der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Auswirkungen einer singulären, oralen
Endotoxinapplikation auf die Intestinalmukosa des Karpfen ( Cyprinus carpio ) unter besonderer
Berücksichtigung der sezernierten Muzine
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Henner Neuhaus aus Werne a. d. Lippe
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Wilfried Meyer
Anatomisches Institut
Bereich Histologie und Embryologie Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. D. Steinhagen 2. Gutachter: Prof. Dr. F. Feldhusen
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2005
Meinen Eltern,
Brigitte und Heinrich Neuhaus
1 EINLEITUNG ... 17
2 LITERATURÜBERSICHT ... 20
2.1 Anatomischer Aufbau des Gastrointestinaltraktes des Karpfen ... 20
2.2 Histologischer Aufbau des Gastrointestinaltraktes des Karpfen ... 21
2.3 Die intestinale Mukusschicht ... 23
2.3.1 Aufbau und Funktion der intestinalen Mukusschicht ... 23
2.3.2 Muzine... 26
2.3.2.1 Proteinanteil... 27
2.3.2.2 Kohlenhydratanteil... 29
2.3.2.3 Synthese der Muzine... 30
2.3.2.4 Sekretion der Muzine... 32
2.3.2.5 Degradation der Muzine... 34
2.4 Aufbau und Funktion der intestinalen Mikroflora... 36
2.4.1 Intestinale Mikroflora beim Säugetier... 36
2.4.2 Intestinale Mikroflora beim Fisch ... 38
2.5 Endotoxin (Lipopolysaccharid = LPS)... 42
2.5.1 Physiologisches Vorkommen von Endotoxin im Darm ... 44
2.5.2 Struktur des Endotoxins ... 44
2.5.2.1 Monomere Struktur... 44
2.5.2.2 Polymere Struktur / Supramolekulare Mizellen... 46
2.5.3 Weg und Wirkung von Endotoxin im Wirtsorganismus... 46
2.5.3.1 Endotoxin im Intestinum... 47
2.5.3.2 Endotoxin im Blutkreislauf... 48
2.5.3.3 Bindung von Endotoxin an Zellen und (Serum-)Proteine... 51
2.5.3.4 Molekulare Mechanismen der Signaltransduktion... 55
2.5.3.5 Metabolisierung von LPS in der Leber... 56
2.5.4 Empfindlichkeit von Wirtsorganismen gegenüber Endotoxin ... 57
3.1 Versuchstiere ... 59
3.2 Übersicht - Apparative Ausrüstung - ... 59
3.3 Lipopolysaccharid (LPS)-Applikation ... 60
3.4 Versuchsdurchführung... 61
3.4.1 Hälterung der Versuchstiere während des Versuches ... 61
3.4.2 LPS-Applikation... 61
3.4.3 Klinische Untersuchung und Sektion der Tiere ... 62
3.5 Histologie... 62
3.5.1 Probengewinnung für die Histologie und Histochemie ... 62
3.5.2 Paraffineinbettung ... 63
3.5.3 Aufblocken und Schneiden ... 64
3.5.4 Histologische Übersichtsfärbungen... 64
3.5.4.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung (H.E.)... 65
3.5.5 Kohlenhydrat-Histochemische Nachweisverfahren ... 65
3.5.5.1 Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS-Färbung)... 65
3.5.5.2 Alcianblau-PAS-Färbung (AB-PAS)... 66
3.5.5.3 Standard Alcianblau-Färbung (pH 2,5)... 66
3.5.5.4 Standard Alcianblau-Färbung (pH 1,0)... 67
3.5.6 Lektin-Histochemische Nachweise von freien Zuckern... 67
3.5.7 Photographie... 69
3.6 Muzinanalyse ... 69
3.6.1 Isolierung der Muzine ... 69
3.6.1.1 Vorversuche... 69
3.6.1.2 Isolierung der Muzine aus dem Gewebe der Versuchstiere... 69
3.6.2 Einengung der Muzine ... 71
3.6.3 Auftrennung der Muzine ... 71
3.6.3.1 Vorbereitung der Säule... 71
3.6.3.2 Kalibrierung der Säule... 72
3.6.3.3 Auftrennung der Proben... 73
3.6.4.2 Photometrische Untersuchung des Kohlenhydratgehaltes der Muzine... 74
3.6.4.3 Darstellung der Ergebnisse der Muzinanalyse... 74
3.6.4.4 Bestimmung des Muzingehaltes in den durchgeführten Messungen... 75
3.6.5 Lektin-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)... 75
3.6.5.1 Vorversuch - Bestimmung der Versuchsbedingungen ... 77
3.6.5.2 Terminales Glykosilierungsmuster unbehandelter Karpfen ... 77
3.6.5.3 Terminales Glykosilierungsmuster nach Endotoxin-Stimulation ... 78
3.6.6 Limulus-Test ... 78
3.7 Statistische Auswertungen... 78
4 ERGEBNISSE ... 80
4.1 Versuchsfische ... 80
4.2 Klinische Untersuchung sowie Sektionsbefunde an den Karpfen ... 81
4.3 Ergebnisse der Histologie und Histochemie ... 81
4.3.1 Allgemeine Kohlenhydrat-Histochemische Nachweisverfahren... 82
4.3.1.1 Darstellung der Ergebnisse in der Photographie ... 84
4.3.2 Spezielle Lektin-Histochemische Nachweisverfahren ... 87
4.3.2.1 Darstellung der Ergebnisse in der Photographie ... 88
4.4 Ergebnisse der Muzinanalyse... 93
4.4.1 Kalibrierung der Chromatographiesäule ... 93
4.4.2 Intestinale Muzine bei nicht behandelten Karpfen... 94
4.4.2.1 Epitheliale Muzine ... 94
4.4.2.2 Luminale Muzine ... 96
4.4.2.3 Ergebnisse des Lektin-ELISA ... 99
4.4.3 Intestinale Muzine nach Endotoxin-Applikation ... 102
4.4.3.1 Epitheliale Muzine ... 103
4.4.3.2 Luminale Muzine ... 112
4.4.3.3 Ergebnisse des Lektin-ELISA ... 121
4.4.4 Ergebnisse des Limulus-Tests ... 133
5.1 Methodische Aspekte ... 137
5.1.1 Versuchstiere und Versuchszeitraum ... 137
5.1.2 Histologische und histochemische Untersuchungen ... 138
5.1.3 Isolierung der Muzine ... 138
5.1.4 Muzinquantifizierung mittel PAS- / Bradford-Färbung... 140
5.1.5 Bestimmung des terminalen Glykosilierungsmusters der Muzine... 142
5.1.6 Limulus-Test ... 142
5.2 Ergebnisse der Histologie und Histochemie ... 143
5.3 Ergebnisse der Muzinanalyse... 144
5.3.1 Veränderungen der intestinalen Muzinmenge... 144
5.3.2 Veränderung in der terminalen Glykosilierung von intestinalen Muzinen ... 149
5.3.3 Wirkmechanismus von Endotoxin im Karpfen... 152
5.3.4 Ergebnisse des Limulus-Tests ... 153
5.4 Zusammenfassende Betrachtung ... 154
6 ZUSAMMENFASSUNG... 156
7 SUMMARY... 158
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 160
9 ANHANG ... 190
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Gastrointestinaltraktes eines Karpfen... 20
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der intestinalen Mukusschicht ... 25
Abb. 2.3: Schematische Darstellung eines membranassoziierten Muzinmoleküls ... 28
Abb. 2.4: Molekularer Aufbau von Endotoxin ... 45
Abb. 3.1: Schema eines Lektin-ELISA, Ablauf der Reaktion... 76
Abb. 4.1: Ergebnisse der Kohlenhydrat-Histochemischen Färbungen (siehe auch 3.5.1) ... 83
Abb. 4.2: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (PAS) ... 85
Abb. 4.3: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (AB-PAS) ... 85
Abb. 4.4: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (AB-1,0)... 86
Abb. 4.5: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (AB-2,5)... 86
Abb. 4.6: Ergebnisse der Lektin-Histochemischen Färbungen (siehe 3.5.1) ... 87
Abb. 4.7: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (Con A)... 89
Abb. 4.8: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (SNA) ... 89
Abb. 4.9: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (DBA) ... 90
Abb. 4.10: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (RCA) ... 90
Abb. 4.11: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (MAA) ... 91
Abb. 4.12: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (UEA-I)... 91
Abb. 4.13: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (PNA) ... 92
Abb. 4.14: Dünndarmschleimhaut des Karpfen (WGA)... 92
Abb. 4.15:Gemeinsames Elutionsprofil der Eichsubstanzen Schweine-Magen-Muzin (SMM), Bovines Serum Albumin (BSA), Thyroglobulin (Thyro), Ferritin (Ferr); Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml ... 93
Abb. 4.16: Elutionsprofil epithelialer Muzine vom Karpfen (n=10) nach Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Die Kohlenhydratkonzentration wurde mittels PAS- und die Proteinkonzentration mittels Bradford-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml. ... 95
die Proteinkonzentration mittels Bradford-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml. ... 97 Abb. 4.18: Terminale Glykosilierung epithelialer und luminaler Muzine (n=10), Summe gemessener Fraktionen von Peak I, II sowie dem Schulterbereich S bezogen auf ein Gramm Darmvollgewicht sowie einem Milliliter der Ausgangslösung, korrigiert mit den Extinktionswerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion (UEA-I = Nachweis α-D-Fuk; SNA = Nachweis Sial; RCA = Nachweis - GalNAc; DBA = Nachweis α-GalNAc; Con A = Nachweis α-D-Man); Angabe von Median (M), 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil... 99 Abb. 4.19: Terminales Glykosilierungsmuster epithelialer und luminaler Muzine aus dem Darm unbehandelter Karpfen (n=10), Extinktionen der Peak I, II und des Schulterbereichs S (Angabe in Tabelle: Median (M) mit 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil) – Darstellung der einzelnen Fraktionenpools bezogen auf ein Gramm Darmvollgewicht sowie einen Milliliter der Ausgangslösung korrigiert mit den Extinktionswerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion (UEA-I = Nachweis α-D-Fuk; SNA = Nachweis Sial; RCA = Nachweis -GalNAc; DBA = Nachweis α-GalNAc; Con A = Nachweis α-D-Man)... 101 Abb. 4.20: Elutionsprofil epithelialer Muzine vom Karpfen (acht Tiere je Versuchstag) nach LPS-Applikation mittels Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Die Kohlenhydratkonzentration wurde mittels PAS-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml.
... 104 Abb. 4.21: Elutionsprofil epithelialer Muzine vom Karpfen (acht Tiere je Versuchstag) nach LPS-Applikation mittels Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml.
... 108
den einzelnen Versuchstagen inklusive Kontrollgruppe (PBS); Angabe der Mediane mit Quantilen Q1 (25 %) und Q3 (75%), korrigiert auf ein Gramm Darmvollgewicht ... 111 Abb. 4.23: Elutionsprofil luminaler Muzine vom Karpfen (acht Tiere je Versuchstag) nach LPS-Applikation mittels Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Die Kohlenhydratkonzentration wurde mittels PAS-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml
... 113 Abb. 4.24: Elutionsprofil luminaler Muzine vom Karpfen (acht Tiere je Versuchstag) nach LPS-Applikation mittels Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Färbung je Gramm Darmvollgewicht bestimmt; Fraktionsvolumen: 1,3 ml, Gelbettvolumen: 58,4 ml.
... 117 Abb. 4.25: Extinktion der Elutionsprofile luminaler Muzine in den Peak I, II und im Schulterbereichs S bei unbehandelten Karpfen sowie nach LPS-Applikation an den einzelnen Versuchstagen inklusive Kontrollgruppe (PBS-Applikation);
Angabe der Mediane mit Quantilen Q1 (25 %) und Q3 (75%), korrigiert auf ein Gramm Darmvollgewicht... 120 Abb. 4.26: Terminale Glykosilierung epithelialer Muzine (vier Tiere je Versuchstag), Summe gemessener Fraktionen von Peak I, II sowie dem Schulterbereich S bezogen auf ein Gramm Darmvollgewicht sowie einen Milliliter der Ausgangslösung korrigiert mit den Messwerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion; Angabe von Median (M), 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil... 123 Abb. 4.27: Terminale Glykosilierung epithelialer Muzine (vier Tiere je Versuchstag) von Peak I (PI), Peak II (PII) sowie von Schulterbereich S bezogen auf ein Gramm Darmvollgewicht sowie einen Milliliter der Ausgangslösung korrigiert mit den Messwerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion; in ergänzender Tabelle 4.10: Angabe von Median (M), 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil ... 125
ein Gramm Darmvollgewicht sowie einen Milliliter der Ausgangslösung korrigiert mit den Messwerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion; Angabe von Median (M), 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil... 128 Abb. 4.29: Terminale Glykosilierung luminaler Muzine (vier Tiere je Versuchstag) von Peak I (PI), Peak II (PII) sowie von Schulterbereich S bezogen auf ein Gramm Darmvollgewicht sowie einen Milliliter der Ausgangslösung korrigiert mit den Messwerten der Elutionsprofile aus der PAS-Reaktion; in ergänzender Tabelle 4.12: Angabe von Median (M), 25 % (Q1) und 75 % (Q3) Quantil ... 130 Abb. 4.30: Ergebnisse des Limulus-Tests mit Muzinen des Peak I ... 133
Tab. 3.1: Beurteilungsschema zur Beschreibung der untersuchten Parameter... 63
Tab. 3.2: Verwendete Lektine und nachgewiesene Liganden ... 67
Tab. 3.3: Molekulargewichte der Eichsubstanzen und eingesetzte Menge... 72
Tab. 3.4: Gebildete Fraktionenpools für die weitere Auswertung ... 75
Tab. 3.5: Ermittelte Versuchsbedingungen für den ELISA unter Berücksichtigung der ... 77
Tab. 4.1: Körpergewicht, Körperlänge und Darmgewicht der in der Untersuchung eingesetzten Karpfen (Cyprinus carpio); X: Mittelwert; s: Standardabweichung... 80
Tab. 4.2: Biochemische Analyse epithelialer, enteraler Muzine des Karpfen (n=10). Summe der medianen Extinktionswerte nach PAS- und Bradford-Färbung nach Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Umrechnung der Extinktionssummen der PAS-Reaktion in Milligramm Muzin mit Hilfe der Eichkurve (SMM)... 96
Tab. 4.3: Biochemische Analyse luminaler, enteraler Muzine vom Karpfen (n=10). Summe der medianen Extinktionswerte nach PAS- und Bradford-Färbung nach Auftrennung auf einer Sepharose CL-4B Säule. Umrechnung der Extinktionssummen der PAS-Reaktion in Milligramm Muzin mit Hilfe der Eichkurve (SMM)... 98
Tab. 4.4: Extinktionswerte der epithelialen Elutionsprofile nach PAS Färbung; angegeben sind die medianen Summen und berechnete relative Werte, Umrechnung in Milligramm kalkuliertes Muzin mittels der Eichkurve (SMM). ... 105
Tab. 4.5: Extinktionswerte der epithelialen Elutionsprofile nach Bradford-Färbung; angegeben sind die medianen Summen und berechnete relative Werte. ... 109
Tab. 4.6: Extinktionswerte der luminalen Elutionsprofile nach PAS-Färbung; angegeben sind die medianen Summen und berechnete relative Werte; Umrechnung in Milligramm kalkuliertes Muzin mittels der Eichkurve (SMM)... 114
Tab. 4.7: Extinktionswerte der luminalen Elutionsprofile nach Bradford-Färbung; angegeben sind die medianen Summen und berechnete relative Werte. ... 118
Tab. 4.9: Verhältnis der gemessenen Extinktionen beim terminalen Glykosilierungsmuster epithelialer Muzine von Peak I (PI), Schulter S (S) sowie Peak II (PII) bezogen auf
Peak I ... 126
Tab. 4.10: Übersicht der terminalen Glykosilierung luminaler Muzine von Peak I (PI), Peak II (PII) sowie von Schulterbereich S ... 131
Tab. 4.11: Verhältnis der gemessenen Extinktionen beim terminalen Glykosilierungsmuster luminaler Muzine von Peak I (PI), Schulter S (S) sowie Peak II (PII) bezogen auf Peak I ... 131
Tab. 9.1: Fischklassifikation / unbehandelte Tiere ... 193
Tab. 9.2: Fischklassifikation / Endotoxin-Stimulation ... 193
Tab. 9.3: Photometrische Extinktionswerte der Eichkurven... 195
Tab. 9.4: Übersicht über die erhobenen Messdaten bei den Lektinfärbungen ... 196
Tab. 9.5: Photometrische Extinktionswerte unbehandelter Karpfen... 197
Tab. 9.6: Photometrische Extinktionswerte nach PAS-Reaktion, epitheliale Muzine... 198
Tab. 9.7: Photometrische Extinktionswerte nach PAS-Reaktion, luminale Muzine ... 199
Tab. 9.8: Photometrische Extinktionswerte nach Bradford-Färbung, epitheliale Muzine ... 200
Tab. 9.9: Photometrische Extinktionswerte nach Bradford-Färbung, luminale Muzine... 201
Tab. 9.10: Photometrische Extinktionswerte der Kontrolltiere... 202
Abb. = Abbildung
BSA = Bovines Serum Albumin DVG = Darm-Voll-Gewicht
Fa. = Firma
FCS = Fetal calf serum (Fetales Kälber Serum) Ferr = Ferritin
Fuk = Fukose
Gal = Galaktose
GalNAc = N-Acetyl-Galaktosamin
kDa = Kilo-Dalton
Kontr = Kontrolle
LPS = Lipopolysaccharid (Endotoxin)
Man = Mannose
M = Median
ml-L = Milliliter Lösung n.n. = nicht nachweisbar
NeuNAc = N-Acetyl-Neuraminsäure (Sialinsäure) PAS = Perjodsäure-Schiff-Reaktion
PBS = Phosphat-Buffered-Solution (Phosphatpuffer) p. appl. = post applicationem
Q1 = 25 %-Quantil
Q3 = 75 %-Quantil
Sial = Sialinsäure
SMM = Schweine-Magen-Muzin SPF = spezifisch pathogen frei TLR = Toll-Like-Rezeptor
u. = und
unbeh = unbehandelt
X = Mittelwert
1 EINLEITUNG
Der Verdauungstrakt steht permanent mit der Außenwelt in Kontakt und ist deshalb ständig Antigenen ausgesetzt. Dabei übernehmen die hochmolekularen und gel-bildenden Muzine die Aufgabe eines Biofilms, welcher das darunterliegende Epithel in Form der Mukusschicht schützt sowie verschiedene chemische und biologische Noxen binden und in der Folge beseitigen kann. Muzine sind epithelialen Ursprungs und werden von spezialisierten Zellen, den sogenannten Becherzellen, synthetisiert und sezerniert.
Muzine sind Glykoproteine, die zum überwiegenden Teil aus Kohlenhydraten bestehen. Ihr Proteinanteil findet sich in Form des Kernproteins wieder, an den die Kohlenhydratseitenketten gebunden sind. Dieses Muzinmonomer weist somit –wenn man den molekularen Aufbau modellhaft beschreibt– die Form einer Flaschenbürste auf mit zentralem Kernprotein und in den Raum ragenden Kohlenhydratketten.
Inwiefern sich eine Endotoxinapplikation (Lipopolysaccharid = LPS) auf diesen Schutzfilm als phylogenetisch alte Einrichtung und vor allem auf die enthaltenen Muzine auswirkt, ist beim Fisch / poikilothermen Tier nicht geklärt. Es existieren fast ausschließlich beim Warmblüter entsprechende Untersuchungen. So konnte nach singulärer, peroraler LPS- Applikation bei Mäusen und Ratten eine Muzinsynthesesteigerung sowie eine Änderung in deren Glykosilierungsmuster beobachtet werden.
Auf einen Reiz hin werden die in Form von Granula verpackten Muzine der Becherzelle durch Exozytose aus der Zelle ausgeschleust. Dabei verschmilzt die Membran der Vesikel mit der Membran der Zelle und der Inhalt wird ausgeschleust. Es ist beim poikilothermen Karpfen zu erwarten, dass eine Reaktion der Becherzellen und deren produzierter Schleime analog zum Säuger stattfindet. Aufgrund der niedrigeren Körpertemperatur wird im Vergleich zum Säuger (entsprechend der Umgebungstemperatur) eine verlangsamte Reaktion des Darmes auf den Stimulus vermutet.
In der vorliegenden Arbeit werden spezifisch-pathogen-freie Karpfen (Cyprinus carpio) bei 20° Wassertemperatur gehalten und für die Untersuchung verwendet. Mit Hilfe dieser Tiere wird zunächst der histologische, unbehandelte sowie stimulierte Status nach oraler LPS- Applikation untersucht. Im histologischen Präparat werden Anzahl und Form der
Becherzellen sowie die Zusammensetzung des luminalen sowie des in Becherzellen befindlichen Schleimes mit Hilfe von allgemeinen Kohlenhydrat-Histochemischen sowie speziellen Lektin-Histochemischen Nachweisverfahren bestimmt.
Nach der histologischen Untersuchung werden die biochemischen Veränderungen der intestinalen Muzine inklusive ihres terminalen Glykosilierungsmusters erfasst. Dazu erfolgt zunächst eine Analyse der luminalen (extrazellulären) und epithelialen (intrazellulären) Muzine unbehandelter Karpfen. Für diese und die folgenden Untersuchungen der Muzine werden nach Endotoxin-Applikation über einen Zeitraum von acht Tagen die Muzine mittels Isolationsmedien vom Darm separiert und folgend die isolierten epithelialen und luminalen Muzine qualitativ sowie quantitativ erfasst. Diese biochemische Analyse wird mittels der Färbungen von Kohlenhydraten (PAS-Reaktion) und Proteinen (Bradford-Reaktion) durchgeführt. In einem nächsten Schritt wird mit Hilfe eines Lektin-bindenden Nachweisverfahrens (Lektin-ELISA) die terminale Glykosilierung der epithelialen sowie luminalen Muzinmoleküle gekennzeichnet. Hierfür dienen typische Monosaccharide, wie sie in Muzinen auftreten, als wichtige Hilfen.
Folgende Fragestellungen sollen geklärt werden:
1.) Wie stellt sich die Histologie des Darmgewebes und der Becherzellen unbehandelter Karpfen dar? Wie ist der intestinale Mukus unbehandelter Karpfen zusammengesetzt?
Welche Molekülgrößen treten dabei auf? Wie zeigt sich das unbehandelte, terminale Glykosilierungsmuster epithelialer und luminaler Muzine?
2.) Ist nach einem singulären Endotoxin-Stimulus im histologischen Präparat eine Veränderung in der Becherzellzahl, deren Morphologie oder den epithelialen Muzinen zu erkennen?
3.) Ändert sich die epitheliale sowie luminale Muzinzusammensetzung nach der Applikation von Endotoxin?
4.) Gibt es Änderungen im terminalen Glykosilierungsmuster der gewonnenen Muzine?
Sind Unterschiede bei den epithelialen Molekülen im Vergleich zu den luminalen zu erkennen?
Sollte der Darm des Karpfen auf den gegebenen oralen Endotoxin-Stimulus reagieren, sind im Rahmen dieser Studie weitere Fragen zu klären:
5.) Wie ausgeprägt sind die möglichen erhobenen histologischen Veränderungen?
6.) Kann eine biochemische Änderung der Muzinzusammensetzung erkannt werden?
Kann eine Veränderung des terminalen Glykosilierungsmusters quantitativ erfasst werden?
7.) Wie schnell reagiert das intestinale, mukosale System des Karpfen auf den Endotoxin- Stimulus? Sind Unterschiede im Vergleich zum Säuger erkennbar?
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Anatomischer Aufbau des Gastrointestinaltraktes des Karpfen
Der gesamte Gastrointestinaltrakt des Karpfen besteht aus Vorder-, Mittel- und Enddarm (siehe Abb. 2.1). Die vorgenommene Studie wie auch die folgende Literaturübersicht beschränkt sich in ihrer Darstellung fast ausschließlich auf den Mitteldarm und Enddarm.
Der Vorderdarm besteht beim Karpfen aus einem kurzen Oesophagus, dessen Schleimhaut in Längsfalten gelegt ist. In diesen Teil des Gastrointestinaltraktes mündet der Ductus pneumaticus, der Schwimmblasengang. Ein Magen, der sich dem Vorderdarm anschließt und die Verbindung zwischen Vorder- und Mitteldarm darstellt, ist beim Karpfen nicht zu finden.
Anstelle dessen geht die Speiseröhre mit einer magenähnlichen Erweiterung, auch Pseudogaster genannt, direkt in den Mitteldarm über.
Mitteldarm und Enddarm sind anatomisch sowie histologisch kaum voneinander zu unterscheiden und weisen schon makroskopisch einen gleichen Durchmesser auf. Sie werden deshalb zusammen häufig mit der Bezeichnung Rumpfdarm belegt (HARDER 1975). Der Mitteldarm liegt beim Karpfen in Schlingen, welche anatomisch nicht konstant verlaufen und - im Gegensatz zu den Säugetieren - nicht speziell benannt sind (HARDER 1975). Der in der Regel kurze Enddarm mündet mit dem Musculus sphincter ani im Anus.
Oesophagus Pseudogaster
Vorderdarm Mitteldarm Enddarm
Rumpfdarm
Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Gastrointestinaltraktes eines Karpfen
2.2 Histologischer Aufbau des Gastrointestinaltraktes des Karpfen
Der Oesophagus ist mit einem mehrschichtigem Plattenepithel ausgekleidet, wobei bei den Knochenfischen in der Schleimhaut des Oesophagus große Becherzellen vorherrschen, die hierdurch leichteres Abschlucken sperriger Nahrungspartikel ermöglichen (ROBERTS 1989).
Der Grundaufbau der Darmwand von Mittel- und Enddarm ist in allen Abschnitten identisch:
Die äußerste Schicht bildet die Serosa (Tunica serosa), die durch die bindegewebige Tela subserosa von der zweischichtigen Muskulatur (Tunica muscularis) getrennt wird. Die Schleimhaut (Tunica mucosa) stellt die innerste Schicht des Gastrointestinaltraktes dar, welche das Darmlumen nach luminal auskleidet. Sie wird ihrerseits durch die Tela submucosa von der Tunica muscularis getrennt.
Die Tunica serosa besteht aus einem einschichtigen Plattenepithel, der Lamina propria serosae, sowie aus der lockeres Bindegewebe enthaltenden Lamina subserosa. In der Lamina propria serosae befindet sich der Plexus subserosus, welcher einen Teil der nervösen Innervation des Darmes darstellt (ROBERTS 1989).
Die Tunica muscularis besteht aus einer doppelten Lage glatter Muskulatur. Man unterscheidet hier eine innere Längs- (Stratum longitudinale) von einer äußeren Zirkulär- Muskulatur (Stratum circulare). Diese beiden Muskellagen trennt eine bindegewebige Verschiebeschicht, um die Bewegungsfähigkeit des Darmes zu gewährleisten. In dieser liegt der Plexus nervorum myentericus (Auerbach-Plexus), der wie der Plexus subserosus zur Innervation der Muskulatur beiträgt. Seine Nervenzellen sind hier in Form von Ganglien von je ein bis drei Neuronen zusammengeordnet und werden begleitet von singulären Nervenzellen, die zwischen den Ganglien liegen. Eine geringe Anzahl von Neuronen liegt weiterhin mit ihrem Zellkörper auch in der Längsmuskelschicht, wobei abgehende Axone in den Plexus nervorum myentericus einstrahlen. Im Pseudogaster steht der Auerbach-Plexus mit dem Nervus vagus in Verbindung (HARDER 1975). Die elastisch-bindegewebige Tela submucosa teilt sich in ein Stratum granulosum und Stratum compactum auf, wobei letzteres luminal liegt (AMLACHER 1992). Das Stratum granulosum enthält viele Zellen mit eosinophiler Granula und bildet die dünnere Schicht der Submukosa. Zudem enthält die Submukosa ein lockeres Geflecht von Nervenfasern (Plexus nervorum submucosus), welches jedoch - im Gegensatz zum Säugetier - keine Neurone enthält (HARDER 1975). Der
Übergang in das sehr dichte Bindegewebe des Stratum compactum, welchem durch seine dicht gepackten kollagenen Faserbündel eine entscheidende Rolle bei der Strukturgebung des Darmkanals zukommt, ist lichtmikroskopisch gut zu erkennen.
Die Tunica mucosa wird in eine Lamina muscularis mucosae, eine bindegewebige Lamina propria sowie eine einschichtige Lamina epithelialis unterteilt. Kennzeichen der Lamina muscularis mucosa ist eine dünne Lage glatter Muskulatur, welcher bei der Peristaltik eine unterstützende Funktion zukommt. Sie stellt die Verbindung zur Tela submucosa dar. Sie ist beim Karpfen allerdings nur in der magenähnlichen Erweiterung ausgeprägt und fehlt im Mittel- und Enddarm völlig. Eine klare Trennung der Mukosa von der Submukosa ist hier somit nicht möglich. Die nach luminal folgende Lamina propria besteht aus einer dünnen, lockeren Schicht von Bindegewebe, in welcher sich zahlreiche Kapillaren befinden, die somit die Ernährung des Gewebes, den Abtransport von resorbierten Nährstoffen, die Sauerstoffversorgung sowie den Transport von Abwehrzellen gewährleisten. Das sich anschließende einschichtige, hochprismatische Epithel der Lamina epithelialis, welches von Enterozyten sowie exokrinen Zellen, den sogenannten Becherzellen gebildet wird, ist durch seine Basalmembran von der Propria abgegrenzt. Die zylinderartigen Enterozyten sind schlank, ihr Kern liegt etwa in der Zellmitte oder etwas mehr basal, wobei die distalen Enden der Zelle etwas zugespitzt sind. Untereinander werden die Zellen durch tight junctions (Zonula occludens) zusammengehalten. Die apikale Zellfläche weist Mikrovilli auf. Das sind kleinste Ausstülpungen der Zellmembran bzw. des Zytoplasmas, welche eine Oberflächenvergrößerung hervorrufen und somit einer verbesserten Nahrungsaufnahme dienen. Von diesen Vorstülpungen geht die Pinozytose aus (OBERTI 1961; SCHMIDT 1961).
Zwischen den zylinderartigen Enterozyten sind die oben angesprochenen Becherzellen lokalisiert, welche vornehmlich Proteine sowie Glykoproteinverbindungen produzieren und sezernieren. Diese exokrinen Zellen sind sowohl in der Mukosaoberfläche als auch in den Krypten des Darmes zu finden. Der Zellkern liegt - wie die ihn umgebenden zahlreichen Mitochondrien sowie das ihn umgebende raue Endoplasmatische Retikulum (rER) - basal. In Richtung apikal finden sich zunehmend dicht gepackte Granula, welche durch Exozytose entleert werden können.
2.3 Die intestinale Mukusschicht
2.3.1 Aufbau und Funktion der intestinalen Mukusschicht
Alle lebenden Zellen eines Organismus interagieren mit ihrer Umgebung, wobei ihre selektiv permeable Zellmembran das extrazelluläre vom intrazellulären Milieu trennt. Für die meisten Zellen stellt der Organismus durch einen engen zellulären Kontakt einen Schutzmechanismus vor Zerstörung bereit. Einige Zellen jedoch, die wie die intestinalen Epithelzellen in direktem Kontakt zur äußeren Umwelt an den Körperaußenflächen stehen, benötigen zur Aufrechterhaltung ihrer Funktion einen weiteren Schutzmechanismus. Deshalb sind diese intestinalen Epithelien mit einer zusätzlichen, protektiven Schicht bedeckt, die ihren Namen wegen des von ihr sezernierten Schleimes (lat.: mucus) erhielt. Diese Schicht schützt das Darmgewebe vor Dehydratation, Infektion sowie vor einwirkenden chemischen und mechanischen Noxen. Sie bewirkt eine Gleitwirkung für den tranportierten Inhalt und stellt weiterhin eine selektive Barriere dar (STROUS u. DEKKER 1992; YOLKEN et al. 1994;
GUM 1995; PEREZ-VILAR u. HILL 1999; ROUSSEL u. DELMOTTE 2004). Sie wird im Darm durch die in der Nachbarschaft der Epithelzellen befindlichen Becherzellen oder durch exokrine Zellen in intestinalen Drüsen gebildet. Sie weist unter physiologischen Bedingungen bei der Ratte eine unterschiedliche Dicke in den einzelnen Darmabschnitten auf. So reicht die gemessene Dicke von etwa 4,3 m im Jejunum bis hin zu 35 m im distalen Colon sowie Rectum (SZENTKUTI u. LORENZ 1993). Die Dicke der Mukusschicht im Duodenum repräsentiert ein Gleichgewicht zwischen Sekretion und Verlust des im Lumen befindlichen Anteils durch mechanische Kräfte und stellt ein dynamisches Regulationssystem dar (AKIBA et al. 2000; DEPLANCKE u. GASKINS 2001).
Der intestinale Schleimfilm lässt sich in zwei Bereiche unterteilen (siehe Abb. 2.2). So unter- scheidet man auf der eine Seite den membranassoziierten Mukus, welcher die eigentliche Schutzschicht darstellt und durch bakterielle, chemische oder mechanische Degradation zu löslichem Mukus werden kann, vom membrangebunden Mukus.
Die Funktion der membranassoziierten Muzine als molekulare Bausteine der Mukusschicht sind von ihrer Fähigkeit abhängig, eine visköse Lösung bzw. einen gelartigen Verband zu bilden (PEREZ-VILAR u. HILL 1999). Die Muzine besitzen physikalische Eigenschaften in
Form von Viskosität und Elastizität, die für die physiologischen Funktionen unabdingbar sind (ROUSSEL u. DEMOTTE 2004). Sie sorgen durch eine Herabsetzung von Reibungs- und Scherkräften für ein Milieu, welches dabei als ein Träger von Komponenten der spezifischen sowie unspezifischen Abwehr fungiert. Außerdem dienen Muzine einigen Bakterienspezies als chemotaktischer Faktor und bedingen eine Adhäsion derselbigen an den Mukus. Diese Funktion ist auf der einen Seite für eine erfolgreiche (physiologische sowie pathologische) Besiedlung des Wirtsorganismus durch Bakterien unabdingbar. Auf der anderen Seite erreicht der Wirtsorganismus durch diese Bindung eine Unschädlichmachung und Elimination potentieller Pathogene (siehe Kapitel 2.4).
Der membrangebundene Mukus ist wie der membranassoziierte synthesebedingt epithelialen Ursprungs, steht aber fest mit dem Epithel in Verbindung und formt somit kein Gel als protektiven Biofilm. Die membrangebundenen Muzine nehmen vermutlich eine Mittlerrolle zwischen Epithelzellen und Umgebung ein (ALLEN u. CARROLL 1985; CARLSTEDT et al.
1995; GENDLER u. SPICER 1995; ROUSSEL u. DELMOTTE 2004). Es werden ihnen physiologische Funktionen beim Zellwachstum, bei der Differenzierung der Zellen, bei epithelialer Protektion sowie bakterieller Adhäsion zugesprochen. Pathologisch sollen membrangebundene Muzine die Rolle einer Maskierung vor NK-Zellen („Natural-Killer- Cells“) übernehmen und an der Promotion von malignen Tumormetastasen beteiligt sein.
Außerdem ermöglichen membrangebundene Muzine einigen Bakterien und Viren das Überwinden von Wirts-Zellverbänden sowie das Eindringen in die Wirtszelle. Dennoch gibt es über die Funktion von membrangebundenen Muzinen wenig Daten (ROUSSEL u.
DELMOTTE 2004). WANG et al. (2002) untersuchten an intestinalen Muzinen von Ratten, ob auch membrangebundene Muzine in einer löslichen Form vorkommen und somit zu membranassoziierten Muzinen werden. In vitro konnte die Existenz solcher Moleküle nachgewiesen werden. Auch bei humanen sowie trachealen Muzinen von Ratten wurde eine lösliche Form des sonst entsprechenden, membrangebundenen Muzins gefunden.
Abgesehen vom zweigeteilten Schleimfilm kann noch der zelluläre Mukus angesprochen werden, der sich in Form von Vesikeln in den Epithelzellen befindet und entweder kontinuierlich sezerniert oder auf einen Stimulus hin freigegeben wird. Der lösliche Mukus wird als der Teil der Mukusschicht definiert, der nicht mehr adhärent ist. Er wurde im
Rahmen der Peristaltik abgelöst oder durch bakterielle oder körpereigene Enzyme abgespalten. Somit befindet er sich gelöst im Lumen. Dieser Teil der ehemaligen Mukusschicht mischt sich mit anderen Sekreten, vorliegenden Molekülen sowie mit abgeschilferten Zellen (ALLEN u. CARROLL 1985).
Im Magendarmtrakt enthält der Mukus einen Wassergehalt von mindestens 95 %. Darin sind bis zu fünf Prozent Mukus-Glykoproteine („Muzine“) enthalten, welche die eigentlichen monomeren Bau-Elemente des Polymergemisches Mukus bilden. Zusätzlich enthält der Mukus eine große Anzahl von Mikroelementen wie Elektrolyte, verschiedene Zell- und Serumproteine, Lipide und Nukleinsäuren. Der Mukus umfasst außerdem Bestandteile des unspezifischen sowie spezifischen Abwehrsystems in Form von IgA (NEUTRA u.
FORSTNER 1987). Außerdem sind Lysozym, Komplementfaktoren, Lektine und C-reaktives Protein nachgewiesen worden. Im Mukus von Fischen als azelluläres, unspezifisches Abwehrsystem sind Enzyminhibitoren, Zell-lysierende Substanzen (Hydrolasen, Proteinasen) und Agglutinine sowie Substanzen zur Präzipitation (IgM, IgG) gefunden worden (ALEXANDER u. INGRAM 1992). JUNG et al. (2002) beschreiben sechs Lektine, welche als Bestandteil von zellulärem Mukus sowie Epithelzellen verschiedener Gewebe beim Plattfisch Paralichthys olivaceus an lokalen Abwehrmechanismen beteiligt sind.
Löslicher Mukus
Membranassoziierter Mukus Membrangebundener Mukus Zellulärer Mukus
Enterozyt Becherzelle
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der intestinalen Mukusschicht
2.3.2 Muzine
Der intestinale Säugetier-Mukus mit seinen Muzinen, die typischerweise einen Anteil von zwei bis fünf Prozent ausmachen (CONE 1999), bildet die Grundlage vieler Studien und ist bei verschiedenen Spezies wie Maus, Ratte sowie Mensch gut untersucht. Vor allem Mukus der Hautdrüsen von Amphibien ist in jüngster Zeit weiter in das Licht analoger Studien gerückt, wobei der Mukus von Fischen in bezug auf seine Zusammensetzung wenig untersucht wurde. Hier stützen sich Studien vor allem auf die Komposition des Mukus der Epidermisoberfläche (FLETCHER et al. 1976; SHEPHARD 1994), kaum jedoch auf die Komposition des intestinalen Mukus und der ihn bildenden Muzine. Deshalb beziehen sich viele Angaben in der folgenden Literaturübersicht vor allem auf den Säuger-Mukus. Treten Literaturangaben zum Fisch-Mukus auf, werden diese an entsprechender Stelle explizit aufgezeigt.
Muzine sind hoch-molekulare, gel-formende Glykoprotein-Monomere, die neben ihrem geringen Proteinanteil zu einem überwiegenden Teil aus Kohlenhydraten bestehen und das molekulare Bauelement der Mukusschicht bilden. Sie sind durch das Fehlen von Uronsäuren als ein Bestandteil von anderen Proteoglykanen unterscheidbar. Im Darm bilden die einzelnen Monomere einen Verband, der in Form eines Polymergemisches den eigentlichen Biofilm bildet. Die Größe eines Muzinmoleküls ist spezies- und organabhängig. So werden im Darm des Menschen Größen von 250 bis 500 kDa, im Magen der Ratte Größen von 2.000 kDa angegeben (ENSS et al. 1996). Eine genaue Größenangabe aus der Literatur erweist sich als schwierig, da Angaben bei verschiedenen Autoren differieren, obwohl sie sich auf dieselbe Spezies und dasselbe Organ beziehen. Diese Gegebenheit spiegelt die verschiedenen Gewinnungsmethoden wieder, welche zu unterschiedlich starker Degradation des Moleküls führen (ROUSSEL u. DELMOTTE 2004). Die Größe und Zusammensetzung intestinaler Muzine bei Fischen ist kaum untersucht. Glykoproteine des Hautmukus jedoch scheinen ähnlich denen zu sein, wie sie in Säugetieren auftreten (HARRIS u. HUNT 1973; FLETCHER et al. 1976; ALEXANDER u. INGRAM 1992).
Der Proteinanteil der Muzine findet sich in Form eines Kernproteins („Core-Protein“) wieder, welches auch als Apomuzin bezeichnet wird und je nach Organ und Spezies aus 1500 bis 4500 Aminosäuren besteht (FORSTNER u. FORSTNER 1994). An dieses aus sich
wiederholenden Aminosäuresequenzen, den sogenannten „Tandem Repeats“ (TR), bestehendem Protein sind Kohlenhydratseitenketten gebunden. Das Kernprotein weist dabei in einer oder mehreren Regionen einen hohen Anteil der Aminosäuren Prolin, Threonin und Serin auf („PTS-Region“). Diese sind zu mindestens 20 Prozent am Gesamt- Aminosäuregehalt des Muzinmonomers beteiligt. Threonin und Serin sind in diesen Abschnitten stark O-glykosiliert. Diese stark glykosilierten Regionen sind aufgrund sterischer Gründe gegen Proteolyse geschützt (THORNTON et al. 1990). SUMI et al. (1997) fanden im Proteinanteil des Hautmukus der Regenbogenforelle einen Anteil von 32,4 % Threonin und 11,9 % Serin als Haupt-Aminosäuren.
Der Kohlenhydratanteil kann je nach Lokalisation im Darm zwischen 40 bis 80 % am Gesamtmolekül schwanken (GUM et al. 1991; VAN KLINKEN et al. 1995; CONE 1999).
SUMI et al. (1997) fanden im Hautmukus der Regenbogenforelle einen Kohlenhydratgehalt von 63 %.
Das Muzinmonomer weist molekular – wenn man die Struktur modellhaft betrachtet - den Bau einer Flaschenbürste auf (Abb. 2.3). Diese Oligosaccharide sorgen für die Hydratation des Muzinmoleküls im Darmlumen. Der starke Hydratationszustand des Gels ist sowohl durch den stark hydrophilen Charakter der Oligosachharide als auch durch elektrostatische Abstoßung der einzelnen Monomere untereinander bedingt. Kationen treten bei dieser Konformationsausbildung als Mittler auf. Das Apomuzin allein ist wasserunlöslich (STROUS u. DEKKER 1992; BANSIL et al. 1995).
2.3.2.1 Proteinanteil
Das Kernprotein besteht aus einem größeren Mittelstück und zwei schwach sowie überwiegend N-glykosilierten „naked cores“ genannten Enden. Jeder Teil der Tandem Repeats (siehe 2.3.2) besteht aus acht bis 169 Molekülen, die sich zwanzig- bis hundertfach im Apomuzin wiederholen (GUM et al. 1989; STROUS u. DEKKER 1992; GENDLER u.
SPICER 1995). Zudem ist das Apomuzin mit Kohlenhydratketten besetzt, die fast ausschließlich O-glykosidisch mit Threonin und Serin verbunden sind. In der schwach
S S S
S
S S S S
O-glykosidisch gebundene Kohlenhydratkette N-glykosidisch gebundene
Kohlenhydratkette
Apomuzin
schwach glykolisiertes Endstück schwach glykolisiertes
Endstück
stark glykolisiertes Mittelstück Disulfidbrücke
Abb. 2.3: Schematische Darstellung eines membranassoziierten Muzinmoleküls
glykosilierten Endregion befindet sich jeweils ein Bereich mit zahlreichen Cysteinresten.
Diese sind zu 90 Prozent für die Ausbildung von Disulfidbrücken verantwortlich (MANTLE et al. 1981; MANTLE et al. 1990; GUM et al. 1992; GUM et al. 1995).
Diese Brücken dienen der Konformation des Muzinmoleküls, welche für die Bildung von Muzinaggregaten zu der gelartigen, viskösen Muzinschicht notwendig sind (BANSIL et al.
1995; SHEEHAN et al. 1995; PEREZ-VILAR u. HILL 1999). SUMI et al. (1997) ermittelten im dermalen Mukus der Regenbogenforelle eine Beteiligung von mehr als zehn Cysteinresten je Endregion bei der Ausbildung dieser Disulfidbrücken. HERRMANN et al. (1999) fanden eine bis jetzt nicht näher definierte, molekulare Protease-Insensitive Verbindung, welche die Disulfidbrücken begleitet, deren Funktion bis jetzt jedoch nicht geklärt ist. Disulfidbrücken sind weiterhin in Verbindung mit einer spezifischen Aminosäuresequenz in der Endregion für die Ausbildung der Antigenität von Muzinen verantwortlich (MANTLE et al. 1984).
2.3.2.2 Kohlenhydratanteil
Die O-glykosidisch gebundenen Kohlenhydratseitenketten kommen fast ausschließlich im stark glykosilierten Mittelstück des Muzins vor und bestehen beim Säugetier aus fünf verschiedenen Kohlenhydraten:
Galaktosamin (Gal), N-Acetyl-Galaktosamin (GalNAc), N-Acetyl-Glukosamin (GlcNAc), Fukose (Fu) und N-Acetyl-Neuraminsäure (NeuNAc) (in der Literatur und im Sprachgebrauch oft als Sialinsäure bezeichnet).
Im Gegensatz zum Säuger enthalten Muzine von Amphibien neben den auftretenden fünf Monosacchariden zusätzlich Kdn (3-Desoxy-D-Glukero-D-Galakto-2-Nonulon-Säure) als Analogon zur NeuNAc. Ebenso verhält es sich mit dem Hautmukus einiger Fischarten: Dieser enthält auch Muzine mit Kdn. So ist ein hoher Gehalt von Kdn in der Schmerle (Misgurnus anguillicaudatus) gefunden worden (KIMURA et al. 1994). Im Gegensatz dazu fanden SUMI et al. (1997) im Hautmukus der Regenbogenforelle keinen Gehalt an Kdn, sondern sie fanden eine Zusammensetzung von 30,1 % NeuNAc, 26 % -Galaktosamin, 5 % Galaktose und 26 % Aminosäuren. Die Viskosität und Glykoproteinzusammensetzung des Hautmukus sowie des Mukus der Kiemen von Salmoniden ist speziesabhängig und variiert mit der Salinität des umgebenden Wassers. So variiert der Glukose- und Protein-Gesamtgehalt bei den einzelnen untersuchten Spezies deutlich (ROBERTS u. POWELL 2004).
Die N-glykosidisch gebundenen Kohlenhydratketten sind fast nur an den Enden des Apomuzins sowie innerhalb der cysteinreichen Abschnitte des Muzins vorhanden. Diese im Vergleich zu den O-glykosidisch gebundenen Ketten sind in ihrer Zahl deutlich vermindert, wobei ihre Kohlenhydratstrukturen fast komplett mit denen der O-glykosidisch gebundenen Ketten identisch sind. Allerdings ist im Gegensatz zu den O-glykosidisch gebundenen Ketten zusätzlich Mannose enthalten.
Bei den O-glykosidisch gebundenen Ketten zeigt die Verknüpfung der einzelnen Kohlenhydrate eine große Diversität. So werden diese Monosaccharidmonomere je nach Spezies, untersuchtem Organ sowie Gesundheitszustand in unterschiedlicher Weise an das Kernprotein glykosiliert. In Amphibien sind weitere hundert neue Monosaccharidsequenzen
und somit Konformationen nach Glykosilierung gefunden worden, welche bei Säugetieren nicht auftreten.
Trotz dieser großen Diversität in der Glykosilierung lässt sich die Kohlenhydratregion des Mittelstückes in drei verschiedene Bereiche gliedern (HOUNSELL u. FEIZI 1982). Auf der einen Seite gibt es eine Kernregion, in welcher über GalNAc sowie die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin eine Bindung zum Apomuzin geschaffen wird. Die Verbindung zur sich anschließenden Hauptregion wird ß -glykosidisch über bis zu zwei weitere Monosaccharide gebildet. Die Hauptregion enthält ausschließlich ß-1,3- oder ß-1,4- gebundene Gal und GlcNAc. Weitere Verzweigungen kommen entweder an GalNAc der Kernregion oder an Gal der Hauptregion vor (CARLSTEDT et al. 1985). Schließlich differenziert man noch die periphere Region, welche Monosaccharide ausschließlich in a-glykosidischer Bindung enthält, wobei Fukose und Sialinsäure nur hier - terminal im Muzinmolekül – auftreten. Sie bilden ebenso wie eine potentielle Sulfatierung einen zusätzlichen Schutz vor bakterieller Degeneration, da nur wenige Bakterien Sialidasen sowie Fukose-spaltende Enzyme bilden.
Die Sialinsäure tritt beim Säugetier in intestinalen Muzinen in drei Bindungsarten auf: Als sialyl-a-2,3-Galaktosamin, als sialyl-a-2,6-Galaktosamin oder als a-2,8 gebunden an ein weiteres Sialinsäuremolekül. Das Mukusmolekül aus dem Darm des Schweines enthält 18,3
% Sialinsäure sowie 3,1 % sulfatierte Ester. Die zunächst neutralen Muzinmoleküle weisen durch Sulfatierung und Sialinsäuren eine negative Ladung auf (MANTLE u. ALLEN 1981;
NEUTRA u. FORSTNER 1987). Die Muzine im Magen der Ratte enthalten ebenso wie die meisten gastrointestinalen Muzine anderer Säuger terminal Sialinsäure, wobei diskutiert wird, dass dieses Sialomuzin nicht nur von Becherzellen im Magen produziert wird, sondern auch aus dem Speichel der Ratte stammt (KODAIRA et al. 1999).
2.3.2.3 Synthese der Muzine
Zunächst wird der Proteinanteil der Muzine synthetisiert. Nach Transskription der ihn codierenden MUC-Gene (MUC = Abkürzung für Muzin) im Zellkern wird im folgenden mittels Translation der m-RNA im zytoplasmatischen Teil des rauhen Endoplasmatischen
Reticulums (rER) das Protein synthetisiert. Die fertige Aminosäurensequenz wird - vermittelt durch ein N-terminales Signal - in das Lumen des rER transloziert (FORSTNER 1995).
Im rER wird das Molekül durch ein Bindungsprotein stabilisiert (ROSE u. DOMS 1988), das erst im Rahmen der Oligomerisierung zu Di- und Trimeren entfernt wird (MUNRO u.
PELHAM 1987). Anschließend wird das Molekül in Vesikeln zum Golgi-Apparat transportiert. Während dieser Translokation beginnt die N-Glykosilierung an den Enden des Apomuzins. Dazu werden bereits synthetisierte, mannosehaltige Kohlenhydratketten als gesamte Struktur an das Protein addiert. Die hierdurch eintretende Konformationsänderung des Moleküls bildet eine Voraussetzung für die Schaffung der intra- und intermolekularen Disulfidbrücken (DEKKER u. STROUS 1990). Die bereits fast fertigen N-glykosidisch gebundenen Ketten werden in der Folge umgebaut, indem einige Mannosemoleküle sowie gebundene Glukose entfernt werden. Zunächst werden die vorhandenen Glukose-Reste durch ER-eigene Glykosidasen entfernt. α-Mannosidasen sorgen letztlich für die Ausbildung der finalen Anzahl von Mannoseresten. Diese Form wird als „Complex-Type-Structure“
bezeichnet. An diese werden nun NeuNAc sowie Gal und GalNAc-Moleküle mit Transferasen an das Molekül addiert (DELL u. MORRIS 2001). Gleichzeitig erfolgt die stufenweise O- Glykosilierung durch zytoplasmatische Uridin-Diphosphat aktivierte Kohlenhydrate sowie eine Addition von nuklären Cytidin-Monophosphat-Sialinsäure-Molekülen. Die O- Glykosilierung beginnt im cis-Golgi oder im Kompartiment zwischen ER und Golgi-Apparat (ROTH et al. 1994; SCHWEIZER et al. 1994). Sialinsäure und Sulfat werden nur terminal mittels spezifischer Transferasen addiert. Bei intestinalen Muzinen von Ratten wurde kurz vor ihrer Sekretion von BELL et al. (1998) Benzyl-Galaktosamin als Stoppsignal für die Sialierung von intestinalen Muzin-Dimeren ermittelt.
STROUS u. DEKKER (1992) zeigen fünf synthesebedingte Faktoren, welche die Sequenz und Häufigkeit der verschiedenen Zucker in den Kohlenhydratketten bedingen. Diese sind für die Unterschiedlichkeit in den verschiedenen Muzinen verantwortlich: Die Kettenverlängerung der Saccharide an das Muzinmolekül ist abhängig von zellspezifischen Glykosyltransferasen, von der Konkurrenz um dasselbe Substrat verschiedener Transferasen, vom zuletzt addierten Monosaccharid, vom Verzweigungsgrad sowie von sterischen Gründen, die eine weitere Addition verhindern können. Das Zusammentreffen von Enzym und Substrat
zu einem bestimmten Zeitpunkt der Glykosilierung ist zufällig und trägt wesentlich zu der Variabilität in den Kohlenhydratketten bei (NEUTRA u. FORSTNER 1987). Im trans-Golgi- Apparat erfolgt schließlich die Ausbildung von elektronendichten Granula, in denen die Muzine für die Sekretion zwischengespeichert werden (RAMBOURG et al. 1987). Dabei ist bei Ratten gezeigt worden, dass synthetisierte Muzine in Form von Dimeren stabilisiert vorliegen (FAHIM et al. 1987). BELL et al. (2003) ermittelten in intestinalen Muzinen von Ratten, dass das C-terminale-Ende des Muzins Disulfid-abhängige Dimere formt und N- Glykosilierungen für eine weitere, erfolgreiche Ausbildung von Dimeren mit anschließender Sekretion nötig sind.
Die Synthese der membrangebundenen Muzine läuft analog ab. Dabei wirkt der hydrophobe Teil der Kette im Rahmen der Synthese als Stoppsignal, wobei er später die entsprechende Transmembrandomäne darstellt.
2.3.2.4 Sekretion der Muzine
Die in den Vesikeln der Becherzelle befindlichen Muzine werden mit Hilfe der Exozytose aus der Zelle ausgeschleust. Dabei verschmilzt die Membran der Vesikel mit der Membran der Zelle und der Inhalt kann ausfließen (BRECKENRIDGE u. ALMERS 1987).
Man unterscheidet dabei die basale von der stimulierten Sekretion. Für letztere werden die Muzine in den Vesikeln für gewisse Zeit kondensiert und in Lagerungsgranula gestapelt, um bei Bedarf ausgeschüttet werden zu können (BURGESS u. KELLY 1987). Diese Stapelvesikel liegen nahe der Plasmamembran. Nach CHAMBRAUD et al. (1989) hingegen sind diese Vesikel nicht einer speziellen Sekretionsform zugeordnet. Die Steuerung der beiden Sekretionsformen unterliegt zwei verschiedenen Mechanismen.
Die basale Sekretion zeigt sich als eine kontinuierliche Freigabe von Muzinen, welche physiologisch abläuft und in der Folge das Epithel fortwährend vor biologischen, chemischen und physikalischen Noxen schützt. Für diese Sekretion werden ausschließlich membranständige Vesikel angesprochen, die zur Exozytose gelangen. Nach EPPLE et al.
(1997) ist dieser Weg gekennzeichnet durch kontinuierliche Synthese von Muzinen in der Golgi-Region mit anschließendem geleitetem Vesikeltransport über das zelluläre
Mikrotubulussystem in die Peripherie der Zelle. Ist ein solcher Vesikel am apikalen Teil der Becherzelle angelangt, so wird der Inhalt durch Exozytose freigegeben. Dabei wird stets nur ein Vesikel zur Exozytose gebracht. Die Steuerung der basalen und kontinuierlichen Sekretion erfolgt unter Beteiligung des zellulären cAMP-Messenger-System, welches die neu synthetisierten Muzine direkt zur Freisetzung bringt. Die durchschnittliche Freisetzungszeit für neu gebildete Vesikel in den Becherzellen beträgt vier bis acht Stunden in Ratten (in vivo), acht bis zwölf in Kaninchen (in vitro) und bis zu 24 Stunden (in vitro) beim Menschen (NEUTRA u. FORSTNER 1987).
Erreichen die Muzine nach der Exozytose die Epitheloberfläche, verlieren sie ihre kationische Ladung, werden hydriert und bilden somit als Polymergemisch einen Biofilm auf dem intestinalen Epithel. Dabei werden sie durch eine Ladungsverschiebung entfaltet, indem die negativ geladenen Seitenketten sich abstoßen. Es erfolgt im Rahmen dieser Entfaltung ein Austausch des zweifach positiv geladenen Calciumions gegen ein einfach positiv geladenes Natriumion. Diese sich ändernde Konformation geschieht innerhalb von 20 Millisekunden und vergrößert das Volumen des ehemaligen Vesikels auf das 400 bis 600 fache (VERDUGO 1990).
Die stimulierte Sekretion ist nach EPPLE et al. (1997) durch eine pulsatile und schnelle, apikale Freigabe von Stapelvesikeln gekennzeichnet. Dabei spielt das Mikrotubulussystem der Zelle im Gegensatz zur basalen Sekretion keine Rolle. Gesteuert wird diese Freigabe unter Beteiligung von Calcium-Ionen. So wird bei Verwendung von Calcium-Agonisten eine schnelle Muzinfreisetzung aus den apikalen Stapelvesikeln gesehen. Es sind eine Reihe von Stimulatoren bekannt, die zu einer abgestuften Steigerung der Muzinfreisetzung führen, wobei je nach Tierart, Lokalisation und untersuchtem Organ unterschiedliche Signalstoffe wirksam sind.
FORSTNER (1995) zeigte an Becherzellen des Darmes die Wirksamkeit von Phospholipase C-Aktivatoren (muskarinerge Substanzen, Neurotensin), Senföl, Chymotrypsin, Elastase, Sauerstoffradikalen sowie von Adenylatzyklaseaktivatoren (Choleratoxin, Prostaglandin E1 und E2). EPPLE et al. (1997) stimulierten die intestinale Muzinsekretion mittels cholinergen Substanzen (Choleratoxin, Carbachol). ENSS et al. (1996 u. 1997) applizierten Endotoxin (Lipopolysaccharid) oral und steigerten so im Blinddarm von Ratten die Muzinsekretion.
Neben einer Änderung in der Menge des sezernierten Muzines trat ebenso eine Veränderung in der terminalen Zusammensetzung der abgegebenen Muzine auf. Denselben Effekt erreichten URLAUB (1998) mit oraler Endotoxingabe im Darm von Mäusen. Es änderte sich die Muzinzusammensetzung und Viskosität der Muzinschicht. Gleichzeitig wurde eine Beteiligung von Makrophagen bei der Sekretion erkannt. Auch ISHIKAWA et al. (1993) erkannten eine Veränderung des terminalen Glykosilierungsmusters von intestinalen Muzinen von mit Strongyliden infizierten Ratten und diskutierten dabei eine Beteilung dieser Änderung am Beseitigungsmechanismus dieser parasitären Infektion. SMIRNOVA et al. (2003) stimulierten in vitro humane, intestinale Becherzellen mit Endotoxin. Diese steigerten als Reaktion ihre Muzinsynthese und –sekretion, wobei sie zudem IL-8 produzierten und freisetzten. Deshalb sind Becherzellen als ein Teil der mukosalen Immunität anzusehen, da sie auf einen bakteriellen Reiz reagieren können. Durch eine orale Gabe von Dextran-Sulfat- Natrium (DSS) konnte eine Steigerung in der MUC-Gen Aktivität gemessen werden, die in einer Zunahme der täglichen Muzinsekretion im Ileum von Ratten resultierte (FAURE et al.
2003). Auch Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida spricht im Seesaibling (Salvelinus alpinus) die stimulierte Muzinsekretion an. Nach stattgefundener Infektion wurde ein geringerer, intestinaler Gesamtkeimgehalt festgestellt, der mit einer gesteigerten Muzinsekretion erklärt wurde (RINGØ et al. 2002). DEPLANCKE u. GASKINS (2001) postulieren nicht nur durch pathogene Erreger eine stimulierte Sekretion, sondern sehen auch eine entscheidende Rolle der normalen gastrointestinalen Mikroflora bei der Mukogenese sowie Mukolyse. BUCHMANN et al. (2004) stimulierten die Muzinsekretion der Haut mit einer Formalin-Behandlung bei der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und erkannten eine Dosis-Wirkungsbeziehung.
2.3.2.5 Degradation der Muzine
Die intestinale Mukusschicht ist physikalischen, chemischen und biologischen Veränderungen unterworfen. So sorgen Peristaltik, Ingesta sowie köpereigene und bakterielle Enzyme für eine Degradation der Muzinschicht. Bei letzterer Art der Degeneration spielen sowohl proteolytische als auch Kohlenhydrat-spaltende Enzyme (Glykosidasen) eine Rolle.
Die Fähigkeit, die Muzinschicht zu degradieren, ist sowohl bei pathogenen Bakterien als auch bei Kommensalen beschrieben worden und gilt als Quelle von Kohlenhydraten und Energie für Bakterien. Gleichzeitig ermöglicht eine degradierte Muzinschicht den Bakterien, die Epitheloberfläche des Darmes zu erreichen. Im physiologischen Zustand stehen Synthese, Sekretion und Degradation der Muzine in einem Gleichgewicht (CORFIELD et al. 1992, CORFIELD et al. 1993; FORSTNER u. FORSTNER 1994; FORSTNER 1995;
DEPLANCKE u. GASKINS 2001; AKIBA et al. 2000). Über mechanische Degradations- Prozesse liegen im Gegensatz zu den chemisch-biologischen kaum Daten vor.
Die enzymatische Muzin-Degradation ist ein Prozess, bei dem zunächst die nicht- glykosilierten Enden der Muzine proteolytisch gespalten werden. Eine proteolytische Aktivität kann nur hier an den wenig glykosilierten Enden stattfinden. Einerseits schützt das intakte Polymergemisch der Muzine die wenig glykosilierten Enden vor Proteolyse, da der größte Teil der enzymatisch zugänglichen Enden im Inneren des Muzin-Netzwerkes liegt (STROUS u. DEKKER 1992). Auf der anderen Seite verwehrt im Bereich des Mittelstückes des Muzinmonomers die hohe Glykosilierung aus sterischen Gründen das Angreifen der degradierenden, proteolytischen Enzyme an diese Region (VARIYAM u. HOSKINS 1983).
Eine proteolytische Aktivität bedingt eine Entstehung von Monomeren aus dem ursprünglichen Polymergemisch, welches für Elastizität und Viskosität der Muzinschicht verantwortlich ist. Es kommt durch Degradation zum zunehmenden Verlust des Zusammenhaltes der Muzinmoleküle und zum Verlust des protektiven Biofilms.
Glykosidasen können im Gegensatz zu Proteasen das Mittelstück des Muzinmoleküls nach und nach aufspalten. Diese Glykosidasen sind bakteriellen, nicht aber wirtseigenen Ursprungs.
Bei der Degradation werden zunächst die terminalen Monosaccharide abgespalten. In Säuger- Muzinen liegen die äußeren, terminalen Monosaccharide in einer α-glykosidischen Bindung vor, während die Monosaccharide in der Hauptregion des Muzinmonomers in einer - glykosidischen Bindung vorliegen (HOSKINS 1981; HOSKINS et al. 1985; CORFIELD et al.
1992), so dass je nach Region des Muzins spezifische Glykosidasen zur Spaltung notwendig sind. Terminal treten im Muzinmolekül weiterhin sialierte Reste auf. Ist dies der Fall, so ist das Muzinmonomer vor Degradation besser geschützt. Auch Sulfatreste dienen als initialer Schutz vor Degradation. Ist dieser protektive Mechanismus jedoch erst einmal zerstört, erfolgt
eine weitere Degradation durch spezifische Glykosidasen. Vorkommende Glykosidasen sind (neben der Sialidase): -Galaktosidasen, N-Acetyl-Glukosaminidasen, N-Acetyl- Galaktosidasen und Fukosidasen. Die entstehenden Fragmente, der sogenannte lösliche Mukus, werden von den Bakterien für den eigenen Stoffwechsel verbraucht oder mit der Ingesta im Rahmen der Peristaltik mit ausgeschieden (FORSTNER u. FORSTNER 1994).
99 % der intestinalen Bakterienflora sind nicht in der Lage, Muzine an deren Kohlenhydratketten zu degradieren. Ihnen fehlen die entsprechenden Glykosidasen.
HOSKINS et al. (1985) wiesen nach, dass im Blinddarm des Menschen Vertreter der Gattungen Bifidobacterium und Ruminococcus die zahlenmäßig dominierenden Gattungen sind, welche Muzine spalten können.
Auch Krankheiten wie Krebs oder die Bowel Disease beim Menschen sind von einer veränderten Mukus-Zusammensetzung infolge synthesebedingter Degradation begleitet.
Muzine aus dem Magen von an Magenkrebs erkrankten Personen sind stärker degradiert als die von gesunden Probanden (XERRI et al. 1990; KIM et al. 1996; MALL et al. 1999;
SHIRAZI et al. 2000).
2.4 Aufbau und Funktion der intestinalen Mikroflora 2.4.1 Intestinale Mikroflora beim Säugetier
Fast alle Oberflächen eines Säugers –wie auch der Gastrointestinaltrakt- sind von Mikroorganismen kolonisiert, die in ihrer Gesamtheit als ‚normale’ oder ‚natürliche Mikroflora’ bezeichnet werden. Im Normalzustand schädigen sie ihren Wirt nicht. Vielmehr leben die Mikroorganismen mit ihrem Wirtsorganismus in einer Symbiose zueinander, wobei nicht die Schädigung, sondern das Ziel eines gegenseitigen Nutzens im Vordergrund steht.
Demnach bilden sie eine ‚soziale’ Einheit, welche auf der einen Seite durch Wechselbeziehungen mit ihrem Wirt und auf der anderen Seite durch Wechselbeziehungen der verschiedenen Bakterienpopulationen untereinander in einem Gleichgewichtszustand steht. Dieser Zustand wird auch mit dem Ausdruck ‚Eubiose’ beschrieben, wobei im Gegensatz dazu der Zustand einer Störung in der Eubiose als ‚Dysbiose’ bezeichnet wird (LUCKEY 1982; HAENEL 1982; HENTGES 1993).
Der Gastrointestinaltrakt wird durch an Nahrung assoziierte sowie in der direkten Umwelt befindliche Mikroorganismen kolonisiert. Nicht alle Darmabschnitte sind als Resultat gleich stark mit Bakterien besiedelt. So nimmt der Anteil von Keimen pro Gramm Faeces von kranial nach kaudal deutlich zu. Bei den meisten Säugern tritt dabei ein sehr ähnliches Bakterien-Muster auf. Jede Bakterienart besiedelt die für sie passende ökologische Nische (CAHILL 1990). So werden vor allem Vertreter der Gattung Bacteroides gefunden. Zahlen von 109 bis 1010 Bakterien pro Gramm Faeces können bestimmt werden. Weiterhin treten in geringerer Anzahl unter anderem Keime der Gattung Bifidobacterium, E. coli, Clostridium sowie Lactobazillus auf. Zu ein und derselben Zeit können 500 verschiedene Bakterienarten mit einer Gesamtzahl von 1013-1014 Keimen pro Gramm Faeces im humanen Darm bestimmt werden. Neben den meist apathogenen Bakterien kommen sowohl einige fakultativ als auch obligat pathogene Erreger vor. Pathogene Keime wie Salmonella, Staphylococcus und Klebsiella befinden sich nur zeitweilig im Darm (HOSKINS 1981; HAENEL 1982). Die vorherrschende Keimflora übt durch ihre äußerst stabile Gemeinschaft eine Schutzfunktion vor diesen pathogenen Keimen aus (SAVAGE 1977 u. 1984; RASTALL 2004). Diese wird sowohl direkt durch die Konkurrenz der Bakterien untereinander als auch indirekt durch die vom Makroorganismus geschaffenen physiologischen Bedingungen selbst gebildet.
Verschiedene Mechanismen sind in diesem Zuge nachgewiesen worden. So kommt es unter anderem zu einer Hemmung bzw. Abtötung von Fremdorganismen durch Produktion toxisch wirkender Substanzen, zur Konkurrenz um Wachstumsfaktoren und epitheliale Adhäsionsstellen oder zur Reduzierung des Gehaltes an Sauerstoff, der für einige Spezies essentiell ist. Die aerobe Mikroflora ist überwiegend im Magen sowie im proximalen Dünndarm anzutreffen. Hingegen besteht die bakterielle Keimflora im distalen Dünndarm sowie Dickdarm vor allem aus Anaerobiern. In fast allen Säugetieren besteht die intestinale Mikroflora zu über 95 % aus Anaerobiern, die vor allem im Dickdarm nachzuweisen sind (MOORE u. HOLDEMAN 1972). Viele Bakterienstämme sind in der Lage, mit dem Mukus des Wirtes eine Wechselwirkung einzugehen. Der Mukus dient dabei sowohl als chemotaktischer als auch als Adhäsionsfaktor, welcher eine Besiedlung sowie ein Eindringen von Bakterien in den Wirt ermöglicht und gleichzeitig dem Wirt als Beseitigungsmechanismus der Noxe dient (MONCADA et al. 2003). So zeigten LAUKOVÁ et al. (2004) in vivo, dass Enterokokken in der Lage sind, an den intestinalen Mukus von
verschiedenen Säuger-Spezies zu binden. Campylobacter jejuni zeigt ebenfalls chemotaktisches Verhalten in Anwesenheit von intestinalem Mukus, wobei L-Fukose sowie die Aminosäuren Aspartat, Zystein, Glutamat und Serin chemotaktisch wirken. Auch verschiedene Salze einiger organischer Säuren wie Pyruvat oder Zitrat sind als chemotaktische Substanzen erkannt worden (HUGDAHL et al. 1988). Damit Bakterien oder Parasiten neben dem Mukus auch mit intestinalen Epithelzellen einen Kontakt herstellen können, sind auch hier Adhäsine seitens der Mikroorganismen notwendig, die (in Form eines Schlüssel-Schloss- Prinzips) mit den entsprechenden, spezifischen Zellstrukturen wechselwirken (NIEMANN et al. 2004). Eine Übereinstimmung der terminalen Monosaccharide der Zelle mit denen der Muzine zeigt, dass der Wirtsorganismus durch seinen Mukus dem Mikroorganismus einen Köder präsentiert, der eine Bindung an die eigenen Körperzellen verzögert bzw. verhindert (TSE u. CHADEE 1991). Es handelt sich nach MONCADA et al. (2003) bei den zellulären und mukosalen Adhäsinen um dieselben, molekularen Strukturen. So interagieren bei E. coli fimbriengebundene Adhäsine mit zellulären Kohlenhydraten in Form von Mannose, - Galaktosamin oder anderen Sacchariden. Diese Monosaccharide sind gleichzeitig Bestandteil von Muzinen (siehe auch Kapitel 2.3.2). KATAYAMA et al. (1997) zeigten in Ratten, dass eine Adhäsion von Bakterien ein wichtiger Faktor bei der Translokation von Bakterien aus dem Darm ist, das intestinaler Mukus bakterielle Adhäsion moduliert und dass eine hohe Anzahl von Mukus-assoziierten Bakterien einen Verlust der protektiven Funktion des Mukus bedingen.
2.4.2 Intestinale Mikroflora beim Fisch
Untersuchungen zur Bakterienflora im Darm von Fischen und hier insbesondere beim Karpfen gibt es, im Gegensatz zu den Studien beim Säuger, nur wenige. Dennoch zeigen diese Arbeiten, dass das Spektrum der darmbesiedelnden Keime im Gegensatz zum Säuger nicht so eng geregelt ist und deutlich stärker variiert als bei Säugern. Dabei sind, was den marinen Bereich angeht, weniger als ein Prozent der in der Umgebung des Fisches vorkommenden Bakterien im Labor kultivierbar (HANSEN u. OLAFSEN 1999).
Es wird angenommen, dass sich im Larvenstadium des Fisches die primäre, zunächst transiente Mikroflora zu einer persistenten entwickelt. Die Etablierung der intestinalen Flora in Fisch-Larven ist komplex und scheint von der Mikroflora der Eier, des Lebendfutters und dem Wasser beeinflusst zu sein (RINGØ u. BIRKBECK 1999; HANSEN u. OLAFSEN 1999). Der Darm von Fischen wird hauptsächlich von Aerobiern und fakultativ anaeroben Bakterien besiedelt, während in gleichwarmen Tieren vornehmlich obligat anaerobe Bakterien auftreten (RINGØ et al. 1995). GONZALES et al. (1999) wiesen in Wildfängen der Bachforelle (Salmo trutta fario) und im Hecht (Esox lucius) bewegliche Aeromonaden und Carnobakterien als psychrophile Hauptvertreter nach, während sie in gehälterten Regenbogenforellen hauptsächlich Vertreter der Gattungen Bacillus sowie coryneforme Keime (anaerob) nachwiesen.
Es bildet sich wie beim Säuger eine Eubiose aus, die für einen ausgewogenen Gleichgewichtszustand sorgt und die Besiedlung des Darmes mit pathogenen Keimen erschwert. Im Zuge der Untersuchung dieses Gleichgewichtszustandes sind von Carnobacterium sp. sezernierte inhibitorische Substanzen gefunden worden, die eine Besiedlung der Pathogene Aeromonas salmonicida sowie Vibrio anguillarum erschweren (JÖBORN et al. 1997). Auch Pseudomonas fluorescens als ein probiotisch wirksamer Keim ist in der Lage, die Mortalität durch Vibrio anguillarum bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) um 46 % zu senken (GRAM et al. 1999).
Viele endo- und exogene Faktoren spielen bei der Besiedlung des Fisch-Darmes mit Bakterien eine Rolle, wobei die Umgebung einen sehr großen Einfluss auf die intestinale Mikroflora nimmt. Diese Faktoren werden im folgenden dargelegt.
Die Mikroflora bei Fischen variiert mit der anatomischen Diversität und somit physiologischen Komplexität der verschiedenen Verdauungssysteme bei Fischen. Im Darm des Fisches ist die Anzahl der vorgefundenen Bakterien höher als in der Umgebung des jeweiligen Tieres. Je komplexer der Darm dabei ist, um so komplexer ist das vorgefundene Spektrum an Keimen. Die Dichte der Bakterien ist jedoch nicht über den gesamten Darm gleich. So konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Aerobia im Darm in Richtung kaudal konstant abnimmt. Anaerobia im Darm sind im Gegensatz zum Säuger nur im vorderen Darmabschnitt und im Darminhalt nachgewiesen worden (CAHILL 1990). TRUST u.
