewebe eines Kontrollfisches
vier Stunden nach Injektion von PBS 61
Abb. 11: Peroxidase-gefärbtes Tupfpräparat des Muskelgewebes eines
Kontrollkarpfens vier Stunden p.i. 61
Abb. 12: Akut entzündetes Muskelgewebe eines Kontrollfisches an Tag 1 p.i. 61
Abb. 13: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 12 61
Abb. 14: Esterase-gefärbtes Tupfpräparat des Muskelgewebes eines
Kontrollkarpfens an Tag 1 p.i. 63
Abb. 15: Muskulatur eines Kontrollfisches zwei Tage nach Inokulation von PBS 63
Abb. 17: Muskelgewebe eines Karpfens 12 Tage nach intramuskulärer Injektion
von schwarzer Tusche 63
Abb. 18: Muskulatur eines Kontrollkarpfens vier Tage nach Inokulation von PBS 63 Abb. 19: Milzgewebe eines Karpfens 5 Tage nach intramuskulärer Injektion
von schwarzer Tusche 63
Abb. 20: Neubildung von Muskelfasern in traumatisiertem Muskelgewebe
eines Kontrollfisches an Tag 7 p.i. 65
Abb. 21: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 20 65
Abb. 22: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 20 65
Abb. 23: Muskulatur eines Kontrollkarpfens 10 Tage nach Inokulation von PBS 65 Abb. 24: Akut entzündetes Muskelgewebe eines mit Trypanoplasma borreli
infizierten Karpfens der empfänglichen Zuchtlinie an Tag 7 p.i. 65
Abb. 25: Ausschnittsvergrößerung aus Abb. 24 65
Abb. 26: Muskulatur eines infizierten Karpfens der empfänglichen Linie
10 Tage p.i. 67
Abb. 27: Subakut entzündetes Muskelgewebe eines infizierten Karpfens
der empfänglichen Linie an Tag 14 p.i. 67
Abb. 28: Trypanoplasma borreli auf panoptisch gefärbten Tupfpräparaten
des Muskelgewebes infizierter empfänglicher Karpfen an Tag 22 p.i. 55 Abb. 29: Ein sich im Teilungsstadium befindender Flagellat auf panoptisch
gefärbten Tupfpräparaten des Muskelgewebes infizierter
empfänglicher Karpfen an Tag 22 p.i. 55
Abb. 30: Subakut entzündetes Muskelgewebe eines infizierten Karpfens
der resistenten Zuchtlinie an Tag 18 p.i. 67
Abb. 31: Muskelgewebe eines infizierten Karpfens der resistenten Zuchtlinie
an Tag 22 p.i. 67
Abb. Abbildung bzw. beziehungsweise
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay et al. et alii (und andere)
Fa. Firma
g Gramm
Hrsg. Herausgeber
i.m. intra muskulär
l Liter
µl Mikroliter
µm Mikrometer
ml Milliliter
mm Millimeter
nm Nanometer
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) p.i. post inoculationem
s. siehe
SPF spezifisch-pathogen-frei
T. Trypanoplasma
u. und
cm Zentimeter
z. B. zum Beispiel
1 EINLEITUNG
Der Flagellat Trypanoplasma (T.) borreli ist bei freilebenden Karpfen weit verbreitet, induziert jedoch bei infizierten Fischen selten Todesfälle (SCHÄPERCLAUS 1990;
KÖRTING 2000). Ein Schutz vor T. borreli-Infektionen beruht vermutlich auf einer Produktion parasitenspezifischer Antikörper, welche ab der dritten Woche post infectionem im Serum der Karpfen nachweisbar sind (JONES et al. 1993; WIEGERTJES et al. 1995).
Karpfen des Stammes E 20 / R 6 sind für Trypanoplasma borreli hochempfänglich. Nach experimenteller Infektion der Fische betrug die Mortalitätsrate 100%, wobei im Serum keine spezifischen Antikörper detektiert wurden (WIEGERTJES et al. 1995). Karpfen dieses Stammes produzierten auch keine Antikörper gegen Antigene, wie Dinitrophenol (DNP), so daß WIEGERTJES et al. (1995) als Ursache der Mortalitäten eine B-Zell-Anergie annahmen.
Karpfen der hochempfänglichen Zuchtlinie sterben bereits ab der dritten Woche nach einer Infektion mit T. borreli, während im Serum infizierter, gegenüber T. borreli-resistenter Karpfen zu diesem Zeitpunkt jedoch noch ein Anstieg des Antikörper-Spiegels zu verzeichnen ist (WIEGERTJES et al. 1995; BUNNAJIRAKUL et al. 2000). Aufgrund dessen besteht die Vermutung, daß entzündliche Reaktionen, die bei Säugetieren in der frühen Phase einer Infektion mit Trypanosomen ein Abtöten des Erregers bewirken (DE BAETSELIER et al.
2001), bei mit T. borreli-infizierten empfänglichen Karpfen supprimiert sind. In in vitro- Studien konnten allerdings keine Unterschiede in der Aktivität von Phagozyten aus der Kopfniere empfänglicher und resistenter Karpfen gefunden werden (SCHARSACK 2001).
Deshalb wurden in dieser Studie mit histologischen Methoden zelluläre Reaktionen auf intramuskuläre Injektion von PBS oder Trypanoplasma borreli bei Karpfen, die eine unterschiedliche Empfänglichkeit für den Erreger aufwiesen, untersucht.
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Anatomie der Skelettmuskulatur des Karpfens
Die Skelettmuskulatur der Knochenfische ist, wie die aller anderen Wirbeltiere, aus quergestreiftem Muskelgewebe und Bindegewebe aufgebaut. Hinzu kommen nutritive Gefäße und Nerven. Die Struktur der quergestreiften Muskulatur besteht aus parallel verlaufenden, voneinander unabhängigen Muskelfasern, die sich isoliert kontrahieren (LAGLER et al. 1977;
AMLACHER 1992). Mehrere Fasern werden zu Myomeren zusammengefaßt. Diese sind rechts und links der Wirbelsäule symmetrisch angeordnet und durch bindegewebige Septen, Myosepten, voneinander getrennt (LEHMANN 1991). Die Ausbreitung von Infektionen und nekrotischen Prozessen innerhalb eines Myomers wird durch die Myosepten begrenzt (ROBERTS 2001). In manchen Fällen ist der Muskel zusätzlich von einer Faszie umgeben, die aus derben Bindegewebe besteht und teils zum Ursprung, teils zur Verschieblichkeit gegen die Umgebung dient. Bei den Teleosteern entspricht die Anzahl der Myomere gewöhnlich der Anzahl der Wirbel. Karpfen haben jedoch immer zwei Myomere mehr als Wirbelkörper, da zwei Wirbel modifiziert sind, um die Hinterhauptsregion des Kopfes mit zu formen (HARDER 1975).
Die Einteilung der Muskulatur des Fischrumpfes erfolgt in Körperquadranten. Jeder Quadrant ist vom benachbarten durch ein medianes und ein horizontales Septum getrennt. Die beiden Muskelgruppen dorsal des horizontalen Septums werden als epaxiale, die ventral gelegenen als hypaxiale Muskeln bezeichnet. Sowohl die epaxialen als auch die hypaxialen Myomerenquadranten sind in der Form abgeknickt, daß die einzelnen aufeinanderfolgenden Quadranten, mit der Spitze nach hinten, tütenförmig ineinandergreifen. So entstehen am horizontalen Septum, wo epaxiale und hypaxiale Myomerenquadranten gegeneinander grenzen, nach vorn gerichtete Muskelkegel (ROBERTS u. SCHLOTFELDT 1985) (s. Abb.
1).
Abb. 1: Die Faltmuster der Myomeren eines typischen Knochenfisches. A: detaillierte Seitenansicht der Oberflächenfältelung der epaxialen und hypaxialen Muskulatur. B u. C:
sekundäre Fältelung der Myomere von Rumpf bzw. caudalem Schaft. D: Ansicht eines Horizontalschnittes durch die epaxialen Muskeln, um das bogenförmige Erscheinungsbild der Myomere um das mediane Septum zu zeigen (Neuentwurf von GREER-WALKER 1970).
Das Muskelgewebe des Rumpfes ist mäßig durchblutet, es setzt sich vorwiegend aus weißen Muskelfasern zusammen, die sich schnell kontrahieren und schnell ermüden. Zwischen der epaxialen und hypaxialen Seitenmuskulatur liegt der Musculus lateralis superficialis. Dieser, aufgrund des höheren Myoglobingehaltes rot erscheinende Muskel, kontrahiert sich langsam.
Er zeichnet sich bei einigen Fischarten, wie z. B. Salmoniden, durch seinen hohen Fettgehalt aus. Durch das horizontale Myoseptum wird dieser Muskel in eine dorsale und ventrale Portion geteilt und hat die Form eines abgeflachten Keils, dessen Spitze zur Körpermitte hin gerichtet ist. Die Segmentierung der Myomere geht über ihn hinweg, so daß er in der Längsrichtung die gleiche Gliederung wie alle anderen Muskeln zeigt (LEHMANN 1991).
Nach außen hin sind die Myomere der Skelettmuskulatur mit den Bindegewebsfasern und dem Fettgewebe der Unterhaut (Hypodermis) verbunden. Daran schließt sich die Lederhaut (Dermis), bestehend aus einer gefäßreichen, nervenführenden, lockeren, oberen Schicht (Stratum spongiosum) und einer straffen, unteren Schicht (Stratum compactum), an. Die darauffolgende Oberhaut (Epidermis) ist ein mehrschichtiges, nicht verhorntes Epithel, das mit zahlreichen mukösen und serösen Drüsen versehen ist. Die oberen Zellen der Epidermis bilden eine schleimige Kutikula aus. Zum Körperinneren hin haben die Myomere Verbindung zum horizontalen und medianen Septum sowie zu angrenzenden Myosepten (AMLACHER 1992; OSTRANDER 2000).
Der größte Anteil der Rumpfmuskulatur des Fisches ist quergestreifte Muskulatur, die hauptsächlich der Fortbewegung dient. Das Prinzip ist die alternierende Kontraktion der Myomere beider Körperseiten, wodurch eine wellenförmige Bewegung des Körpers entsteht.
Mit Hilfe der Schwanzflosse erfolgt die Vorwärtsbewegung des Fisches (HARDER 1975).
Der übrige Anteil ist Elementen des knöchernen Skelettes zugehörig und für die kontrollierte Bewegung von Flossen, Augen, Kiemen und Kiefer verantwortlich (GROMAN 1982).
2.2 Histologie der Skelettmuskulatur des Karpfens
Histologisch stellt die quergestreifte Muskelfaser ein vielkerniges Plasmodium dar, das aus einem begrenzenden kernhaltigen Sarkolemm und der Grundsubstanz, dem Sarkoplasma, besteht. Darin eingebettet liegen die Myofibrillen (AMLACHER 1992). Die Zellkerne sind oval oder spindelförmig und variieren in ihrer Größe. Sie liegen exzentrisch unmittelbar unter dem Sarkolemm. Charakteristisch für quergestreifte Muskulatur ist das Vorkommen mehrerer Zellkerne in einer einzelnen Muskelfaser. Diese ist von feinem Bindegewebe, dem Endomysium, umgeben, welches Fibroblasten und ortsständige Makrophagen enthält. Diese spielen bei entzündlichen Prozessen eine wichtige Rolle bei der phagozytotischen Aufnahme von Pathogenen oder zerstörten Zellen. Das Sarkoplasma der Muskelfaser füllt den Raum zwischen den Myofibrillen aus, es versorgt diese mit Nährstoffen und spielt eine wichtige Rolle bei der Muskelkontraktion (HIBIYA 1982).
Wie auch beim Säugetier sind die Myofibrillen aus einer Vielzahl von Myofilamenten zusammengesetzt. Hierbei handelt es sich um Proteinfäden, von denen zwei unterschiedliche Typen vorkommen. Dünne Aktinfilamente, die etwa 10 nm dick und 1 µm lang sind, sowie dicke Myosinfilamente mit etwa 20 nm im Durchmesser und 1,5 µm an Länge. Die Filamente sind innerhalb des Muskelgewebes regulär angeordnet und verleihen ihm dadurch die charakteristische Querstreifung. Im Längsschnitt wechseln helle I-Streifen und dunkle A- Streifen periodisch ab. Im polarisierten Licht leuchtet der A-Streifen auf, er ist anisotrop. Der I-Streifen bleibt dunkel, er ist isotrop. Bei stärkerer Vergrößerung zeigt sich im Lichtmikroskop eine zusätzliche, dünnere Querstreifung: Innerhalb des I-Streifens liegt der Z- Streifen (Zwischenscheibe) und inmitten des A-Streifens eine H-Zone (helle Zone), die von einem dunklen M-Streifen (Mittelstreifen) durchzogen wird. Die Streifen kehren in gleicher Reihenfolge periodisch wieder, wobei eine Periode von Z-Streifen zu Z-Streifen reicht und als Sarkomer bezeichnet wird (s. Abb. 2a). Die Myofilamente sind so angeordnet, daß die dickeren Myosinfilamente nebeneinander liegend den A-Streifen der Myofibrille ergeben. Die dünneren Aktinfilamente liegen im I-Streifen und ragen zwischen die Myosinfilamente hinein, treten jedoch nicht in Kontakt mit den Aktinfilamenten jenseits des A-Streifens. Somit bleibt innerhalb des A-Streifens eine hellere Zone, der H-Streifen. Der in ihm liegende M-Streifen entsteht durch Proteine, die Querverbindungen zwischen Myosinfilamenten herstellen. Im Z- Streifen werden die Aktinfilamente benachbarter Sarkomere durch feinste Filamente so verknüpft, daß jedes Aktinfilament des einen Sarkomers mit mehreren des anderen Sarkomers verbunden ist. Während der Kontraktion gleiten die Aktinfilamente tiefer zwischen die Myosinfilamente, damit verschwindet der H-Streifen und der I-Streifen wird extrem schmal.
Im Endergebnis wird jedes Sarkomer und damit jede Muskelfaser stark verkürzt. Die Länge der Aktin- und Myosinfilamente bleibt dabei konstant.
Im Querschnitt einer Myofibrille sind dicke (Myosin) und dünne (Aktin) Filamente zu einem regelmäßigen Muster angeordnet. In Höhe des A-Streifens wird jedes Myosinfilament von sechs Aktinfilamenten, jedes Aktinfilament von drei Myosinfilamenten umgeben (hexagonale Gliederung) (s. Abb. 2b). Der Muskelfaser ist ein komplexes System von Tubuli zu eigen, das der Übertragung von Aktionspotentialen von der Zellmembran zu den Myofibrillen dient. Es besteht aus den T-Tubuli, die transversale schlauchförmige Einstülpungen des Sarkolemms darstellen sowie Tubuli aus glattem endoplasmatischen Retikulum, die parallel zu den
Myofibrillen verlaufen. An der Stelle, an der beide Tubuli-Typen in Verbindung stehen, sind sie zu Zisternen erweitert. Der Komplex einer Zisterne aus T-Tubuli und zwei angrenzenden Retikulum-Zisternen wird als „Triade“ bezeichnet (HARDER 1975; GROMAN 1982;
LEONHARDT 1990).
Abb. 2: a) Querstreifung in starker lichtmikroskopischer Vergrößerung beim nicht kontrahierten Muskel: Ein Sarkomer wird von zwei Z-Streifen (Z) begrenzt; dunkle A- Streifen (A) und helle I-Streifen (I) wechseln im Längsschnitt periodisch ab; inmitten des A- Streifens liegt eine H-Zone (H), die von einem dunklen M-Streifen (M) durchzogen wird.
b) Anordnung der Myosin- (MF) und Aktinfilamente (AF) im Querschnitt der Myofibrille in Höhe des A-Streifens (nach LEONHARDT 1990).
Nach STOSKOPF (1993) wird die Skelettmuskulatur anhand ihrer Morphologie und Physiologie in weiße und rote Muskulatur getrennt. Die weiße Muskulatur übernimmt den größten Anteil (epaxiale und hypaxiale Rumpfseitenmuskulatur) bei den meisten Fischarten.
Aufgrund des anaeroben Stoffwechsels ist sie für die kurze und schnelle Fortbewegung geeignet. Die rote Muskulatur (Musculus lateralis superficialis) ist besser durchblutet als die weiße, verfügt über einen aeroben Stoffwechsel und ist für kontinuierliches, langsames Schwimmen ausgelegt. Die hohe Anzahl von Mitochondrien in den roten, „langsamen“
Muskelfasern entspricht oft der in der Herzmuskulatur der Säugetiere (FERGUSON 1989).
Pelagisch lebende Fische, wie z. B. Thunfisch, Makrele und Hering, die kontinuierlich Myofibrillen
Sarkomer
MF AF
M H I A Z
schwimmen, haben eine sehr viel ausgeprägtere rote Muskulatur (HARDER 1975). Bei Salmoniden und einem Teil der Cypriniden findet man zwischen den roten und weißen Fasern rosafarbene, sogenannte „pink fibers“, die funktionell anscheinend zwischen den beiden Fasertypen einzuordnen sind (ROBERTS 2001). Bei den Salmoniden bilden diese schnellen, aeroben Fasern ein Mosaik zwischen der weißen und roten Muskulatur, während sie bei den Cypriniden eine größere Ausdehnung einnehmen (FERGUSON 1989). Die roten Muskelfasern messen etwa 50 µm, die weißen etwa 100 µm im Durchmesser (AMLACHER 1992). Im Querschnitt erscheinen die Zellgrenzen der roten Muskelfasern kreisrund, die weißen Fasern dagegen dreieckig, sechseckig oder polygonal (HIBIYA 1982). Im Gegensatz zum Säugetier, bei dem die Anzahl der sich entwickelnden Muskelfasern bereits zum Zeitpunkt der Geburt festgelegt ist, nimmt die Zahl der Muskelfasern des Fisches fast während seiner gesamten Lebenszeit stetig zu, was auf das Vorkommen von Myosatellitenzellen zurückzuführen ist (FERGUSON 1989). Diese Stammzellen des quergestreiften Muskelgewebes liegen der Muskelfaser außen an. Es sind schmale, bis zu 100 µm lange Zellen, deren Zellkerne lichtmikroskopisch nicht von denen der Muskelfaser differenziert werden können (RIBELIN u. MIGAKI 1975; LEONHARDT 1990).
2.3 Wundheilung und Regeneration des Muskelgewebes
Bei Fischen ist die Wundheilung weitgehend temperaturabhängig. Der Heilungsprozess wird bei steigender Temperatur beschleunigt und verläuft ähnlich wie bei Säugetieren (FINN u.
NIELSON 1971; ANDERSON u. ROBERTS 1975).
Nach KITT (1990) wird unter einer Wunde eine durch mechanische Einwirkung gesetzte Zusammenhangstrennung des Gewebes unter Substanzverlust verstanden. Verursacht durch ein Trauma, wie z. B. die intramuskuläre Injektion, entstehen im Wundbereich Kreislaufstörungen sowie Untergang des Muskelgewebes. Dieser findet bei Fischen in Form einer hyalinen Degeneration statt (ROBERTS 2001). Die intrazelluläre, hyalinschollige (Zenkersche) Degeneration wird auch bei Säugetieren als muskelspezifisch angesehen.
Histologisch ist erst eine glasig-eosinophile Homogenisierung der Myofibrillen sichtbar, die jedoch sehr bald in einen scholligen Zerfall übergeht (KITT 1990). Dabei ist das Endomysium der geschädigten Muskelfaser ödematisiert; es erfolgt eine Infiltration mit histiozytären Zellen
(Makrophagen), die für die Phagozytose der Zelltrümmer verantwortlich sind (RAEKALLIO 1970). OJALA (1968) fand in Muskelwunden von Säugetieren innerhalb von zwei Stunden Makrophagen und Fibroblasten innerhalb von sechs Stunden. Dieser als Resorption und Remotion bezeichnete Vorgang ist notwendig, um den Heilungsprozeß überhaupt in Gang zu setzen.
Die Fibroblasten wandeln sich unter Differenzierung von kollagenen Fasern in Fibrozyten um.
Mit der Zeit findet eine Entquellung des neugebildeten Bindegewebes statt, und es passt sich den herrschenden Druck-, Zug- und Scherrichtungen an (KITT 1990). Nach zehn Tagen beobachtete RAEKALLIO (1970), daß sich in dem geschädigten Bereich kollagenes Bindegewebe gebildet hatte, in das neugebildete Muskelfasern vordrangen. FINN und NIELSON (1971) fanden nach Wundsetzung bei Regenbogenforellen (Onchorhychus mykiss) innerhalb von vier bis acht Tagen erste Fibroblasten.
Bereits zwei Tage nach der Verletzung sind Gefäßsprossen zu sehen, die ein Kapillarnetz ausbilden. Gegen Ende des Wundheilungsprozesses bilden sich die meisten dieser Kapillaren wieder zurück (CLARK 1946; KITT 1990).
Inwieweit eine Wiederherstellung der geweblichen Kontinuität gelingt, ist vor allem von der Größe der Wunde und den betroffenen Gewebearten abhängig. Ist sie vollständig, so spricht man von Regeneration oder Restitution; wird der Defekt mit Ersatzgewebe ausgefüllt, so handelt es sich um eine Reparation (KITT 1990).
Die degenerativen und regenerativen Prozesse, die in der Muskulatur des Fisches stattfinden, gleichen denen der Säugetiere. Der Vorgang der Myophagie, die Regeneration und Fibrosierung geschehen, proportional zu der Temperatur der wechselwarmen Tiere, über einen längeren Zeitraum (FERGUSON 1989).
MAWDESLEY-THOMAS und BUCKE (1973) stellten 28 Tage nach mechanischer Traumatisierung der Skelettmuskulatur von Goldfischen (Carassius auratus) bei 17-21°C eine fast vollständige Degeneration der Muskelfasern fest, wobei der Verlust der Querstreifung erst gegen Ende zu erkennen war. Das Ausmaß der Schädigung war größer als erwartet, und die degenerativen Veränderungen schienen zu diesem Zeitpunkt die regenerativen weit zu übertreffen, was vermuten ließ, daß das Regenerationsvermögen der Muskulatur von
Goldfischen niedriger ist als angenommen. ROBERTS et al. (1973) beobachteten bei Gewebeschäden der Skelettmuskulatur, die jungen Lachsen (Salmo salar) bei der Markierung zugeführt wurden, daß bei einer Temperatur von 12°C bereits nach zweieinhalb Tagen das Sarkoplasma der stark traumatisierten Muskelfasern lysiert war und auch weniger geschädigte Fasern Anzeichen einer Degeneration mit zentraler Verlagerung der Zellkerne zeigten. Nach 32 Tagen war das schwer geschädigte Muskelgewebe vollständig durch Granulationsgewebe ersetzt. In dem nicht so stark geschädigten Bereich waren jedoch basophile Sarkolemmschläuche erkennbar, die auf eine Regeneration schließen ließen. ANDERSON und ROBERTS (1975) fanden in einer Studie an 15 Monate alten Lachsen bereits drei Stunden nach künstlicher Wundsetzung bei einer Umgebungstemperatur von 23°C Muskelnekrosen. Nach 31 Stunden waren einsprossende Gefäße zu sehen, die 18 Tage später nicht mehr auftauchten. Die Muskelfaserregeneration begann zwischen dem vierten bis siebten Tag, während sie bei einer Umgebungstemperatur von 5 und 10°C erst zwischen dem 8. und 38. Tag beobachtet wurde.
Bezüglich der Regenerationsfähigkeit der Fischmuskulatur fanden RIBELIN und MIGAKI (1975) heraus, daß diese nur in einem extrem begrenzten Ausmaß möglich ist. Die Heilung findet in Form von Faserregeneration oder Knospung der stimulierten Myosatellitenzellen statt, vorausgesetzt, es besteht keine extreme Schädigung (ROBERTS 2001). Eine Proliferation der Myosatellitenzellen mit zentraler Anhäufung von Kernen wird regelmäßig beobachtet (FERGUSON 1989).
Wie auch bei den höheren Wirbeltieren umfassen die regenerativen Prozesse Sarkolemmsprossung und Zellkernvermehrung. Von den noch intakten Parenchymzellen ausgehend, bilden sich als Sarkoblasten bezeichnete vielkernige Proliferationszentren, die die Regeneration steuern. Sarkoplasmaknospen, die zahlreiche Kerne enthalten, schieben sich in den Sarkolemmschlauch vor. Das Sarkoplasma differenziert sich zuerst unter Ausbildung seiner Längsstreifung und dann von Querstreifung aus. Die neugebildeten Muskelzellen sind zunächst als schmale Bänder sichtbar, die sich nach und nach verbreitern; dabei rücken auch die zuerst zentral gelegenen Kerne unter das Sarkolemm. Diese vollkommene Wiederherstellung der Skelettmuskelfaser ist nur möglich, wenn lediglich ihr Plasma und die Zellkerne degeneriert waren. Ist die Muskelfaser im ganzen verletzt, so ist ihre Kontinuität
nicht wieder herstellbar. Die durchtrennten Enden der Faser runden sich durch Myoplasmavermehrung ab. Die Kernvermehrung führt zu ganzen Kernhaufen, die im Querschnitt wie mehrkernige Riesenzellen, sogenannte Muskelriesenzellen, aussehen. Die Muskelknospen wachsen auch ein wenig in die Länge und spalten sich zum Teil in mehrere Zweige, können das entstandene Granulationsgewebe jedoch nicht durchwachsen. Beide Muskelstümpfe werden durch eine Narbe verbunden, die funktionell wie eine sehnige Inskription wirkt und somit ohne Einfluß auf die Kraftübertragung des Muskels ist (MAWDESLEY-THOMAS u. BUCKE 1973; KITT 1990).
2.4 Entzündung und unspezifische zelluläre Immunreaktionen bei Fischen
Die Entzündung ist eine Schutzreaktion des lebenden Organismus auf Gewebeschädigungen der verschiedensten Ursachen. Es resultieren morphologische und chemische Änderungen in Geweben und Zellen (SUZUKI u. IIDA 1992). Auch wenn sich gelegentlich eine schwere Krankheit als Folge der Entzündung entwickelt, so soll sie doch an der Stelle der Gewebeschädigung durch den Einsatz von geeigneten Zellen und Gewebsflüssigkeit helfen, die Homöostase zu erhalten und die Möglichkeit für eine Heilung schaffen. Wie auch der Wundheilungsprozeß ist der Verlauf der Entzündung bei Fischen temperaturabhängig, dabei aber dem der warmblütigen Wirbeltiere sehr ähnlich (ROBERTS 2001).
Die fünf Kardinalsymptome der akuten Entzündung „Calor, rubor, dolor, tumor et functio laesa“ (Erwärmung, Rötung, Schmerz, Schwellung und Funktionsstörung) sind bei den wechselwarmen Tieren unterschiedlich stark ausgeprägt, da die Körpertemperatur durch die Temperatur des umgebenden Wassers bestimmt wird. Somit ist fraglich, ob man bei Kaltblütern von dem Begriff der Erwärmung sprechen kann (FERGUSON 1989). Die Rötung entsteht durch eine Kapillarerweiterung und dem damit erhöhten Blutdurchfluß. Zur Schwellung des Gewebes kommt es aufgrund des Austritts großer Plasmaprotein-Moleküle, wie Fibrinogen und Immunglobulinen, aus den Kapillaren (ROBERTS 2001).
Die Bedingung für die Entwicklung einer Entzündungsreaktion besteht zum einen darin, daß die grundlegende Gewebestruktur auch nach Traumatisierung oder Schädigungen anderer Genese noch intakt ist und zum anderen eine ausreichende Blutversorgung gewährleistet
bleibt. Die Entzündungsreaktion zeichnet sich durch das Fehlen einer Spezifität aus. Die Reaktionen auf traumatische Läsionen, bakterielle, virale oder toxische Schädigungen sind grundsätzlich ähnlich. Der Entzündungsprozeß läßt sich in drei Phasen einteilen:
1) Vasodilatation und erhöhte Gefäßpermeabilität
2) Migration von Leukozyten aus Gefäßen in das entzündete Gewebe und Remotion von Zelltrümmern
3) Auflösung und Heilung.
Hierbei sind die Migration der Granulozyten und die Veränderungen an den Blutgefäßen die Hauptmerkmale des akuten Stadiums der Entzündung (ROBERTS u. SCHLOTFELDT 1985;
SUZUKI u. IIDA 1992) (s. Abb. 3). Die leukozytäre Antwort in Phase 2 besteht zunächst aus dem Anstieg der Anzahl an neutrophilen Granulozyten im Entzündungsbereich, welcher bereits eine Stunde nach der Verabreichung eines entzündungsauslösenden Stimulus beobachtet wird und einen Peak nach 48 Stunden erreicht. Dem folgend erscheinen Monozyten und Makrophagen (ALFONSO et al. 1998). An der akuten Entzündungsreaktion können auch eosinophile, bei manchen Fischarten außerdem basophile Granulozyten und Lymphozyten beteiligt sein.
Eine wichtige funktionelle Population der Leukozyten sind Phagozyten, die reizende Stoffe, Bakterien oder geschädigte Zellen und Gewebsanteile entfernen. Die Phagozytose beinhaltet das Aufnehmen, Abtöten und Auflösen von eindringenden Pathogenen. Dabei erfolgt als erstes eine Migration von Leukozyten an den Ort der Entzündung, daraufhin die Anheftung des Partikels an die Zelloberfläche, die Aufnahme mit Bildung eines Phagosoms und schließlich die Zerstörung des Partikels innerhalb des Phagosoms. Als eine Komponente der unspezifischen Immunität ist die Phagozytose als initialer Prozeß der zellulären Abwehr allen Fischarten gemein. Dabei nehmen Makrophagen und neutrophile Granulozyten den bedeutendsten Anteil an agierenden Zellen ein (SUZUKI u. IIDA 1992; IWAMA u.
NAKANISHI 1996).
Die erste Reaktion des Wirtsorganismus auf eine Schädigung findet im Bereich der Mikrozirkulation statt. Durch Vasodilatation und folgender Permeabilitätssteigerung treten Leukozyten aus den Gefäßen aus. Dieses geschieht als Antwort auf chemische Mediatoren,
die von bestimmten Plasmaproteinen (Komplementfaktoren und Immunglobuline) umgewandelt werden. Die erhöhte Permeabilität wird hauptsächlich durch Histaminfreisetzung aus Mastzellen bewirkt, wobei allerdings das Vorkommen von Histamin bei Fischen von manchen Autoren als fraglich angesehen wird (SUZUKI u. IIDA 1992;
ROBERTS 2001).
SUZUKI und HIBIYA (1983) nahmen nach Untersuchungen an Karpfen an, daß Histamin keine Bedeutung in Zusammenhang mit entzündlichen Vorgängen bei Fischen hat. ELLIS (1982) fand bei Fischen, im Vergleich zu Säugetieren, extrem niedrige Histaminspiegel.
Reaktionszeit (Stunden)
nG im Gewebe (---)
Extravasation von Farbstoff (µg) (—)
Abb. 3: Zeitlicher Verlauf erhöhter Gefäßpermeabilität () und Migration neutrophiler Granulozyten (nG) (---) in der akuten Phase der Entzündung. Die erhöhte Gefäßpermeabilität ist durch Extravasation von zuvor inokuliertem Farbstoff dargestellt (nach SUZUKI u. IIDA 1992).
Die leukozytäre Infiltration des entzündeten Gewebes wird durch wirtseigene, chemotaktische Faktoren eingeleitet. Der Vorgang der Chemotaxis ist spezifisch für bestimmte Zellen und beinhaltet die Migration der jeweiligen Leukozytenpopulation zum Ursprung der chemotaktischen Faktoren aufgrund eines Konzentrationsgradienten, der durch diese Faktoren
im geschädigten Bereich verursacht wird. Dazu zählen Komplementfaktoren (C3) und Fc- Fragmente von Immunglobulinen sowie Leukotrien B4 (LTB4) (SUZUKI u. IIDA 1992).
Das Komplementsystem besteht aus einem Enzymkomplex, der etwa 12 unterschiedliche Proteinkomponenten umfaßt, die im Serum und Gewebsflüssigkeiten vorkommen und wahrscheinlich von Makrophagen synthetisiert werden. Das Komplement besitzt aufgrund seiner lytischen Eigenschaften antimikrobielle Aktivität. Bei dem „klassischen Weg“ der Aktivierung ist das Antigen von spezifischen Antikörpern umhüllt. Dieser Komplex aktiviert nun das Komplementsystem, und die Zielzelle wird lysiert. Die zweite Möglichkeit der Aktivierung ist der „alternative Weg“; dieser beginnt in Abwesenheit von Antikörpern mit der Aktivierung von Properdin durch Stoffe, wie bakterielle Endotoxine, den Polysacchariden Zymosan oder Inulin, wodurch der Rest der Komplementkaskade in Gang gesetzt wird (ROBERTS 2001). GRIFFIN (1984) konnte in einer Studie an Regenbogenforellen zeigen, daß eine Migration neutrophiler Granulozyten über den „klassischen Weg“ der Aktivierung des Komplementsystems induziert wurde. Er vermutete, daß das Komplementsystem bezüglich der Chemotaxis beim Fisch eine ähnliche Rolle spielen könnte wie bei Säugetieren.
MACARTHUR und FLETCHER (1985) beobachteten an neutrophilen Granulozyten der Scholle (Pleuronectes platessa) Chemotaxis, die durch den „alternativen Weg“ der Aktivierung des Komplementsystems mittels Inokulation von bakteriellen Endotoxinen ausgelöst wurde. Sie vermuteten, daß dieser indirekte Weg zu einer verspäteten Leukozytenmigration führt, wie sie bei Entzündungen der Fische vorkommt.
Leukotriene und Prostaglandine sind Arachidonsäurederivate. Es sind bioaktive Substanzen, wie z. B. LTB4, die im entzündeten Gewebe produziert werden und als wichtige chemotaktische Faktoren fungieren (BRAY 1983).
Zytokine, wie Interleukin 1 (IL-1) und Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF α), sind mit an den Reaktionen auf entzündliche Prozesse beteiligt. TNF α ist der wichtigste Mediator bei der Antwort des Wirtsorganismus auf Gram negative Bakterien; gebildet wird er von Makrophagen. Außerdem kann dieser die Freisetzung von IL-1 und IL-6 einleiten. IL-1 wird bei Fischen von Epithelzellen, Makrophagen, Monozyten und neutrophilen Granulozyten gebildet und bei Kontakt mit Lipopolysacchariden der Bakterienmembranen freigesetzt (SECOMBES 1996; ROBERTS 2001). HOWELL (1987) fand bei Studien an Karpfen heraus,
daß Fischzellen in der Lage waren, ein Lymphokin zu produzieren, das die Migration von Leukozyten beeinflussen konnte.
Der erste Schritt zur Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe findet in Form einer Anheftung der Zellen an die luminale Oberfläche des Gefäßendothels statt. Bei Säugetieren geschieht dieses durch ein verändertes Adhäsionsverhalten der Leukozyten, bewirkt durch LTB4, sowie durch Änderung der Oberflächenproteine des Endothels und der Leukozyten durch IL-1 (LE u. VILCEK 1987).
Neben der für die akute Entzündung charakteristischen Neutrophilie und Monozytose im Blut kommt es erst zu einer Akkumulation von neutrophilen Granulozyten im entzündeten Bereich und dann zur Extravasation von Monozyten, die im Gewebe als Makrophagen bezeichnet werden (SECOMBES 1996). Bei entzündlichen Prozessen in der Skelettmuskulatur der Fische, die traumatischer, bakterieller oder parasitärer Genese sind, ist neben degenerativen Vorgängen sehr früh eine Infiltration mit Makrophagen und gelegentlich polymorphkernigen Leukozyten zu beobachten, die mit der Myophagie des nekrotischen Sarkoplasmas beginnen.
Ist das Geschehen infektiös, so kann eine Ausbreitung in das angrenzende Gewebe folgen und damit die Entzündung, Nekrosen und Fibrosierung gleichzeitig sichtbar sein (ROBERTS 2001). Zwar sind neutrophile Granulozyten zur Phagozytose fähig, jedoch haben Makrophagen weitaus größere Kapazitäten Partikel aufzunehmen (FERGUSON 1989).
Nach mechanischer Schädigung der Skelettmusklatur von Fischen fanden ROBERTS et al.
(1973) innerhalb von zwei Tagen eine Infiltration mit polymorphkernigen Leukozyten im Entzündungsbereich. Nach zweieinhalb Tagen waren phagozytierende gewebsständige Makrophagen (Histiozyten) zu sehen.
PHROMSUTHIRAK (1977) beobachtete bei Wundheilungsprozessen der Haut von Stichlingen (Gasterosteus aculeatus) innerhalb von 24 Stunden einen Einstrom neutrophiler Granulozyten im entzündeten Gewebe und im Verlauf von drei Tagen eine erhöhte Anzahl an Makrophagen. Er nahm an, daß die neutrophilen Granulozyten in nicht infiziertem, entzündetem Gewebe einen Schutz gegen opportunistische Pathogene bildeten. SUZUKI und HIBIYA (1986) untersuchten die Verhältnisse von Leukozyten im peripheren Blut und im entzündeten Gewebe von Karpfen. Es zeigte sich, daß die Infiltration mit Neutrophilen innerhalb eines Tages nach Traumatisierung stattgefunden hatte und danach ihre Anzahl
graduell wieder abnahm. Im peripheren Blut war innerhalb von 12 Stunden eine Neutrophilie zu sehen und gleichzeitig eine Verminderung der Zellen in der Kopfniere. Das ließ darauf schließen, daß neutrophile Granulozyten, die in der Kopfniere produziert und gespeichert werden, bei Entzündungen in den Blutkreislauf freigesetzt werden und durch Extravasation in das entzündete Gewebe gelangen. In der gleichen Studie stellten SUZUKI und HIBIYA (1986) fest, daß die Infiltration mit Makrophagen über einen längeren Zeitraum geschah und nach fünf Tagen ihr Maximum erreichte.
IGER und ABRAHAM (1990) beobachteten bei Karpfen eine schnelle und zahlreiche Infiltration mit basophilen Granulozyten während der Wundheilung.
Bei einigen Fischarten, wie auch beim Karpfen, kommen eosinophile Granulozyten im Blut vor, jedoch ist deren Funktion und Beteiligung an entzündlichen Prozessen noch ungeklärt (SUZUKI u. IIDA 1992).
Phagozyten sind in den ersten drei bis vier Tagen sehr aktiv, danach nimmt ihre Anzahl wieder ab. Das beruht einerseits auf der Emigration der Zellen, andererseits aber auch auf einer Zellyse, da neutrophile Granulozyten nach dem Absterben Lysozym freisetzen, was zur Lysis des umgebenden Gewebes und anderer neutrophiler Granulozyten führt. Trotz der teilweise fokalen Aggregation neutrophiler Granulozyten ist die Bildung von Eiter sowie von Abszessen bei Fischen viel seltener als bei anderen Wirbeltieren (FERGUSON 1989;
ROBERTS 2001).
Nach zellulärer Infiltration und Phagozytose beginnen regenerative Prozesse in dem betroffenen Gewebe, wenn die Entzündungsursache eliminiert werden konnte. Werden weiterhin Reaktionsprodukte der Entzündung in Form von flüssigem oder zellulärem Exsudat gebildet, so entwickelt sich eine purulente, seröse, fibrinöse oder diphtheroide Entzündung. Ist die Zell- und Gewebsschädigung tiefgreifend, aber grundsätzlich reversibel, so folgt der Zelltod, der sich im histologischen Präparat als Nekrose manifestiert.
Kommt es nach einiger Zeit nicht zum Abklingen der akuten Entzündung, so entwickelt sich aus ihr eine chronische Entzündung (ROBERTS 2001). Typisch für den chronischen Verlauf ist die Bildung von Granulomen, die aus einer organisierten Ansammlung von reifen mononukleären Phagozyten und fibrösem Gewebe bestehen. Möglicherweise ist dies ein
Versuch in den Organismus eingedrungene Antigene, die der akuten Entzündungsreaktion entgehen, zu isolieren und zu zerstören. Lymphozyten erscheinen oft im frühen Stadium der chronischen Entzündung, gefolgt von einer starken Infiltration mit Makrophagen und gleichzeitiger Monozytose. Die Makrophagen aggregieren zu einem Granulom, das aus Epitheloidzellen und vielkernigen Riesenzellen besteht (SECOMBES 1996). Eine Besonderheit des chronischen Entzündungsgeschehens bei Fischen ist das Auftreten von melanin- oder anderen pigmenthaltigen Makrophagen, den Melanomakrophagen. Sie bilden in der Milz, Niere und Leber Aggregate, sogenannte Melanomakrophagenzentren (MMC) und kommen gelegentlich auch im zirkulierenden Blut vor. Es wird angenommen, daß das Melanin freie Radikale, die von eindringenden Antigenen gebildet werden, abfängt und damit das umgebende Gewebe des Wirtsorganismus vor weiterer Schädigung schützt (FERGUSON 1989).
LAMERS und DE HAAS (1985) beobachteten bei Karpfen nach Inokulation von Aeromonas hydrophila eine Akkumulation von phagozytiertem Antigen in Milz und Niere. Über einen Zeitraum von 12 Monaten fanden sie in beiden Organen Melanomakrophagenzentren, in denen das Antigen lokalisiert war. In einer anderen Studie stellten LAMERS und PARMENTIER (1985) bei Cypriniden, denen Tusche-Partikel intraperitoneal inokuliert wurden, ähnliches über den Verbleib der inerten Partikel und die Bildung von MMCs fest.
2.4.1 Morphologie und Zytochemie der Leukozyten des Karpfens
Die Charakterisierung der Leukozyten von Fischen basiert hauptsächlich auf morphologischen Ähnlichkeiten mit Leukozyten der Säugetiere und auf dem Verhalten der Fisch-Leukozyten bei hämatologischen Färbungen (ROWLEY et al. 1988).
Zur Identifizierung von Leukozytentypen und Charakterisierung der Zellfunktionen sind monoklonale Antikörper von großer Bedeutung, die spezifisch an unterschiedliche Zelloberflächenmoleküle binden. Diese definierten Moleküle werden bei humanen und murinen Leukozyten als CD-Antigene (clusters of differentiation) bezeichnet. Bisher stehen für Leukozyten des Fisches nur wenige monoklonale Antikörper zur Verfügung. Für Karpfen sind zum Beispiel drei monoklonale Antikörper gegen Immunglobuline von B-Zellen bekannt
(WCI 4, WCI 12 u. WCI M). Eine noch geringere Anzahl ist bisher gegen „nicht-B-Zellen“
von Fischen, wie E3D9 gegen polymorphkernige Leukozyten von Lachsen, verfügbar (PASTORET et al. 1998). Gegen Granulozyten und T-Zellen von Karpfen sind hingegen keine monoklonalen Antikörper kommerziell erhältlich. Zwar wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen Subpopulationen von Monozyten und Makrophagen beschrieben, jedoch zeigen diese Kreuzreaktionen mit Thrombozyten und lassen daher keine eindeutige Identifizierung von Zellpopulationen zu (laut persönlicher Mitteilung von Dr. G.
Wiegertjes, Universität Wageningen, Niederlande).
Für den Karpfen sind folgende Leukozyten beschrieben worden: Lymphozyten, Thrombozyten, neutrophile Granulozyten, heterophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, basophile Granulozyten und Monozyten / Makrophagen (TER HÖFTE et al.
1984; LEHMANN et al. 1994).
Einen Überblick über die Leukozytenverteilung im Blut des Karpfens gibt die Abbildung 4.
2.4.1.1 Lymphozyten
Lymphozyten sind in Form von T-Zellen und Antikörper-produzierenden B-Zellen für die spezifische Immunreaktion verantwortlich (ROBERTS 2001). Die Größe der fixierten Zellen beträgt 5 µm (kleine Lymphozyten) bis 11 µm (große Lymphozyten). Sie haben eine runde bis leicht ovale Zellform mit einem runden, fast die gesamte Zelle ausfüllenden Kern, der bei kleinen Lymphozyten dicht und bei großen aufgelockert erscheint. In der panoptischen Färbung nach Pappenheim stellt sich das Zytoplasma, das oft nur als schmaler Saum zu erkennen ist, leicht basophil dar. Kleine Lymphozyten können mit Thrombozyten, große mit Monozyten verwechselt werden. Enzymzytochemisch zeigt die unspezifische Esterase eine leichte, diffuse Reaktion. Die Periodsäure-Schiff-Reaktion (PAS) erbringt eine schwache, diffuse Anfärbung des gesamten Zytoplasmas (TER HÖFTE et al. 1984; LEHMANN et al.
1994).
2.4.1.2 Thrombozyten
Thrombozyten sind für die Blutgerinnung verantwortlich. Die fixierten Zellen sind bei rundlicher Form etwa 5 bis 8 µm, als Spindelform etwa 4 bis 6 x 10 bis 14 µm groß. Der Zellkern füllt fast die gesamte Zelle aus, er ist bei den rundlichen Thrombozyten rund und bei den spindelförmigen langgestreckt. Das Zytoplasma erscheint in der panoptischen Färbung hyalin und ist leicht rötlich angefärbt. Eine dritte Form ist der sogenannte „erschöpfte“
Thrombozyt. Dieser besitzt einen kleinen, dunkelgefärbten Kern, der von einem schmalen Zytoplasmasaum umgeben ist, weshalb er leicht mit kleinen Lymphozyten verwechselt werden kann. Zytochemisch ist eine negative unspezifische Esterase-Reaktion sowie eine schwach positive PAS-Reaktion zu erkennen (LEHMANN et al. 1994; ROBERTS 2001).
2.4.1.3 Neutrophile Granulozyten
Der neutrophile Granulozyt fungiert als Mediator bei akuten Entzündungsreaktionen (SUZUKI u. HIBIYA 1986). Inwieweit Neutrophile zur Phagozytose fähig sind, variiert innerhalb der Fischarten und der Individuen (MORITOMO et al. 1988). Bei den meisten Arten besitzen sie eine phagozytäre Aktivität (MACARTHUR u. FLETCHER 1985).
Morphologisch erscheint der neutrophile Granulozyt bei Karpfen nach Fixation 9 bis 13 µm groß mit runder bis leicht ovaler Zellform. Der Kern liegt exzentrisch und hat eine längliche, gekrümmte (stabkernig) oder segmentierte (segmentkernig) Form. In der Regel kommen beim Karpfen nicht mehr als zwei Segmente vor. In der panoptischen Färbung zeigen sich im hyalinen Grundplasma feine, leicht orange angefärbte Granula. Vereinzelt können auch kleine, nicht anfärbbare Vakuolen auftreten. Enzymzytochemisch zeigt sich eine deutliche bis sehr starke positive Peroxidase-Reaktion. Die Peroxidase stellt ein eindeutiges „Leitenzym“ für die neutrophilen Granulozyten des Karpfens dar. Weiterhin ist eine deutlich positive PAS- Reaktion sowie eine negative Esterase-Reaktion zu beobachten (LEHMANN et al. 1994).
2.4.1.4 Heterophile Granulozyten
Der fixierte heterophile Granulozyt ist 10 bis 12 µm groß. Er ist rund und hat einen meist exzentrisch gelegenen, runden und kompakten Zellkern. Panoptisch nach Pappenheim gefärbt, finden sich rot-violette oder violette Granula unterschiedlicher Größe in dem hyalinen, farblosen Zytoplasma. Bei einem Großteil dieser Zellpopulation lassen sich die Granula nur schwer anfärben oder fehlen fast vollständig. Zytochemisch stellen sich die Heterophilen schwach PAS-positiv sowie Peroxidase- und Esterase-negativ dar (LEHMANN et al. 1994).
2.4.1.5 Eosinophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten spielen bei entzündlichen Prozessen und als phagozytierende Zellen eine Rolle, obwohl generell über ihre An- und Abwesenheit bei Fischen noch viele gegensätzliche Behauptungen existieren (ROBERTS 2001). Die Größe der fixierten Zellen beträgt 10 bis 12 µm bei rundlicher Form. Der Zellkern ist randständig, rund bis oval und pyknotisch. In der panoptischen Färbung sind große, leuchtend rote, runde bis ovale Granula zu sehen. Das Zytoplasma ist haylin und leicht basophil. Zytochemisch läßt sich nur schwer eine eindeutige Differenzierung dieses Zelltyps bei Karpfen durchführen; eindeutig ist lediglich die fehlende Peroxidase-Aktivität (TER HÖFTE et al. 1984; LEHMANN et al.
1994).
2.4.1.6 Basophile Granulozyten
Das Vorkommen von basophilen Granulozyten bei Fischen wird, wie das von Eosinophilen, von einigen Autoren behauptet und von anderen bestritten. Bisher wurden sie nicht mit Abwehrmechanismen bei Fischen in Zusammenhang gebracht. Sie zeigen zwar Ähnlichkeiten mit den Mastzellen der Säugetiere, es ist jedoch noch unklar, ob sie auch dementsprechende Funktionen haben (ROBERTS 2001). Morphologisch handelt es sich um 9 bis 13 µm große, fast kreisrunde Zellen, die einen exzentrisch gelegenen, pyknotischen Kern aufweisen. Das schaumige, wabenartige Zytoplasma geht keine Färbereaktion ein. Bei der panoptischen Färbung werden die sonst dicht gepackten, groben Granula herausgewaschen. Zytochemisch
sind die Verhältnisse analog denen der eosinophilen Granulozyten (TER HÖFTE et al. 1984;
LEHMANN et al. 1994).
In der Fachliteratur besteht über das Auftreten sowie über die Nomenklatur der verschiedenen Granulozytenpopulationen Uneinigkeit. AINSWORTH (1992) fand bei einigen Fischarten neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, während andere Arten nur einen oder zwei Zelltypen besaßen. Bei Karpfen und Schleie beobachtete BIELEK (1981) alle drei Zelltypen, bei der Regenbogenforelle jedoch keine basophilen Granulozyten. Sowohl TER HÖFTE et al. (1984) als auch HAMERS (1994) und LEHMANN et al. (1994) stellten bei Karpfen das Vorkommen aller drei Zellpopulationen fest und beschrieben zusätzlich noch eine vierte, den heterophilen Granulozyten. FERRER et al. (1993) hingegen differenzierten anhand elektronenmikroskopischer Bilder nur zwei Granulozytentypen des Karpfens und bezeichneten diese als TG Leukozyten (Thick Granules) und FG Leukozyten (Fine Granules).
DOMBROWSKI (1953) beschrieb nur eine Granulozytenart im Blut von Karpfen und nannte sie „Leukozyt“.
Der neutrophile Granulozyt wird von einigen Autoren als heterophiler Granulozyt, Leukozyt Typ I (ROBERTS 2001), feiner oder spezifischer Leukozyt oder als polymorphnukleärer (PMN) Leukozyt bezeichnet (FÄNGE 1992).
2.4.1.7 Monozyten / Makrophagen
Die aus dem renalen hämatopoetischen Gewebe stammenden und im Blut zirkulierenden Monozyten sind unmittelbar in der Lage, ihre spezifische Funktion innerhalb des mononukleären Phagozytosesystems als Makrophagen in den verschiedenen Geweben aufzunehmen. In Verbindung mit lokalen, gewebsständigen Makrophagen phagozytieren sie, z. B. bei entzündlichen Vorgängen, Zelltrümmer und Erregerzellen (ROBERTS 2001).
Aktiviert werden Makrophagen durch ein Lymphokin, den Makrophagen-Aktivierenden- Faktor (MAF), welcher von T-Lymphozyten produziert wird (SECOMBES 1996). Sie sind für die Antigenpräsentation (VALLEJO et al. 1992) sowie für die Produktion von Zytokinen (SECOMBES 1991) und anderen immunmodulierenden Faktoren, wie Leukotrienen und
Lipoxinen, verantwortlich (SECOMBES u. FLETCHER 1992). Monozyten sind nach Fixation 8 bis 13 µm groß, mehr oval als rund mit meist exzentrisch gelegenem, ovalem oder leicht bohnenförmigem Kern. Bei panoptischer Färbung stellt sich das Zytoplasma deutlich basophiler als das der Granulozyten dar. Es erscheint hyalin und ohne Granula, wobei kleine bis mittelgroße Vakuolen auftreten können. Kleine Monozyten sind mit großen Lymphozyten verwechselbar. Makrophagen zeigen völlig unregelmäßige Kern- und Zellformen mit gelappten oder zerfransten Zytoplasmarändern. Das mittelbasophile Zytoplasma ist von großen, nicht anfärbbaren Vakuolen erfüllt und enthält meist phagozytiertes Material.
Zytochemisch zeigen die Zellen beim Karpfen eine deutlich positive Reaktion der unspezifischen Esterase. Die PAS-Reaktion verläuft wechselnd (TER HÖFTE et al. 1984;
LEHMANN et al. 1994).
Abb. 4: Prozentuale Verteilung der Leukozyten im Blut gesunder Karpfen - ohne Thrombozyten (nach LEHMANN et al. 1994).
Lymphozyten 56,6 %
Granulozyten 24,23 %
Monozyten 12,44 %
Granulozyten
Eosinophile 0,06 % Basophile 1,78 % Heterophile 4,71 % Segmentkernige 4,51 % Stabkernige 9,28 % Metagranulozyten 3,89 %
2.5 Trypanoplasma borreli
2.5.1 Biologie und Entwicklung
Trypanoplasmen sind kinetoplastide Flagellaten aus dem Blut von Fischen und Amphibien, die sowohl bei Meerwasser- als auch bei Süßwasserfischen vorkommen (KRUSE et al. 1991).
In der Systematik der Protozoa sind sie dem Stamm der Euglenozoa zugehörig.
Trypanoplasma borreli wurde 1901 von LAVERAN und MESNIL beschrieben, die den Gattungsnamen Trypanoplasma für Hämoflagellaten mit zwei Geißeln, im Gegensatz zu einfach begeißelten Trypanosomen, festlegten. Die bei Fischen bekannten Trypanoplasmen und Trypanosomen ähneln entsprechenden Formen der Warmblüter (KÖRTING 2000).
Trypanoplasma borreli ist ein Blutparasit bei Karpfen und Schleien und dringt nicht in Zellen ein (LOM 1979). Trypanoplasmen erscheinen pleomorph und ändern ihre Gestalt mit der Bewegung sehr viel stärker als Trypanosomen. T. borreli ist ca. 17 bis 26 µm lang, 2,5 bis 5 µm breit und besitzt zwei Geißeln, die aus der Geißeltasche am Vorderende der Zelle entspringen. Die längere, rückläufige Geißel verläuft an der linken Seite und begrenzt eine undulierende Membran. Ein einzelner großer, länglicher Kinetoplast befindet sich am Vorderende, wo das punktförmige Ende dem Geißelkinetosom gegenüberliegt (WOO 1987;
KRUSE et al. 1989). Der Kinetoplast besteht aus einem Netzwerk aus DNA-Fasern, die im Gegensatz zu Trypanosomen nicht in Mini- und Maxikreise organisiert sind. Dem Kinetoplasten gegenüber liegt der runde Zellkern. Bei Blutstromformen ist die Zellmembran von einer dicken Außenschicht überzogen (LOM u. DYKOVÁ 1992). Sowohl Trypanoplasmen als auch Trypanosomen der Fische besitzen in gleicher Weise wie Trypanosomen der Warmblüter einen „Surface coat“, der für antigene Eigenschaften verantwortlich ist (FENG u. WOO 1998).
Unterschiedliche Entwicklungsstadien der Hämoflagellaten sind im Verlauf des Entwicklungszyklus nicht feststellbar. Es werden lediglich einige Veränderungen in der Form, abhängig vom Grad der Parasitämie, beobachtet (KRUSE et al. 1989). Kleine schlanke Formen von T. borreli sind zu Beginn der Parasitämie, bei 20°C Wassertemperatur, an Tag 8 p.i. vorherrschend. Während der exponentiellen Wachstumsphase sind an Tag 13 p.i. noch kleinere Formen zu beobachten. Im Übergang zur chronischen Phase nehmen die Flagellaten
an Breite zu. In der chronischen Phase der Infektion schließt sich ein Längenwachstum an. Die Position des Kinetoplasten verändert sich im Laufe der Infektion nicht wesentlich (KRUSE u.
STEINHAGEN 1988; KRUSE et al. 1989).
Der Blutflagellat vermehrt sich durch Längsteilung im Endwirt. Dazu runden sich die Trypanoplasmen ab, es werden Geißeln, Kinetoplast und Zellkern verdoppelt, anschließend erfolgt die Teilung (KRUSE et al. 1991).
Die Übertragung der Trypanoplasmen von Fisch zu Fisch erfolgt durch den Biß infizierter Blutegel Piscicola geometra und Hemiclepsis marginata (KEYSSELITZ 1906; WOO u.
POYNTON 1995). Alle im Vormagen des Egels vorhandenen, morphologisch unterschiedlichen Formen sind für den Fisch infektiös, solange bis das Fischblut nach etwa 11 Tagen im Egelvormagen verdaut ist (LOM 1979; STEINHAGEN et al. 1989b).
Die experimentelle Infektion von Karpfen ist durch die Injektion von Blut infizierter Fische in die Muskulatur oder in die Körperhöhle möglich (LOM 1979; STEINHAGEN et al. 1989b).
Bei 20°C Wassertemperatur dauert die Phase der Präpatenz bis etwa zum 8. Tag p.i.. Zu diesem Zeitpunkt sind Trypanoplasmen weder im Blut noch in inneren Organen zu finden, sehr wohl jedoch in der Muskulatur in der Nähe der Inokulationsstelle. Die sich anschließende exponentielle Wachstumsphase hat ihren Höhepunkt mit ca. 10³ Flagellaten µl-1 Blut bis etwa fünf Wochen p.i.. Auch hierbei sind Teilungsstadien in der Muskulatur zu beobachten. Die chronische Phase schließt sich mit stark schwankenden Parasitenzahlen im Blut an. Bis zu einer Dauer von vier Monaten können Parasiten im Blut gefunden werden (STEINHAGEN et al. 1989b; KRUSE et al. 1991). Bei niedrigen Temperaturen ist die Entwicklung der Parasitämie deutlich verlangsamt. Das Temperaturoptimum für die Entwicklung liegt bei 20°C.
STEINHAGEN et al. (1989b) etablierten einen klonierten Stamm von Trypanoplasma borreli und kultivierten diesen durch Passagierung in empfänglichen Karpfen.
2.5.2 Auftreten und Bedeutung
Trypanoplasma borreli ist ein häufiger Blutparasit von europäischen Cypriniden, tritt aber auch in Nordamerika auf (MAVOR 1915). Die Infektion ist in Fischbeständen innerhalb
Europas bei Karpfen (Cyprinus carpio), Schleie (Tinca tinca) und Goldfisch (Carassius auratus) weit verbreitet. Goldorfe (Leuciscus idus), Elritze (Phoxinus phoxinus), Plötze (Rutilus rutilus) und Rotfeder (Scardinius erythropthalamus) sind ebenfalls für eine Infektion empfänglich (KRUSE et al. 1989; LOM u. DYKOVÁ 1992).
Die Infektion verursacht äußere Symptome der sogenannten ”Schlaffsucht“ oder auch
“Schlafkrankheit“ der Karpfen (SCHÄPERCLAUS 1990; KÖRTING 2000). Hochgradig befallene Tiere zeigen Apathie, Lethargie, Exophthalmus, Ascites, verminderte Futteraufnahme und Anämie. Im Endstadium der Erkrankung stehen die Fische am Grund des Gewässers und bewegen sich kaum noch (NERESHEIMER 1912; OLLENSCHLÄGER 1975;
REICHENBACH-KLINKE 1980; AMLACHER 1992; BARCKHAUSEN-KIESECKER 1996). Diese Symptome können auch bei hochgradig infizierten Fischen teilweise oder völlig fehlen. Bei Karpfen kommt es zu einer vorübergehenden Parasitämie mit Anämie und Todesfällen (STEINHAGEN et al. 1989b). Die Mortalität war sowohl in Experimenten an Karpfen als auch an Goldfischen sehr hoch (LOM 1973 u. 1979; MILDE 1982; LOM et al.
1986).
2.5.3 Pathologie
In pathologischen Untersuchungen infizierter Tiere können bei fortgeschrittener Parasitämie blasse Haut und Kiemen, Splenomegalie, Ascites, Exophthalmus, Petechien auf Niere, Leber, Milz und Fettgewebe sowie granulomatöse Veränderungen an der Niere festgestellt werden (LOM u. DYKOVÁ 1992; WOO u. POYNTON 1995; BUNNAJIRAKUL 1998; MEYER 2001). Es müssen nicht immer alle Symptome gleichzeitig vorhanden sein (LOM u.
DYKOVÁ 1992).
Bei experimentell infizierten Karpfen sinken Hämatokritwert und Erythrozytenzahl mit steigender Parasitämie. Die Anzahl an Leukozyten, insbesondere Granulozyten, und unreifen Erythrozyten steigt im Verlauf der Infektion (STEINHAGEN et al. 1990; BUNNAJIRAKUL 1998). Eine Autophagozytose von Erythrozyten durch aktivierte Monozyten / Makrophagen im Blut vermutete HAMERS (1994). Er beschrieb weiterhin eine durch T. borreli induzierte Leukozytose, die auf einer Lympho- und Monozytose beruhte.
2.5.4 Pathohistologie
Bei fortgeschrittener Parasitämie erscheint T. borreli auch extravaskulär in mehreren Organen und phagozytiert in Monozyten und Makrophagen (LOM u. DYKOVÁ 1992).
Untersuchungen über histopathologische Veränderungen während einer Trypanoplasmen- Infektion bei Goldfischen wurden von DYKOVÁ und LOM (1979) durchgeführt. Sie beobachteten in Gefäßen der inneren Organe Endovaskulitiden mit starker Hyperplasie der Endothelien. In der Niere wurden Glomerulitis und Tubulonephrose festgestellt. Die Sinusendothelzellen der Milz erschienen geschwollen, die Milzpulpa aktiviert.
RUDAT (1999) und MEYER (2001) fanden in Studien an Karpfennieren während einer Infektion mit Trypanoplasma borreli bereits zu Beginn der Parasitämie eine Proliferation des hämatopoetischen Zwischengewebes, deren Folge eine Druckatrophie der Tubuli war. Hinzu kam eine massive leukozytäre Infiltration der Tubuli.
Eine Untersuchung über histopathologische Veränderungen an hochempfänglichen Karpfen während einer Trypanoplasma borreli-Infektion wurde von BUNNAJIRAKUL (1998) durchgeführt. Die Infektion rief vor allem in hämatopoetischen Organen Gewebeschädigungen hervor. Die schwersten histopathologischen Veränderungen wurden während des Höhepunktes der Parasitämie entdeckt. Die erkrankten Karpfen mit sehr hoher Parasitämie zeigten eine Infiltration von Entzündungszellen und Trypanoplasmen in den glomerulären Kapillaren der Niere, in Leber- und Milzsinusoiden und in Blutgefäßen von anderen Organen wie zum Beispiel Kiemen, Herz, Darm und Gehirn. Die beobachtete intensive Proliferation der mononukleären Zellen in Niere und Milz wurde als erfolglose Abwehrreaktion der Fische gegen die Parasiteninfektion bewertet. Die Fische starben zwischen dem 20. und 28. Tag p.i., wobei die schwersten histologischen Veränderungen in der Niere der infizierten Fische gefunden wurden. Die Proliferation im Interstitium der Fischniere wird bei Auseinandersetzungen mit einem Erreger häufig gesehen (MANNING 1994).
BUNNAJIRAKUL (1998) und RUDAT (1999) nahmen an, daß die gravierenden Nierenschädigungen der infizierten Karpfen eine starke Beeinträchtigung der Osmoregulation und des Ionenhaushaltes bewirkten und somit Grund für den Tod der Tiere sein könnten.
Nephrologische Studien von MEYER (2001) ergaben, daß mit Trypanoplasmen infizierte
Karpfen zwar Ionenverluste im Urin aufwiesen, die Plasmaosmolalität dabei allerdings nahezu konstant blieb. MEYER (2001) stellte die hochgradige Anämie und die damit verbundene Sauerstoffarmut als Todesursache in den Vordergrund.
2.5.5 Immunität und Resistenz
Die genetische Abstammung bestimmt die Empfänglichkeit der Karpfen für T. borreli. So starben bei einer hochempfänglichen Karpfenlinie alle infizierten Fische von Tag 21 p.i. bis Tag 24 p.i. an den Folgen der Infektion (VAN DEN BROEK 1992; WIEGERTJES et al.
1995).
Angeborene Immunität gegenüber Infektionen wird vermutlich genetisch kontrolliert. Der Schutz beruht auf Mechanismen der unspezifischen Immunabwehr, wie lytische Fähigkeiten des Plasmas der widerstandsfähigen Fische (AMLACHER 1992; LOM u. DYKOVA 1992;
WOO 1996). WOO (1996) zeigte an Kreuzungsversuchen mit Cryptobia samositica- empfänglichen und -resistenten Fischen, daß deren natürliche Resistenz vererbt wird.
Die erworbene Immunität entsteht nach vorangegangenem Erregerkontakt (AMLACHER 1992). Bei Kaltblütern entwickelt sie sich, wahrscheinlich aufgrund der niedrigeren Körpertemperatur und der geringeren Stoffwechselrate, langsamer als bei Warmblütern. Daher scheint die angeborene Immunität (Resistenz) bei wechselwarmen Tieren wichtiger zu sein als bei gleichwarmen (WOO 1996).
JONES und WOO (1987) vermuteten, daß die Erholung von Forellen nach einer Infektion mit T. salmositica auf der Bildung von schützenden Antikörpern beruht. Bei diesen Tieren konnten sie agglutinierende und neutralisierende Antikörper im in vitro-Test nachweisen.
JONES et al. (1993) wiesen Antikörpertiter im Blut von Karpfen mit T. borreli nach. Diese waren um so höher, je höher die Trypanoplasmenzahl im Blut war. Karpfen, die eine T.
borreli-Infektion überstanden haben, bilden einen Immunschutz, der nach einer Erstinfektion für etwa ein Jahr besteht (STEINHAGEN 1985). Das entspricht Untersuchungen mit dem Blutflagellaten Trypanosoma danilewski (jetzt: T. carassi) an Goldfischen. Auch hier waren die Fische nach überstandener Infektion nicht empfänglich für eine Neuinfektion (WOO 1981).
Die Produktion von spezifischen Antikörpern ist stark abhängig von der Karpfenlinie und deren Empfänglichkeit für T. borreli. So findet bei hochempfänglichen Karpfen keine Produktion von spezifischen Antikörpern statt (WIEGERTJES et al. 1995). SCHARSACK (2001) fand im Serum T. borreli-resistenter Karpfen nach einer Infektion parasitenspezifische Antikörper, während die hochempfänglichen Karpfen keine Antikörperproduktion erkennen ließen.
Die Resistenz von Karpfen gegenüber T. borreli kann durch Immunsuppressiva aufgehoben werden. Setzt man mit Trypanoplasmen infizierte Karpfen radioaktiver Strahlung aus oder appliziert ihnen Hydrocortison, führt dies zu einem starken Anstieg von Parasitämie und Mortalität bei diesen Tieren (STEINHAGEN et al. 1989a).
2.5.6 Diagnose und Behandlung
Die Diagnose wird anhand der klinischen Symptome und des Nachweises von Trypanoplasmen gestellt. Dieser erfolgt in vivo mikroskopisch im Blut und in Quetschpräparaten von Niere oder Milz. Die Blutentnahme gelingt mit einer Glaskapillare am Kiemenbogen, durch Herzpunktion oder Blutentnahme aus den großen caudalen Gefäßen. Die Flagellaten fallen im Blut durch lebhafte, schlängelnde Bewegungen auf. Dabei erscheinen die Trypanoplasmen größer und plumper als die kleineren, lebhafteren Trypanosomen (NOGA 1995; KÖRTING 2000). Für den Nachweis der Antikörper gegen T. borreli steht ein ELISA- Test zur Verfügung (WOO u. POYNTON 1995).
Eine direkte und effektive Bekämpfung der Blutflagellaten ist nicht bekannt. Eine Behandlung sollte sich auf die Eliminierung der übertragenden Fischegel konzentrieren (KÖRTING 2000).
3 MATERIAL UND METHODEN
Um Gewebsreaktionen auf Injektion des Flagellaten Trypanoplasma borreli in die Muskulatur genetisch verschiedener Karpfen beobachten zu können, war eine experimentelle Infektion der Tiere im Labor erforderlich.
3.1 Versuchstiere
Für die Versuche wurden zwei genetisch unterschiedliche Karpfenlinien eingesetzt. Bei den für Trypanoplasma borreli-empfänglichen Tieren handelte es sich um Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio) aus Laborzucht. Die Fische entstammen aus der Nachzucht einer Zuchtlinie der Bundesforschungsanstalt für Fischerei in Ahrensburg. Die Aufzucht der Geschwistertiere erfolgte im Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung, Hannover. Die Karpfen wurden unter SPF-Bedingungen in Glasaquarien in rezirkulierendem Leitungswasser bei einer Wassertemperatur von 18-22°C aufgezogen. Gefüttert wurde mit kommerziellem Alleinfuttermittel für Karpfen („Trouvit“, Fa. Milkivit, Burgheim) einmal täglich ad libitum.
Bei den Tieren der zweiten Zuchtlinie handelte es sich um einsömmrige Spiegelkarpfen aus einer niedersächsischen Teichwirtschaft in der Nähe von Nienburg. Um eine bereits bestehende Parasitämie dieser Fische mit Trypanoplasma borreli auszuschließen, wurde stichprobenartig vier Fischen Blut entnommen und mikroskopisch auf Trypanoplasmen untersucht. Dabei waren keine Blutflagellaten feststellbar. Nun wurde dieses Blut vier empfänglichen Tieren intraperitoneal injiziert und im wöchentlichen Abstand über einen Zeitraum von zwei Monaten je eine Blutprobe entnommen. Keiner der Trypanoplasmen- empfänglichen Fische entwickelte eine Parasitämie. Um die Empfänglichkeit der aus der Teichwirtschaft stammenden Fische gegenüber T. borreli zu überprüfen, wurden vier Tiere mit ca. 104 Trypanoplasmen µl-1 Blut infiziert und Blutproben im Abstand von einer Woche über den Zeitraum von zwei Monaten entnommen. Zwei dieser Fische entwickelten eine starke Parasitämie (3-5 x 104 Trypanoplasmen µl-1 Blut) und starben in der ersten bzw.
fünften Woche nach der Infektion. Bei den anderen beiden Tieren war die Parasitämie schwach ausgeprägt (102-103 Trypanoplasmen µl-1 Blut). Nach sieben Wochen ließen sich
keine Trypanoplasmen mehr im Blut nachweisen, und die Fische erwiesen sich somit als resistent gegenüber einer Infektion mit T. borreli.
Die für die Versuche verwendeten Karpfen aus beiden Karpfenlinien wogen zwischen 30 und 130 g und waren zwischen sechs und neun Monate alt.
3.2 Parasiten
Bei dem verwendeten Parasiten handelt es sich um den Blutflagellaten Trypanoplasma borreli, der aus natürlich infizierten Karpfen isoliert und dann im Labor kloniert wurde (STEINHAGEN et al. 1989b; KRUSE et al. 1989). Von diesem Klon wurden Trypanoplasmen in flüssigem Stickstoff aufbewahrt (KRUSE et al. 1989) und nach dem Auftauen erneut in Karpfen inokuliert.
Für die Versuche wurde bereits infizierten Karpfen mit starker Parasitämie Blut entnommen und dieses anschließend mit 0,85%iger, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) („PBS- Dulbecco“, Fa. Biochrom KG, Berlin) so verdünnt, daß 5.000 Trypanoplasmen in 50 µl Blut enthalten waren. Den verwendeten Versuchstieren wurden 50 µl des verdünnten Blutes intramuskulär appliziert.
3.3 Töten der Fische
Alle Fische wurden durch einen Genickschnitt nach vorheriger Betäubung mit MS 222 (Tricain, Metaaminobenzoesäureaethylester, Fa. Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim; 0,1 gl-1) getötet.
3.4 Bestimmung der Parasitämie
Die Anzahl der Trypanoplasmen im Blut wurde durch Auszählung der Blutflagellaten in der Neubauer-Zählkammer ermittelt. Den durch MS 222 betäubten Fischen wurde kurz vor der Tötung aus der caudalen Hohlvene Blut entnommen. Dazu wurden die Karpfen, nachdem sie sich im Betäubungsbad in Seitenlage befanden, der Augendrehreflex erloschen war und sie
keine Abwehrbewegungen mehr zeigten, auf ein angefeuchtetes Papiertuch auf die rechte Körperseite gelegt. Die Punktionsstelle in der Medianen caudal der Afterflosse wurde mit einem Papiertuch trocken getupft. Von dieser Stelle aus wurde eine Einwegkanüle 0,6 x 25 mm („Neolus“, Fa. Terumo, Leuven, Belgien) mit aufgesetzter 2-ml-Einmalspritze („Norm- Ject“, Fa. Henke-Sass Wolf, Tuttlingen), in der sich ein Lithium-Heparin-Kügelchen (Fa.
Sarstedt, Nürmbrecht) befand, in craniodorsaler Richtung bis in die caudale Hohlvene vorgeschoben.
Das Blut wurde durch Aspiration gewonnen und mit PBS 1:100 verdünnt. In der Zählkammer wurden alle Trypanoplasmen in vier Großquadraten mit jeweils 16 Kleinquadraten unter dem Mikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen) bei 200-facher Vergrößerung gezählt und die Trypanoplasmenzahl pro µl Blut mit Hilfe der entsprechenden Kammerformel errechnet.
Kammerformel für die Berechnung der Trypanoplasmen:
Trypanoplasmengesamtzahl µl-1 Blut = X x V x 2,5
X: die in vier Großquadraten gezählte Anzahl an Trypanoplasmen V: Verdünnungsfaktor
Im Anschluß an die Blutentnahme wurden die Fische durch Genickschnitt getötet.
3.5 Gewinnung der Gewebeproben
In beiden Versuchen wurden an Tag 0, 1, 2, 4, 7, 10, 14, 18 und 22 nach der Infektion jeweils drei infizierte Tiere und drei Kontrolltiere seziert. Einen Überblick über die einzelnen Probennahmen geben die Tabellen 1 und 2.
