Modulation der Muzinproduktion der Schleimhaut des Karpfens (Cyprinus carpio) unter Kontamination des Aquarienwassers mit Aeromonas hydrophila

(1)

Modulation der Muzinproduktion der Schleimhaut des Karpfens (Cyprinus carpio) unter Kontamination des Aquarienwassers mit Aeromonas hydrophila

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN der VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Nancy Behrendt

aus Würzburg

Hannover 2005

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Dieter Steinhagen

Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Wilfried Meyer Anatomisches Institut

Bereich Histologie und Embryologie Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. D. Steinhagen

2. Gutachter: Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

(3)

Meinen Eltern gewidmet

(4)

(5)

1 EINLEITUNG ... 9

2 LITERATURÜBERSICHT... 10

2.1 Struktur und Funktion der Karpfenhaut... 10

2.1.1 Histologie der Karpfenhaut... 11

2.1.1.1 Epidermis... 11

2.1.1.2 Zelltypen der Epidermis... 12

2.1.1.3 Dermis und Hypodermis... 15

2.1.2 Mukus ... 16

2.1.3 Funktionen der Haut und ihrer Mukusschicht ... 18

2.2 Umweltkontamination mit Aeromonas hydrophila... 19

3 MATERIAL UND METHODEN ... 21

3.1 Versuchstiere... 21

3.2 Bakterien und Exposition ... 21

3.3 Versuchsaufbau ... 22

3.4 Methoden der Histologie ... 24

3.4.1 Probenentnahme ... 24

3.4.2 Entkalkung und Entwässerung ... 24

3.4.3 Paraffineinbettung... 25

3.4.4 Kunststoffeinbettung ... 25

3.4.5 Behandlung vor und nach dem Färbeverfahren ... 25

3.4.6 Histologische Übersichtsfärbungen ... 26

3.4.6.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung... 26

3.4.6.2 Toluidinblau-Färbung (RICHARDSON et al. 1960)... 27

3.4.7 Kohlenhydrathistochemie ... 27

3.4.7.1 Perjodsäure-Schiff-Reaktion nach MC MANUS (1948) (aus PEARSE 1972)... 27

3.4.7.2 Standard Alcianblau-Färbung (pH 2,5) (aus PEARSE 1968)... 28

3.4.7.3 Standard Alcianblau-Färbung (pH 1,0) (LEV u. SPICER 1964)... 28

(6)

3.4.8 Messungen an den histologischen Schnitten ... 32

3.4.8.1 Epidermisdicke ... 32

3.4.8.2 Anzahl der Becher- und Clubzellen... 32

3.4.9 Photographie ... 32

3.5 Methodik der Mukusanalyse ... 33

3.5.1 Gewinnung des Mukus ... 33

3.5.2 Konzentrierung des Mukus... 33

3.5.3 Gelchromatographie ... 34

3.5.4 Muzinquantifizierung ... 34

3.5.4.1 PAS-Färbung ... 34

3.5.4.2 Bradford-Färbung ... 35

3.5.4.3 Säulenkalibrierung... 35

3.5.4.4 Lektin-ELISA ... 36

3.6 Statistische Auswertungen ... 38

4 ERGEBNISSE ... 39

4.1 Klassifikation der Fische... 39

4.2 Fische vor der Bakterienexposition... 40

4.2.1 Messungen an der Epidermis... 40

4.2.2 Histochemische Untersuchungen... 44

4.2.3 Muzinanalyse... 48

4.3 Karpfen nach der Bakterienexposition... 55

4.3.1 Messungen an der Epidermis... 55

4.3.2 Histochemische Untersuchungen... 58

4.3.3 Muzinanalyse... 59

5 DISKUSSION ... 67

5.1 Untersuchungsmethode... 68

(7)

7. SUMMARY... 84

LITERATURVERZEICHNIS ... 86

(8)

(9)

Seite

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des schuppenlosen Integuments des Karpfen...11 Abb. 4.1: A: Histologisch unveränderte Karpfenhaut. B: Die drei Schichten der

Epidermis ... 41 Abb. 4.2: Epidermisdicke an drei Lokalisationen von vier Karpfen vor der Exposition. ...42 Abb. 4.3: Becherzellzahl in den verschiedenen Färbungen von vier Karpfen vor der

Exposition. ... 42 Abb. 4.4: Clubzellzahl an drei Lokalisationen von vier Karpfen vor der Exposition. ...43 Abb. 4.5: A: Reaktion der Basalmembran und Clubzellen in der AB-PAS-Färbung.

B: Schwache Färbung der Becherzellen und der Basalmembran sowie keine Reaktion im Str. basale, Str. spinosum und Str. superficiale in der

PAS-Färbung... 44 Abb. 4.6: Lektinfärbung der Karpfenepidermis...45 Abb. 4.7: Elutionsprofil von Thyroglobulin, bovines Serumalbumin, Ferritin gefärbt

nach Bradford und Schweinemagen-Muzin gefärbt nach PAS... 48 Abb. 4.8: Kohlenhydratgehalt der Muzine von der Haut nicht exponierter Karpfen

verglichen mit dem Elutionsprofil des Schweinemagen-Muzins gefärbt mit

PAS. ... 50 Abb. 4.9: Proteingehalt der Muzine von der Haut nicht exponierter Karpfen

verglichen mit den Eichproteinen: Thyroglobulin, bovines Serumalbumin,

Ferritin gefärbt nach Bradford... 51 Abb. 4.10: Elutionsprofil des Mukus von der Haut nicht exponierter Karpfen.

Kohlenhydratkurve und Proteinkurve. ... 52 Abb. 4.11: Bindung von Lektinen an Moleküle aus den drei Bereichen des

Elutionsprofils des Mukus der Kontrollfische. ... 53 Abb. 4.12: Bindung von Lektinen an Muzine aus dem Schleim von nicht exponierten

Karpfen bezogen auf den Kohlenhydratgehalt der eluierten Probe.. 54 Abb. 4.13: Epidermisdicke von Karpfen nach der Exposition mit A. hydrophila...55

(10)

Seite Abb. 4.14: Anzahl der Becherzellen in der Epidermis von Karpfen nach der

Exposition mit A. hydrophila... 56 Abb. 4.15: Anzahl der Becherzellen in der Epidermis von Karpfen nach der

Expositon mit A. hydrophila in der HE-, AB 1,0- und AB 2,5-Färbung. ... 57 Abb. 4.16: Kohlenhydrat-Elutionsprofile von Muzinen isoliert von der Haut von

Karpfen nach der Exposition mit A. hydrophila. ... 60 Abb. 4.17: Protein-Elutionsprofile von Muzinen isoliert von der Haut von Karpfen

nach der Exposition mit A. hydrophila... 61 Abb. 4.18: Terminale Glykosilierung der Muzine isoliert von der Haut von Karpfen... 65

(11)

Abb. Abbildung

AB-PAS Alcianblau-PAS-Methode AB 2,5 Alcianblau-Methode (pH 2,5) AB 1,0 Alcianblau-Methode (pH 1,0)

BM Basalmembran

BSA bovines Serumalbumin

BZ Becherzellen

bzw. beziehungsweise

CZ Clubzellen

Da Dalton

EZ Epithelzellen

Fer Ferritin

HE Hämatoxylin-Eosin Färbung KbE Kolonien bildende Einheiten

KF Korpulenzfaktor

Lektine Abkürzung für die Lektine siehe Tabelle 3.2, Seite 31

MW Mittelwert

PAS Perjodsäure-Schiff-Reaktion

RT Raumtemperatur

s. siehe

SD Standardabweichung

SMM Schweinemagen-Muzin

(12)

Tab. Tabelle Thyro Thyroglobulin

u. und

u. a. unter anderem

(13)

1 EINLEITUNG

In Aquakulturanlagen und in Aquarien sind Fische häufig Wasser ausgesetzt, das mit Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen belastet ist, die das im Wasser reichlich gelöste organische Material abbauen. Zu den Bakterien gehört unter anderem der Keim Aeromonas hydrophila. Dieser löst bei unbelasteten, konditionsstarken und gesunden Fischen meist keine Infektion aus (GEIGER 2001). Da er jedoch häufig im Zusammenhang mit Hauterkrankungen, wie Flossenerosionen oder Hautgeschwüren isoliert wird, wird er als ein fakultativ pathogener Organismus angesehen. Bisher ist unklar, unter welchen Faktoren A.

hydrophila pathogene Eigenschaften entwickelt. In diesem Zusammenhang wird diskutiert, dass bereits ein erhöhter Keimdruck Auswirkungen auf die Gesundheit von Fischen haben kann (BREMER 1997) und Veränderungen in der Schleimzusammensetzung oder Schleimkonzentration zu induzieren vermag. Die Epidermis und ihre Sekretproduktion stellen die erste Barriere des Fisches gegenüber verschiedenen Umwelteinflüssen dar, das erklärt auch die vielen Faktoren der unspezifischen Immunabwehr im Mukus (FAST et al. 2002a).

Als Reaktion auf eine hohe Belastung des Wassers mit Mikroorganismen ist zusätzlich eine Veränderung der Muzinproduktion selbst und eine veränderte Biochemie der sezernierten Muzine zu vermuten. Wie stark dieser Einfluss ist und in welchem Ausmaß die Haut und die sie bedeckende Schleimschicht darauf reagieren, soll in dieser Doktorarbeit untersucht werden. Dazu werden Epidermisproben von Karpfen entnommenen und histologisch sowie histochemisch untersucht. Diese Methoden ermöglichen, anhand des pH-Wertes und durch Lektin-Bindungen biochemische Veränderungen nach der Exposition der Epidermis mit A.

hydrophila darzustellen. Neben der Erhebung von morphologischen und histologischen Daten liegt das Interesse besonders im Biochemismus des Fischschleims, daher wird dieser isoliert und charakterisiert.

(14)

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Struktur und Funktion der Karpfenhaut

Der Karpfen, Cyprinus carpio, ist ein Knochenfisch (Osteichthyes, Überordnung Teleostei) und gehört zu der Familie der Cypriniden (STORCH u. WELSCH 1997). Die Telostei stellen mit circa 450 Familien die artenreichste und formenvielfältigste Wirbeltiergruppe dar, die bekannt ist. Diese Gruppe umfasst beispielsweise Ordnungen wie die Salmoniformes (Forelle, Lachse u. a.) oder die Perciformes (Barsche, Zander u. a.) und somit einen Großteil der wirtschaftlich genutzten Fischarten. Der ursprünglich aus den gemäßigten Klimazonen Kleinasiens, Mittelasiens, Chinas und Japans stammende Fisch wird bereits seit dem Mittelalter in Europa als Speisefisch gezüchtet. Durch die langjährige Zucht wurden die Karpfen morphologischen Veränderungen unterworfen, die vor allem die Körperform und das Schuppenkleid betrafen. Der Spiegelkarpfen ist ein Beispiel für eine wichtige Zuchtform als Speisefisch. Im Vergleich zur Wildform ist er hochrückiger und die Haut weist nur noch vereinzelt an der Rücken- und Seitenlinie große Schuppen auf (GEBHARDT u. NESS 1998).

Da vor allem die Haut innerhalb einer Art durch Domestikationseinflüsse sehr unterschiedlich sein kann, bezieht sich meine Arbeit auf den Spiegelkarpfen, sofern es nicht anders vermerkt ist.

(15)

2.1.1 Histologie der Karpfenhaut

Histologisch besteht die Haut der Karpfen wie bei allen Wirbeltieren aus drei Schichten, der außen liegenden Epidermis mit ihrem ektodermalen Ursprung, der darunter liegenden mesodermalen Dermis und der Hypodermis (Abb. 2.1). Manche Autoren beschreiben den der Epidermis aufliegenden Schleim als ein weiteres Stratum (ROBERTS 1989), dieser wird jedoch nur zum besseren Verständnis als „Schicht“ bezeichnet.

Str. superficiale

Str. laxum Str. basale Str. spinosum

Str. compactum

Basalmembran EPIDERMIS

DERMIS Muzinschicht

einschichtiges Epithel

Fettgewebe HYPODERMIS

INTEGUMENT

Str. compactum

INTEGUMENT

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des schuppenlosen Integuments des Karpfen.

2.1.1.1 Epidermis

Genereller Aufbau: Die Epidermis besteht aus einem mehrschichtigen Epithel und wird in drei funktionstüchtige Schichten unterteilt. Die Zellen der innersten Epithellage liegen auf der für Epithelien charakteristischen Basalmembran und bilden das einschichtige Stratum basale.

Hierauf folgt nach außen das mehrlagige Stratum spinosum, in dem große Zellen eingelagert sind, die als Clubzellen bezeichnet werden. An der Oberfläche schließt die Epidermis mit den abgeflachten Zellen des Stratum superficiale ab. Diese Schicht zeichnet sich vor allem durch

(16)

eine große Anzahl von Becherzellen aus, die auch im Stratum spinosum vorkommen. Die Oberfläche der Epidermis wird von einer Schleimschicht überzogen.

Den Kontakt zwischen Epidermis und Dermis stellt die dünne, azelluläre Basalmembran her.

Diese sehr wiederstandsfähige Verbindung besteht aus spezialisierten extrazellulären Proteinen. Zu ihrer Aufgabe gehört unter anderem die Kontrolle des Molekülaustauschs zwischen den beiden Geweben bzw. dem Informationsaustausch. Sie dient aber auch den Epithelzellen zur Anheftung, und beeinflusst die Zellentwicklung und Wundheilung. Die Epidermis ist beim Karpfen ungefähr 90 123456738IGER u. ABRAHAM 1990). Die Dicke ist jedoch sehr variabel und außer von der Größe des Fisches von vielen weiteren Faktoren abhängig (FAST et al. 2002b). So besitzen männliche Forellen durchschnittlich eine dickere Epidermis als die weiblichen Tiere. Zudem werden sowohl bei Flundern als auch bei Forellen jahreszeitliche Schwankungen in der Dicke der Epidermis beobachtet. Bei Flundern korrelieren diese mit dem Hormonhaushalt (BURTON u. EVERARD 1991). Bei Forellen ist eine deutliche Zunahme der Epidermisdicke in den Wintermonaten zu erkennen (WIRTH 1999).

2.1.1.2 Zelltypen der Epidermis

Epithelzellen:

Die Epithelzellen stellen die Grundbausteine der Epidermis dar. Sie werden in der Literatur auch als malpighian cells, epidermal cells oder filament-containing cells bezeichnet (ELLIOTT 2000). Aus den basalen Epithelzellen differenzieren sich auch die weiteren Zelltypen wie Club- und Becherzellen. Epithelzellen bleiben bis in die letzte Epidermisschicht mitotisch aktiv. Die vorwiegende Teilungsaktivität beschränkt sich jedoch auf die basalen Zelllagen. Morphologisch weisen die im Vergleich zu den übrigen Epidermiszellen kleinen Zellen je nach Position in der Epidermis unterschiedliche Formen auf. Solange sie direkt auf der Basalmembran lokalisiert sind, werden sie als Basalzellen bezeichnet und sind

(17)

spinosum zu einer abgeflachten im Stratum superficiale. Im Stratum superficiale liegen vermehrt sekretorische Vesikel im apikalen Zytoplasma der Zelle vor, welche kontinuierlich durch Exozytose an die Oberfläche abgegeben werden und so die spezielle äußere Schleimschicht aufbauen (FIEDLER 1991; ROBERTS 1989). Die Entwicklung vom Stratum basale ins Stratum superficale können die Zellen mancher Fischspezies innerhalb von nur 4 Tag durchlaufen (ELLIOTT 2000). Namensgebend für die Epithelzellen bzw. filament- containing cells sind auch die im Zytoplasma liegenden Zytofilamente (Zytokeratine). Sie stützen nicht nur die Zelle, sondern bilden auch desmosomale Verbindungen zu Nachbarzellen aus. Diese Strukturen nehmen nach apikal hin zu und spielen eine wichtige Rolle für die Elastizität und Regeneration der Haut (ELLIOTT 2000).

Becherzellen:

Becherzellen oder Schleimzellen sind unizelluläre „Drüsen“, die sich aus den Basalzellen differenzieren. Vom Stratum basale wandern sie zur Oberfläche und sind daher vor allem in der mittleren und oberen Epidermisschicht zu finden. Im Laufe dieser Wanderung verändern sie ihre Struktur und werden schließlich im Stratum superficale im Durchmesser bis zu 3 123 groß (IGER u. ABRAHAM 1990). Da diese Zellen vor allem der Mukussynthese dienen, liegen die Zellorganellen basal, während sich im apikalen Zytoplasma muköse, membranumgebene Vesikel ansammeln. Die Vesikel sind mit neutralen und sauren Glykoproteinen gefüllt und enthalten unter anderem proteolytische Enzyme (HJELMELAND et al. 1983) sowie antibakterielle Substanzen (PELETEIRO u. RICHARDS 1988). Im Zuge ihrer Wanderung zur Epidermisoberfläche verlieren sie ihre histologische Integrität und sezernieren die Schleimvesikel an die Oberfläche (FIEDLER 1991; TAKASHIMA u.

HIBIYA 1995). Anschließend gehen die Zellen zugrunde und ihre Reste werden in die Schleimschicht abgegeben. Unter besonderen Umständen sind die Zellen auch in der Lage zu phagozytieren (IGER u. ABRAHAM 1990). Die Entwicklung einer Becherzelle dauert circa 4 Tage. Sie wird ebenso wie die Epidermisdicke u. a. vom Hormonhaushalt der Fische beeinflusst; Androgene bewirken zum Beispiel eine Abnahme der Becherzellzahl (PICKERING 1974). Neben Hormonen beeinflussen viele verschiedene Faktoren die Becherzellzahl. So ist die Anzahl abhängig von der Lokalisation auf dem Fisch (PICKERING

(18)

1974) und bei unbeschuppten Fischen, zum Beispiel beim Aal, höher als bei beschuppten (VAN OOSTEN 1957).

Clubzellen:

Die meisten Fische der Gruppe Osteichthyes besitzen Clubzellen. Sie befinden sich ausschließlich in den mittleren Schichten der Epidermis, dem Stratum spinosum. Clubzellen sind im 9653 6563 3 3 3 123 ß und besitzen einen zentral, im eosinophilen Zytoplasma gelegenen Kern (IGER u. WENDELAAR BONGA 1994). Der Zellkern ist von elektronen-dichten Zytoplasmastrukturen umgeben, die in der Zellperipherie an Elektronendichte abnehmen (IGER u. ABRAHAM 1990). Die Zellen werden, weil sie Alarmsubstanzen enthalten, auch als Schreckstoffzellen bezeichnet (FIEDLER 1991). Der Zellinhalt, bioaktive Proteine (TAKASHIMA u. HIBIYA 1995), wird an die Umgebung abgegeben, wenn die Epidermis verletzt ist und die Clubzellen zerstört sind. Nach ABRAHAM et al. (2001) besitzen sie auch phagozytische Eigenschaften. Während der Ontogenese entwickeln sich die Clubzellen erst sehr spät (TREVISAN u. PEDERZOLI 1984).

Ebenso gehören sie während der Regeneration von verletzter Epidermis zu den letzten Zellen, welche sich aus den Epithelzellen differenzieren. Es wird daher vermutet, dass sie nur eine geringe Rolle in der Schutzfunktion der Haut spielen (IGER u. ABRAHAM 1990).

Rodletzellen:

Rodletzellen können neben der Epidermis auch in Organen auftreten. Sie sind rund mit einem randständigen Nukleus, beinhalten stäbchenähnliche Strukturen und sind von einer elektronendichten, kapselähnlichen Struktur umgeben. Es gibt verschiedene Theorien zu diesen Zellen und bis heute ist die Funktion sowie der Ursprung der Rodletzellen nicht abschließend geklärt. In einer Studie wurden in ihnen ähnliche Enzyme (Peroxidase, Alkalische Phosphatase) wie in Becherzellen gefunden, und sie finden sich 24 Stunden nach einer Verletzung in der geschädigten Haut. Daher nehmen diese Autoren an, dass Rodletzellen eine besondere Differenzierung der Epithelzellen sind, welche zwischen 1 und 24 Stunden nach einer Stresssituation auftreten (IGER u. ABRAHAM 1997). Aufgrund der Lage des Zellkerns wird ferner vermutet, dass sie zur Epidermisoberfläche wandern (IGER u.

ABRAHAM 1990) und dort ihren Inhalt ebenso wie Becherzellen abgeben (KARLSSON

(19)

2.1.1.3 Dermis und Hypodermis

Die an der Basalmembran anliegende, bindegewebige Dermis setzt sich aus dem Stratum laxum und dem Stratum compactum zusammen.

Das dünne Stratum laxum besteht aus lockerem Bindegewebe mit Blutgefäßen und Nervenfasern. Zu den zellulären Bestandteilen gehören die schuppenbildenden Zellen (Osteoblasten) der Schuppentaschen, Fibrozyten und verschiedene Farbzellen. Die Farben können ein chemisches Phänomen sein, wie bei den braun-schwarzen Melanozyten und gelben bzw. roten Pterinophoren oder ein physikalisches, wie bei den silbern reflektierenden Iridophoren (STOSKOPF 1993).

Im dickeren Stratum compactum sind im Unterschied zum Stratum laxum Kollagenbündel horizontal angeordnet und sehr dicht gepackt. Zusätzlich überkreuzen sie sich schichtweise im rechten Winkel. Daher ist diese Schicht vor allem für die mechanischen Eigenschaften besonders bei Zugbelastungen der Haut verantwortlich und stellt im Prinzip eine Sehne zwischen Haut und Muskulatur dar (ELLIOTT 2000).

Die Dermis funktioniert als mechanischer Schutz, beeinflusst die Proliferation der Zellen in der Epidermis und reagiert mit Hilfe eingelagerter Melanozyten auf Stress. Fische können sich als Folge von Stress sehr schnell dunkel färben, dieser Prozess wird durch die Verteilung der Pigmente in der Zelle gesteuert. ELLIS (1977) zeigte ferner, dass Melaningranula, frei oder von Makrophagen aufgenommen, eine bakterizide Eigenschaft besitzen, so dass den Melanozyten zusätzlich eine Rolle bei der Infektionsabwehr zukommt.

Dem Stratum compactum schließt sich basal eine einzelne Reihe von Zellen an, welche von WHITEAR et. al. (1984) als einschichtiges Epithel beschrieben wird.

Die letzte Schicht des Integuments ist die Fett enthaltende Hypodermis, welche eine verschiebliche Verbindung zwischen Haut und Muskulatur bildet (ROBERTS 1989).

(20)

2.1.2 Mukus

Der gesamte Körper des Fisches ist von einer Mukusschicht überzogen. Diese Schicht besteht aus dem von den Epithelzellen kontinuierlich synthetisierten Material, vermischt mit den Glykokonjugaten der Becherzellen (FIEDLER 1991). Eine physiologische Sekretion des Schleims wird vermutlich von tight junctions in der obersten Epithellage ausgelöst, so dass nur die apikalen Zellen ihren Inhalt sezernieren (GIPSON et. al. 1992).

Mukus besteht im allgemeinen zu 95 % aus Wasser und zu 5 % aus verschiedenen Glykoproteinen (FLETSCHER et al. 1976). Die Muzin-Glykoproteine bestehen in der Regel zu 70 % aus Kohlenhydraten (WOLD u. SELSET 1977) und sind mit einer Masse von 2 bis 40 Millionen Dalton sehr große Moleküle. Die Struktur der Muzine wird durch das Bild einer Flaschenbürste verdeutlicht. Sie bestehen aus einem zentralen Proteingerüst (Core-Protein), an dem viele Zuckergruppen gebunden sind.

Das Core-Protein besteht aus einer großen und einer kleinen Domäne, diese werden auch als

„major-“ bzw. „minor regions“ bezeichnet. Der innere Bereich eines Muzins (major region) ist fast vollständig glykosiliert und reich an Serin, Threonin und Prolin. Dieser proteaseresistente Teil der Muzine beinhaltet mindestens 60 % der Proteine. Die kleinen Domänen (minor region) liegen jeweils am C- und N-Terminus des Proteins. Diese Regionen sind nicht glykosiliert und anfälliger für Proteasen. Hier ist in das Core-Protein viel Cystein eingebaut, so dass über diesen Molekülabschnitt die Möglichkeit zur Bildung von intermolekularen Disulfidbrücken oder Ausbildung von linearen End-zu-End-Polymeren besteht.

Mittlerweile ist bekannt, dass in Muzinen sowohl N-gebundene als auch O-gebundene Oligosaccharide vorkommen. Die O-glykosidisch gebundenen Kohlenhydratketten werden durch N-Acetyl-Galaktosamin mit den Peptiden verbunden. Sie sind stark verzweigt und weisen große strukturelle Unterschiede auf. An Zuckern liegen Fukose, N-Acetyl- Glukosamin, Galaktose und Sialinsäuren vor. N-glykosidisch gebundene Kohlenhydrate

(21)

eines Muzinmoleküls dar. Es sind drei verschiedene Typen von N-Glykanen bekannt, die vermutlich eine wichtige Rolle in der Muzinpolymerisation spielen (STROUS u. DEKKER 1992).

Im Mukus sind die Proteinmonomere über Disulfidbindungen miteinander verknüpft und liegen als Polymere vor. So bilden sie ein voluminöses Gel aus dicht aneinandergelagerten, ausgedehnten, hoch hydratisierten Molekülen.

Viele Untersuchungen beschäftigten sich mit weiteren Inhaltsstoffen des Mukus:

In die aus Muzin-Glykoproteinen bestehende Matrix sind Elektrolyte, Zell- und Serumproteine, Lipide und Nukleinsäuren eingelagert (ALLEN 1983). Die Zellfragmente der abgeschilferten Epithelzellen und Reste von Mikroorganismen sind wahrscheinlich der Ursprung der Proteine, Lipide wie Phospholipide und Cholesterin, Nukleinsäuren und Ribose (STROUS u. DEKKER 1992). Auch Glykosaminoglykane (Chondroitinsulfat) werden im Mukus gefunden (VAN DE WINKEL et al. 1986). Besonderes Interesse legten viele Untersucher auf Faktoren des spezifischen und unspezifischen Abwehrsystems. Die zum spezifischen Immunsystem gehörenden Immunglobuline im Schleim (XU u. KLESIUS 2002) sollen nach Vermutungen von LA FRENTZ et al. (2002) aus dem Blut in den Mukus wandern. Ob diese Hypothese stimmt oder ob Immunglobuline direkt in der Haut gebildet werden, ist noch nicht abschließend geklärt. Zusätzlich werden viele Faktoren des unspezifischen Abwehrsystems im Mukus gefunden. Zu den humoralen Faktoren gehören Proteine mit antibakteriellen Eigenschaften (EBRAN et al. 1999; HELLIO et al. 2002), Proteasen (BRAUN et al. 1990; FIRTH et al. 2000), alkalische Phosphatase (ROSS et al.

2000), Lysozyme (SMITH et al. 2000; CONCHA et al. 2003), Komplement (BUCHMANN u.

BRESCIANI 1998), Lektine (BUCHMANN 2001; TASUMI et al. 2002; TSUTSUI et al.

2003), C-reaktive Proteine und Cytokine (BUCHMANN u. BRESCIANI 1998). Aber auch zelluläre Bestandteile wie Phagozyten (ELLIS 2001) sind zu finden.

Reguliert wird die Mukussekretion durch Hormone wie Östrogene, Androgene oder Cortison.

Bei einem durch Stress bedingten erhöhten Cortisonspiegel steigt auch die Schleimproduktion (IGER et al. 1994a).

(22)

2.1.3 Funktionen der Haut und ihrer Mukusschicht

Die Haut der Karpfen ist ein hochsensibles Organ, welches sich auf seine besondere Umgebung, das Wasser, spezialisiert hat. Für diese Aufgabe hat das Integument eine Vielzahl von Mechanismen und Bestandteile entwickelt, von denen hier nur die wichtigsten kurz beschrieben werden.

Die Haut stellt durch eingelagerte Sinneszellen, wie dem Seitenlinienorgan, ein Sinnesorgan dar, dient aber auch der Kommunikation und der Thermoregulation. Vor allem bei folgenden Funktionen spielt der Mukus eine wichtige Rolle: Im Bereich der Infektionsabwehr, der Osmoregulation und bei der Fortbewegung (ROSEN u. CORNFORD 1971; ELLIOTT 2000).

Die Abwehrfunktion beginnt bereits damit, dass durch die kontinuierliche Sekretion von Mukus die Anheftung von Bakterien und Parasiten erschwert wird. Daneben beinhaltet der Schleim wie bereits unter Punkt 2.1.1.4 beschrieben, antibakterielle Substanzen. Die Alkalische Phosphatase zum Beispiel ist ein lysosomales Enzym, welches im Fall einer Verletzung vermehrt synthetisiert wird. Durch seine bakterizide Wirkung dient das Enzym dem Schutz der defekten Haut (IGER u. ABRAHAM 1990).

Des weiteren ist die Schleimsekretion der Epidermis in die Osmoregulation involviert (SOLANKI u. BENJAMIN 1982). Die Mukusauflage verlangsamt die Diffusionsprozesse des Wassers und ein unmittelbarer Kontakt der Epithelzellen zum äußeren Milieu wird verhindert (HANDY et al. 1989). Ein weiterer Faktor, mit dem der Mukus zur Regulation des Ionenhaushaltes von Fischen beitragen kann, ist darin zu sehen, dass die meisten Gykoproteine sauer sind und somit die beste Voraussetzung für die Funktion als Ionenaustauscher bieten (SHEPARD 1994). Ferner führt Prolactin, ein Hormon, das bei Fischen die epitheliale Ionenregulation beeinflusst, zu einem Anstieg der Becherzellzahl und der Epidermisdicke (WENDELAAR BONGA u. MEIS 1981).

Die schleimige Oberfläche unterstützt den Fisch auch bei der Fortbewegung. Durch die glatte Schleimschicht auf der Haut wird der Strömungswiderstand der Fische im Wasser

(23)

schneller zu schwimmen ohne ihren Energieaufwand zu erhöhen (ROSEN u. CORNFORD 1971).

2.2 Umweltkontamination mit Aeromonas hydrophila

In einem natürlichen, sauberen, vom Menschen unbelasteten Gewässer können grundsätzlich alle Wasserorganismen eine Lebensmöglichkeit finden. Je stärker aber ein Gewässer belastet wird, desto mehr Spezies verschwinden, und es bleiben nur noch Spezialisten übrig. Zu diesen gehören beispielsweise Tubifex, Zuckmückenlarven, Abwasserpilze und Bakterien (BAUR u.

RAPP 2003). So kommen in einem organisch hochbelasteten Gewässer zahlreiche Bakteriengattungen vor. In intensiv bewirtschafteten Fischteichen kann die Zahl bei 10 000 bis 10 Millionen Keimen pro Milliliter Wasser liegen.

Zur klassischen Bakterienflora der Oberflächengewässer gehört Aeromonas hydrophila. Sie können dort in großen Mengen vorhanden sein. Aeromonaden sind als Saprophyten und fakultative Krankheitserreger bei Süßwasserfischen weit verbreitet. Sie können sowohl von Haut und Kiemen als auch aus Leber, Milz, Niere und Darm isoliert werden (LEBLANC et al.

1981; TOPIC POPOVIC et al. 2000) und es werden zahlreiche A. hydrophila Isolate mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften gefunden (LEBLANC et al. 1981).

Systematisch gehören sie neben Aeromonas caviae und Aeromonas sobria zu den beweglichen Aeromonaden. Für ihre Fortbewegung besitzen sie eine polare Geißel. Sie sind gramnegative, an den Enden abgerundete Stäbchen. Zu ihren biochemischen Eigenschaften gehört, dass sie fakultativ anaerob sind und einen heterotrophen oxidativen und fermentativen Stoffwechsel haben. Ihr Wachstumsoptimum liegt bei 28 °C, sie können sich jedoch auch noch bei sehr niedrigen Temperaturen (4 °C) vermehren. Das pH-Optimum liegt zwischen 5,5 und 9,0. Zusätzlich können sie ein Stadium einnehmen, in welchem sie sich nicht anzüchten lassen, aber auch nicht pathogen sind (viable but non-culturable, VBNC-Stadium; RAHMAN et al. 2001).

Wenn es aufgrund von einer Infektion mit A. hydrophila zu krankhaften Veränderungen kommt, so handelt es sich meist um die typischen Symptome einer bakteriellen Infektion

(24)

(SCHÄPERCLAUS 1990). Hierzu gehören Hautrötungen und Hautgeschwüre, petechiale Blutungen und Ödeme. In manchen Fällen können jedoch auch Aszites, Enteritis und Septikämie auftreten (AMLACHER 1992). Die Symptome sind von den verschiedenen virulenten Eigenschaften von A. hydrophila abhängig. Zu diesen gehören extrazelluläre Produkte, die enzymatische Fähigkeiten aufweisen, Enterotoxine und Adhäsionsfaktoren (FANG et al. 2004). Eine Infektion mit A. hydrophila führt jedoch nicht automatisch zu einem Krankheitsausbruch, sondern die Abwehrlage des Wirtsorganismus sowie Umweltfaktoren bestimmen das Entstehen einer klinisch inapparenten bzw. apparenten Infektion (ROLLE u.

MAYR 1993). Unter normalen Umständen reduziert vor allem die Schleimschicht das Anheften von Bakterien auf der Epidermis (CROUSE-EISNOR et al. 1985).

Die normale bakterielle Flora der Fischhaut ist ein direktes Spiegelbild der bakteriellen Flora des Wassers, in dem sie leben (ROBERTS u. SCHLOTFELDT 1985). Dadurch, dass A.

hydrophila ein fakultativ pathogener Keim ist, welcher häufig bei Fischen isoliert wird, wurde er für viele Untersuchungen verwendet. Vor allem in immunologischen Studien wurden häufig attenuierte A. hydrophila eingesetzt (ANBARASU u. CHANDRAN 2001; SHARIFF et al. 2001). Ähnlich sind auch die Untersuchungen über die Auswirkung von Stress auf das unspezifische Immunsystem. YIN et al. (1995) zeigte zum Beispiel, dass trotz Crowding Syndrom mit A. hydrophila intraperitoneal infizierte Fische keine Krankheitssymptome zeigten. IGER et al. (1988) dagegen untersuchten zelluläre Veränderungen der Haut nach einer Wasserbelastung mit ubiquitären Wasserkeimen.

(25)

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere

Um bei Karpfen eine bakteriell bedingte Veränderung der Haut und des Mukus zu beobachten, war eine experimentelle Exposition im Labor notwendig.

Für die Arbeit wurden 60, circa 3 Jahre alte, 115±27,0 g schwere und 16,32±4,15 cm lange Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio) verwendet. Die Fische entstammten aus der Nachzucht einer Zuchtlinie der Bundesforschungsanstalt für Fischerei in Ahrensburg. Die Aufzucht der Geschwistertiere erfolgte im Fachgebiet Fischkrankheiten und Fischhaltung Hannover unter Laborbedingungen. Die Fische, welche frei von Viren sowie Endo- und Ektoparasiten waren, wurden in Glasaquarien in rezirkulierendem Leitungswasser bei einer Wassertemperatur von 18-22 °C aufgezogen. Gefüttert wurde mit kommerziellem Fischfutter (Milkivit, Burgheim) einmal täglich ad libitum.

3.2 Bakterien und Exposition

Für den Expositionversuch wurde Aeromonas hydrophila eingesetzt. Der verwendete Stamm war von der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus einem organisch belasteten Gewässer isoliert worden. Die Bakterien wurden auf Standard Blutagar angezüchtet, vermehrt und schließlich in eine Suspension überführt.

Da Aeromonas hydrophila ein ubiquitärer fakultativ pathogener Keim ist, wurde in diesem Versuch keine Infektion gesetzt, sondern durch die Erhöhung des Keimdrucks der Umgebung eine Belastung der Karpfen durch schlechte Umweltbedingungen simuliert. Die Kontamination wurde mit einer konzentrierten Bakteriensuspension über das Wasser durchgeführt. Dazu wurden 200 ml Bakteriensuspension mit einer Konzentration von 9x10¹⁰ KbE/ml in ein Beckenvolumen von 200 l Wasser gegeben und darin Karpfen für 24 Stunden

(26)

exponiert. Zur Erhöhung des Kontaminationsdrucks für die Fische wurde der Filter erst nach 24 Stunden wieder angeschlossen. Vor und nach der Exposition wurde mit der Probenentnahme die Gesamtkeimzahl bestimmt (Tab. 3.1). Die Bestimmung der Gesamtkeimzahl erfolgte durch mikroskopische Auszählung in der Zählkammer nach NEUGEBAUER in der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Zur Identifikation der Bakterien diente das API 20 NE Testsystem (Bio Mérieux, Nürtingen).

3.3 Versuchsaufbau

Eine Woche vor der Exposition wurden 60 Fische in ein mit einem eingelaufenen Außenfilter versehenes 400 l Becken eingesetzt. Dieses war in einem Raum mit 20 °C Lufttemperatur und einem Lichtregime von 8 Stunden hell/16 Stunden dunkel aufgestellt. Zur besseren Akklimatisierung wurden die Karpfen vier Tage nach dem Umsetzen nicht gefüttert. Am Tag vor und 1, 3, 6, 13 und 20 Tage nach der Exposition mit A. hydrophila wurden jeweils zehn Fische entnommen. Vier kleine Karpfen (88,1±10,5 g) wurden zur histologischen Untersuchung der Haut in Bouinscher-Lösung fixiert, sechs größere (132,9±19,3 g) dienten der Schleimgewinnung. Die Entnahme der Fische erfolgte jeweils zur gleichen Uhrzeit. Um die Haut nicht zu beinträchtigen, wurden die Fische mit einem transparenten 2 l Plastikgefäß aus dem Becken geholt, wobei jeder Karpfen ein extra Gefäß bekam. Jeder Versuchsfisch wurde einzeln durch 500 mg/l des Narkosemittels Tricain (3-Amino-Benzoesäure-Ethyl-Ester, Fa. Sigma, München) getötet. Der Versuchsablauf und die Probenentnahmen sind in Tabelle 3.1 dargestellt.

Von allen Probenfischen wurde die Gesamtlänge sowie das Körpergewicht bestimmt.

Außerdem wurde nach der Formel Körpergewicht mal 100 dividiert durch Körperlänge im Kubik der Korpulenzfaktor berechnet (BOHL 1999). Mit Hilfe des Korpulenzfaktors wurden die Körperproportionen und der Ernährungszustand der Fische beurteilt. Bei einem Korpulenzfaktor unter 2,0 handelte es sich um einen mäßigen Ernährungszustand, zwischen

(27)

Tab. 3.1: Versuchsablauf und Versuchsbedingungen, Zeitpunkt der Probenentnahme, Beckenvolumen, Ergebnisse der Gesamtkeimzahlbestimmung und Korpulenzfaktor (KF) der Karpfen mit Mittelwert und Standardabweichung pro Versuchstag.

Versuchstag/

Uhrzeit

Becken- volumen(l)/

Maßnahmen

Gesamt- keimzahl- bestimmung (KbE/ ml)

Proben für die Histologie (KF) (n=4)

Proben für die Mukusuntersuchung (KF) (n=6)

0

16:00 Uhr 400 l 1,3 x10³ 2.01 ±0.07

2.13 ±0.29 Bakterienzugabe (9 x 10¹⁰), Filter abkoppelt, Beckenvolumen auf 200 l gesenkt

1

16:00 Uhr 200 l 8,8 x 10⁴ 2.49 ±0.12

2.19 ±0.21 Filter installiert, Beckenvolumen auf 400 l aufgefüllt

3

16:00 Uhr 400 l 4,6 x 10⁴ 2.01 ±0.12

2.47 ±0.50 6

16:00Uhr 400l 6,2 x 10⁴ 2.49 ±0.46

2.00 ±0.09 13

16:00 Uhr 400 l 7,1 x 10⁴ 2.15 ±0.05 2.04 ±0.26 20

16:00 Uhr 400 l 6,0 x 10⁴ 2.07 ±0.09 1.94 ±0.24

(28)

3.4 Methoden der Histologie

3.4.1 Probenentnahme

Die getöteten Spiegelkarpfen wurden für vier Tage in Bouinscher-Lösung fixiert (Ansatz: 15 Teile gesättigte Pikrinsäure (Fa. Sigma, München), 5 Teile 37 % Formaldehyd, 1 Teil 100%ige Essigsäure; BÖCK 1989). Anschließend wurden Proben mit einer Kantenlänge von 5 mm cranial, medial und caudal entlang des Seitenlinienorgans entnommen. Zusätzlich wurden auf der anderen Körperseite drei Proben für die Technoviteinbettung entnommen.

3.4.2 Entkalkung und Entwässerung

Anschließend wurden die Hautproben für vier Tage nach der Methode von WARSHAWSKY und MOORE (1967) entkalkt. Hierfür wurde das Material täglich in frische Dinatrium-EDTA- Lösung, pH 7,2 (Ansatz: 41,3 g Dinatrium-EDTA (Fa. Sigma, München) und 4,4 g NaOH ad 1000 ml Aqua dest.) gesetzt.

Zur Entwässerung des Gewebes wurde es vor dem Einbetten erst für jeweils 24 Stunden in 70 und 80%igem Alkohol aufbewahrt. Dann folgten je zwei Stunden in 96%igem Alkohol, in 100%igem Alkohol und in Isopropanol. Abschließend wurden sie für zwei mal zwei Stunden in Xylol gebracht. Für die Kunststoffeinbettung waren der Isopropanol- und die Xylol-Schritte nicht nötig.

(29)

3.4.3 Paraffineinbettung

Um das Gewebe komplett mit Paraffin (Paraplast, Sherwood) zu durchtränken, wurde es zweimal im Abstand von zwei Stunden in 60 °C heißes, frisches Paraffin umgesetzt. Im Anschluß daran wurde es mit frischem Paraffin ausgegossen, um bei Raumtemperatur auszuhärten.

3.4.4 Kunststoffeinbettung

Weil bei der Kunststoffeinbettung Schrumpfungsartefakte (HANSTEDE u. GERRITS 1983) weitgehend verhindert werden, wurde auch Material in Technovit 7100 eingebettet. Das entwässerte Material wurde in der Technovitvorbereitungslösung (Ansatz: 100 ml Technovit 7100 und 1 g Härter 1; Fa .Kulzer, Wehrheim) über Nacht offen stehen gelassen. Eine frisch angesetzte Vorbereitungslösung wurde nun mit dem Härter 2 (Fa. Kulzer, Wehrheim) im Verhältnis 15:1 versetzt und zum Ausgießen der Proben in Plastikformen verwendet. Zum Aushärten des Technovit kamen die Ausgussformen in einen Wärmeschrank bei 37 °C.

Aufgeblockt wurden die Proben mit Technovit 3040 (Fa. Kulzer, Wehrheim) im Verhältnis drei Teile Pulver zu einem Teil Lösungsmittel.

3.4.5 Behandlung vor und nach dem Färbeverfahren

Von den Paraffinblöcken wurden an einem manuellen Rotationsmikrotom circa 4 µm dicke Schnitte erstellt, welche anschließend auf die Objektträger aufgezogen und im Wärmeschrank bei 37 °C angetrocknet wurden. Um die Schnitte weiter zu behandeln, wurden sie entparaffiniert. Hierfür kamen sie zweimal für 10 min in Xylol und wurden für je 3 min in Isopropanol, in 96%igem, in 80%igem und in 70%igem Alkohol überführt. Nach dem

(30)

Färbeverfahren wurden die Schnitte über eine frische, aufsteigende Alkoholreihe für die gleiche Zeit wieder entwässert und mit Eukitt (O. Kindler, Freiburg) eingedeckt.

Die Technovitblöcke wurden an einem Autocut-Mikrotom 3 µm dick geschnitten. Diese Schnitte wurden anschließend für eine Stunde auf einem Wärmetisch (90 °C) dauerhaft auf die Objektträger aufgebrannt. Eine Vorbehandlung der Technovitschnitte war nicht nötig.

Nach dem Färben wurden sie wie die Paraffinschnitte entwässert und mit DePex (Serva, Heidelberg) eingedeckt.

3.4.6 Histologische Übersichtsfärbungen

3.4.6.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung (HE)

Für die HE Färbung an Paraffinschnitten wurde Hämalaun nach DELAFIELD verwendet. Für das Hämalaun wurden 4 g Hämatoxylin in 25 ml absoluten Alkohol gelöst und mit 400 ml 10%igen Ammoniumaluminiumsulfat versetzt. Nach vier Tagen wurden ferner 100 ml Glycerin und 100 ml Methanol zugesetzt, diese Lösung oxidierte an der Luft innerhalb von ein bis zwei Monaten zum fertigen Hämalaun.

1. entparaffinieren

2. 8 min Kernfärbung in Hämalaun nach DELAFIELD 3. 2-3 sek spülen in 1%iger HCl (wässrige Lösung) 4. 15 min unter fließendem Leitungswasser spülen

5. 3 min Gegenfärbung in 1%ig wässrigen Eosin mit 1-2 Tropfen Eisessig 6. spülen in Aqua dest.

7. entwässern und eindecken

(31)

3.4.6.2 Toluidinblau-Färbung (RICHARDSON et al. 1960)

Diese nur an den Technovit-Schnitten angewandte Färbung stellt in erster Linie Proteine dar und wurde hier als Übersichtsfärbung eingesetzt.

1. 1-2 min in Toluidinblau, 1:5 verdünnte Stammlösung

(Ansatz Stammlösung: 1 g Toluidinblau, 1 g Natriumtetraborat und 0,2 g Paraformaldehyd ad 100 ml Aqua dest.)

2. spülen in Aqua dest.

3.4.7 Kohlenhydrathistochemie

3.4.7.1 Perjodsäure-Schiff-Reaktion nach MC MANUS (1948) (aus PEARSE 1972) (PAS- Färbung)

Mit dieser Färbung wurden an Paraffinschnitten neutrale Glykokonjugate nachgewiesen. Nach der Hydrolyse von Aldehydgruppen durch die Perjodessigsäure, reagiert das Schiffsche Reagenz mit diesen rosa-rot.

1. entparaffinieren

2. 15 min in 0,8 % Perjodsäure 3. 3 x 3 min spülen in Aqua dest.

4. 30 min Schiffsches Reagenz nach BARGER u. DE LAMATER (CULLING 1974) 5. 3 x 3 min spülen in Aqua dest.

(Schiffsches Reagenz: 1g Pararosanilin unter leichtem Erwärmen in 400 ml Aqua dest.

(32)

1 ml Thionylchlorid hinzufügen, 12 Stunden stehen lassen 2 g Aktivkohle zusetzen und filtrieren

unter Lichtabschluss im Kühlschrank aufbewahren)

3.4.7.2 Standard Alcianblau-Färbung (pH 2,5) (aus PEARSE 1968) (AB 2,5)

Alcianblau färbt bei einem pH von 2,5 saure Glykokonjugate tiefblau.

1. entparaffinieren 2. spülen in Aqua dest.

3. 30 min in frisch filtrierter Färbelösung

(Ansatz: 1 % Alcianblau 8GX (Fa. Sigma, München) in 3%iger Essigsäure, pH 2,5) 4. spülen mit Aqua dest.

3.4.7.3 Standard Alcianblau-Färbung (pH 1,0) (LEV u. SPICER 1964) (AB 1,0)

Durch eine Veränderung des pH-Werts der Färbelösung können gezielt sulfatierte Glykokonjugate blau angefärbt werden.

1. entparaffinieren

2. 30 min in frisch filtrierte Färbelösung

(Ansatz: 1 % Alcianblau 8GX in 0,1 N HCl, pH 1,0) 3. kurz in 0,1 N HCL tauchen

(33)

3.4.7.4 Alcianblau-PAS-Färbung nach STEEDMAN (1950) (AB-PAS)

Die hier durchgeführte Methode zur allgemeinen Anfärbung von Mukosubstanzen ermöglicht nur den Nachweis von neutralen (rot) und sauren (blau) Glykokonjugaten, ohne Unterscheidung von Karboxyl- und Sulfatgruppen (s. 3.4.7.2/3) (BÖCK 1989). PAS-positive und saure Glykokonjugate erscheinen in der Mischung in unterschiedlicher Ausprägung violett.

1. entparaffinieren

2. 60 min Alcianblau 8GX pH 2,5 (s. 3.4.7.2) 3. kurz spülen in Aqua dest.

4. 10 min 0,8%ige Perjodsäure 5. 3 x 3 min spülen in Aqua dest.

6. 30 min Schiffsches Reagenz (nach BARGER u DE LAMATER) (s. 3.4.7.1) 7. 3 min spülen in Aqua dest.

3.4.7.5 Lektinhistochemische Darstellung von freien Zuckern

Für einen spezifischen Glykokonjugat-Nachweis wurden an den Paraffinschnitten folgende biotingekoppelte Lektinreaktionen (Tab. 3.2) durchgeführt. Die Methode basiert auf MEYER et al. (1993) und DANGUY (1995):

1. Entparaffinieren (Hemmung der endogenen Peroxidase durch 4 ml H₂O₂ auf 196 ml 80%igem Alkohol für 30 min)

2. 3 × 5 min spülen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)

(Ansatz PBS: 40 g NaCl + 7,8 g NaH2PO4 ad 5000 ml Aqua dest.,

(34)

pH 7,2 mit NaOH einstellen)

3. 30 min mit Lektinlösung (ca. 100 µl/Objektträger) in einer feuchten Kammer bei RT inkubieren

(Ansatz Lektinlösung: 1 mg lyophilisiertes und biotinyliertes Lektin (s. Tab. 3.2) auf 10 ml PBS)

4. 3 × 5 min spülen in PBS

5. 30 min mit Peroxidase-konjungiertem Streptavidin (Fa. Biogenex, Hamburg) in einer feuchten Kammer bei RT inkubieren

6. 3 × 5 min spülen in PBS

7. 5 min mit Diaminobenzidin (DAB) Farbstoff (Fa. Biogenex, Hamburg) in einer feuchten Kammer inkubieren

8. 3 × 5 min spülen in PBS 9. entwässern und eindecken

Zur Überprüfung der Zuckerspezifität der verwendeten Lektine wurden Kontrollschnitte und das Lektin in Anwesenheit einer 0,1 M Lösung des spezifischen Zuckers inkubiert (BROOKS et al. 1997). Ferner erfolgte die Kontrolle der endogenen Peroxidase-Aktivität an einem entparaffinierten Schnitt, der unbehandelt in der Entwicklerlösung inkubiert wurde.

(35)

Tab. 3.2: Verwendete biotingekoppelte Lektine und ihre Zuckerspezifität.

Lektin (lat. Name) Abkürzung spezifischer Zucker

Arachis hypogea ("peanut")-Agglutinin¹ PNA 12-D-Galaktose-D-N-Acetyl- Galaktosamin

Concanavalia ensiformes-Agglutinin¹ Con-A 13-D-Mannose, 13-D-Glukose

Dolchios biflorus-Agglutinin¹ DBA

N-Acetyl-3-D- Galaktosamin

Maackia amurensis² MAA

N-Acetylneuraminsäure-3-2-3- Galaktose

Ricinus communis-Agglutinin 1² RCA

N-Acetyl b -D- Galaktose

Sambucus nigra² SNA

N-Acetylneuraminsäure 3-2-6- Galaktose

Triticum vulgare ("wheat germ")-Agglutinin¹ WGA N-Acetyl-b d-Glukosamin

Ulex europaeus-Agglutinin 1¹ UEA-1 3-L-Fukose (¹Fa. Sigma, München, ²Fa. Vector, Burmingham)

(36)

3.4.8 Messungen an den histologischen Schnitten

3.4.8.1 Epidermisdicke

Die Epidermisdicke wurde mit Hilfe eines computergesteuerten Messprogramms (CUE 3, Olympus, Programm Version 4.5, Galai Produktions Ltd., Israel 1996) bestimmt. Pro Fisch wurden an drei Toluidinblau gefärbten Technovit-Schnitten 3 mal 5 Bereiche ausgemessen.

Die Messungen wurden anschließend gemittelt und die Standardabweichung berechnet.

3.4.8.2 Anzahl der Becher- und Clubzellen

Für die Erfassung der Menge an Schleimzellen in der Epidermis wurden an einem HE, AB 1,0 und AB 2,5 gefärbten Schnitt 2 mal 100 Zellen des Str. basale ausgezählt und die oberhalb von diesen liegende Anzahl an Becherzellen notiert. Pro Fisch wurden drei Schnitte ausgezählt, die Ergebnisse wurden gemittelt und die Standardabweichung berechnet. Die Anzahl der Clubzellen wurde ebenso ermittelt.

3.4.9 Photographie

Zur Dokumentation wurden von den verschieden Färbungen jeweils bei 200-, 400- und 1000- facher Vergrößerung am Photomikroskop III (Zeiss) Farbmikrophotographien angefertigt. Als Filmmaterial wurde Ektachrom T 64 (Fa. Kodak, Stuttgart) verwendet.

(37)

3.5 Methodik der Mukusanalyse

3.5.1 Gewinnung des Mukus

Die Gewinnung der Mukusproben vom Fisch wurde in Anlehnung an die Veröffentlichung von ROSS at al. (2000) durchgeführt. Hierfür wurde der Fisch wie bereits unter 3.3 beschrieben getötet. Während dessen wurde, um für die Gelchromatographie eine ausreichende Menge an Material zu gewinnen, 100 ml 100 mM Ammoniumbicarbonat (7,8 pH) in eine Dose mit Deckel gegeben. In dieser wurde der tote Fisch für je 5 Minuten pro Körperseite vorsichtig geschwenkt. Während dieser 10 Minuten befand sich die Dose auf einer gekühlten Flüssigkeit. Anschließend wurde der Fisch entfernt, gemessen und gewogen.

Die zurückbleibende Flüssigkeit wurde mit 100 ml 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Fa. Sigma, München) versetzt, sofort gekühlt und bei 4 °C für 37 Minuten bei 12000 Umdrehungen in der Ultrazentrifuge aufgetrennt. Der Schleim lagerte bis zur weiteren Behandlung bei –80 °C.

3.5.2 Konzentrierung des Mukus

Da bei der anschließenden Säulenchromatographie nur kleine Probenmengen aufgetragen werden konnten, wurde die Probenmenge auf 2 ml konzentriert.

Die Einengung des Materials geschah mit einer 200 ml fassenden Utrafiltrationszelle (Amicon, Schwalbach). Hierbei wurde die Probe mit einem Druck von 2,7 Bar durch eine Membran gepresst. Die Membran (Fa. Milipore, Schwalbach) hat ein molekulares Ausschlussgewicht von 30.000 Dalton, so wird das Lösungsmittel entfernt und die größeren Muzine zurückgehalten.

(38)

3.5.3 Gelchromatographie

Zur Auftrennung der Muzine nach ihrer Molekulargröße wurden die Proben einer Gelchromatographie unterzogen. Hierfür wurden sie auf eine Sepharosegel-Säule mit Gelbettvolumen von 58,4 ml aufgetragen. Diese Säule mit einem Innendurchmesser von 9 mm und einer Länge von 340 mm fraktionierte Moleküle mit einer Größe zwischen 6 x 10⁴ und 2 x 10⁷Dalton für globuläre Proteine und 3 x 10⁴ bis 5 x 10⁶ Dalton für Dextrane. 65 g Sepharosegel (Sepharose CL-4B, Fa. Sigma, München) wurde dreimal mit Phosphatpuffer pH 8,0 (Ansatz: 7,1 g Na2 POH4 und 12,5 mg Amphotericin B (Fa. Fluka, München) ad 5 Liter Aqua dest.) gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Gel im Unterdruck entgast und mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/h mit Phosphatpuffer pH 8,0 auf die Säule gepackt.

Die 2 ml Probe wurde direkt oberhalb des Gelabschlusses aufgetragen und mit einer Fraktionsgröße von 1,3 ml/15 min über die Säule geschickt.

3.5.4 Muzinquantifizierung

Für die Quantifizierung der Muzine wurden die erhaltenen Fraktionen als Tripletts auf 96- Loch-Mikrotiterplatten pipetiert. Durch die photometrische Bestimmung der Bradford- und PAS-Färbung wurde ein Elutionsprofil der Probe mit verschiedenen Peaks erstellt. Um diese Peaks bestimmten Molekülgrößen zuordnen zu können, wurde die Säule mit Eichsubstanzen (s. 3.5.4.3) kalibriert.

3.5.4.1 PAS-Färbung

Mit Perjodsäure-Schiff-Reaktion wurden wie auch in der Histologie (s. 3.4.7.1)

(39)

1. 30 min 150 µl Probe mit 50 µl Perjodessigsäure bei 37 °C inkubieren (Ansatz: 10 mg Perjodsäure auf 10 ml 7%ige Essigsäure)

2. 30 min mit 50 µl Schiffsches Reagenz (Fa. Sigma, München) bei RT inkubieren 3. Extinktion bei 550 nm Wellenlänge photometrisch bestimmen

3.5.4.2 Bradford-Färbung

Der Proteingehalt der Muzine wurde mit Hilfe der Bradford-Färbung bestimmt.

1. 10 min 50 µl Probe mit 200 µl Bradford-Gebrauchslösung bei RT inkubieren (Ansatz:

Bradford-Stammlösung: 100 mg Coomassie Blue G (Fa. Sigma, München), 50 ml

97%iger Ethanol und 100 ml 85%ige Phosphorsäure

Bradford-Gebrauchslösung: 3 ml Stammlösung auf 17 ml Aqua dest.) 2. Extinktion bei einer Wellenlänge von 580 nm photometrisch bestimmen.

3.5.4.3 Säulenkalibrierung

Um den verschiedenen Peaks der Elutionsprofile ein Molekulargewicht zuordnen zu können, wurde die Säule mit verschiedenen Markern kalibriert. Das Molekulargewicht des bovinen Serumalbumins (BSA), Ferritins (Fer), Thyroglobulins (Thyro) und Schweinemagen-Muzins (SMM) sind bekannt (Tab. 3.3.). Von diesen Substanzen wurden 1 mg (BSA, Fer) und 3 mg (Thyro) sowie 5 mg SMM in 2 ml Phosphatpuffer pH 8,0 (s. 3.5.3) gelöst und direkt auf das Gel aufgetregen. Anschließend wurden ihre Elutionsprofile, wie bereits beschrieben, nach einer Bradford- und PAS-Färbung photometrisch ermittelt (Abb.: 4.6).

(40)

Ferner wurde Schweinemagen-Muzin in 100 ml Ammonuimbicarbonat und 100 ml PBS- Puffer gelöst, eingeengt und auf die Säule gegeben, um eventuelle Interaktionen zwischen dem Ammoniumbicarbonat und dem Sepharosegel auszuschließen. Es wurden keine veränderten Ergebnisse festgestellt.

Tab. 3.3: Eichsubstanzen zur Kalibrierung der Sepharosegelsäule

Marker Probenmenge/

2ml

Molekulargewicht Firma

Bovines Serumalbumin

(BSA) 1 mg 69.000 Da

Roth, Karlsruhe Ferritin

(Fer)

1 mg 450.000 Da

Serva, Heidelberg Thyroglobulin

(Thyro)

3 mg 670.000 Da

Sigma, München Schweinemagen-Muzin

(SMM)

5 mg >2.000.000 Da

Sigma, München

3.5.4.4 Lektin-ELISA

Um wie auch in den histologischen Untersuchungen genauer auf die freien Zucker einzugehen, wurde an speziellen 96-Loch-Mikrotiterplatten (Nunc, Wiesbaden) ein Lektin- ELISA durchgeführt. Hierfür wurden die Fraktionen 7-10, 11-15 und 16-22 gepoolt. Als

(41)

1. 25 µl Probe mit 75 µl Coating Puffer über Nacht bei RT inkubieren

(Coating-Puffer Ansatz: 16,8 g NaHCO3 und 21,2 g Na2CO3 ad 1 l Aqua dest. pH 9,6) 2. mit Waschpuffer 3 mal waschen

(Waschpuffer Ansatz: 14,5 g Na2HPO4 x 12 H2O, 1,0 g KH2PO4, 40 g NaCl und 1,0 g KCl ad 500 ml Aqua dest.

Gebrauchslösung: 50 ml Waschpuffer Ansatz, 500 µl Tween 20 (Serva, Heidelberg) in 500 ml Aqua dest.)

3. blockieren mit 150 µl 1 % Serumalbumin für 1 Stunde 4. 3 mal waschen

5. 30 min mit PBS–Lektin 100 µl verdünntes 1:10 Lektin bei RT inkubieren (PBS-Lektin Ansatz: 14,5 g Na2HPO4 x 12 H2O und 1,0 g ad 500 Aqua dest.) 6. 3 mal waschen

7. 30 min mit 100 µl Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Komplex. bei RT inkubieren

(Streptavidin Ansatz: 12 ml PBS-Lektin und 6 µl Streptavidin (DakoCytomation, Hamburg))

8. 3 mal waschen

9. 15 min mit 100 µl Substratlösung bei RT im Dunkeln inkubieren

(Substratlösung Ansatz: 12 ml Aqua dest, 10 Tabletten (DakoCytomatio, Hamburg), 12,5 ml H₂O₂ 30%ig)

10. mit 100 µl 0,5 mol/l Schwefelsäure die Reaktion stoppen 11. Messen im Photometer bei 485 nm und bei 620 nm

(42)

3.6 Statistische Auswertungen

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Sigmastat der Firma SPSS Science, Chicago, Version 2.02.0 ( 1992-1997 SPSS Inc.).

Für die statistische Auswertung wurden alle Messwerte auf Normalverteilung geprüft.

Anschließend wurde für die Daten Mittelwert, Standardabweichung und Median mit 25 % Perzentil und 75 % Perzentil bestimmt. Da die Messergebnisse nicht normalverteilt waren, wurden zur Erfassung signifikanter Unterschiede alle Messungen mittels Kruskal-Wallis-Test ausgewertet. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Ergebnisse der Lektin-ELISA wurden keiner statistischen Berechnung unterzogen, weil die muzinhaltigen Proben gepoolt und peakweise untersucht wurden.

(43)

4 ERGEBNISSE

4.1 Klassifikation der Fische

Insgesamt wurden in dieser Studie 60 Karpfen, mit einem Gewicht zwischen 69,0 g und 179,0 g bei einer Körperlänge von 13,4 cm bis 20,1 cm, eingesetzt. An den Karpfen unter 100 g wurden die histologischen Untersuchungen durchgeführt, während Karpfen über 100 g der Muzinuntersuchung dienten. Die entsprechenden Mittelwerte (MW) und Standardabweichung (SD) der einzelnen Gruppen sowie die daraus berechneten Korpulenzfaktoren sind in Tabelle 4.1 zusammengefasst. Der Ernährungszustand der Fische wurde anhand des Korpulenzfaktors (KF; s. 3.3) beurteilt. So wurde bei 26 % der Fische der

Tab 4.1: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der zur Klassifikation erhobenen Parameter (Länge, Gewicht, Korpulenzfaktor (KF)) der Tiergruppen an den Versuchstagen.

(44)

Ernährungszustand als mäßig (KF3 53 3 3 3 3 8 !"#3 43 53 $3 3 43

Karpfen als sehr gut (KF%35&3'(4343(5634)7563 34

der ausführlichen Untersuchung vor der Probengewinnung wurden keine kranken Tiere beobachtet. Die Daten für den Korpulenzfaktor waren in der Versuchsgruppe normalverteilt.

4.2 Fische vor der Bakterienexposition

Um Daten über den normalen Aufbau der Schleimhaut bei den verwendeten Karpfen zu bekommen, wurden zu Versuchsbeginn zehn Fische analysiert. Vier zwischen 76,3 g und 110,9 g schwere Tiere wurden für die histologischen Untersuchungen präpariert. Sechs weitere Fische für die Muzinuntersuchung waren zwischen 130,7 g und 151,8 g schwer. Die Mittelwerte von Länge, Gewicht und Korpulenzfaktor sind Tabelle 4.1 zu entnehmen.

4.2.1 Messungen an der Epidermis

In der Haut der Karpfen waren zwei Schichten deutlich: Epidermis und Dermis (Abb. 4.1 A).

Die innen liegende Dermis wurde durch die Basalmembran von der Epidermis getrennt.

Die Epidermis gliederte sich in mehrere Schichten Epithelzellen (Abb. 4.1 B). Als erste Epithellage auf die Basalmembran folgte das einschichtige Stratum basale. In dem darauf folgenden, mehrlagigen Stratum spinosum fanden sich Clubzellen (CZ). In der äußersten Schicht des Stratum superficiale lagen die Becherzellen (BZ) und gaben ihren Inhalt an die Oberfläche ab. Der Inhalt der Becherzellen bestand vor allem aus Glykoproteinen und bildete einen Teil der Mukusschicht, welche den kompletten Fisch bedeckt. Die Epidermisdicke lag bei den Karpfen, die einer Kontamination des Wassers mit A. hydrophila ausgesetzt worden waren, zwischen 80,75 und 128,47 µm. Die Messwerte der cranialen, medialen und caudalen Gewebeproben (Abb. 4.2) variierten sehr stark, daher konnte keine Korrelation zwischen

(45)

123456738

956738

A

6825635

682387

685

B

1

123456738

956738

A

6825635

682387

685

B

1

Abb. 4.1: A: Histologisch unveränderte Karpfenhaut (HE, 20x). Die Basalmembran (BM) trennt die Dermis von der Epidermis, mit ihren Becherzellen (BZ), Clubzellen (CZ) und Epithelzellen (EZ). B: Die drei Schichten der Epidermis (AB-PAS, 40x).

Die Becherzellzahlen wurden am AB 1,0, am AB 2,5 und am HE gefärbten Schnitt ausgezählt. In der Übersichtsfärbung mit HE wurden 42,04±5,71 Becherzellen pro 100 Basalzellen erfasst. Mit den Alcianblaumethoden wurden weniger Becherzellen angefärbt (Abb. 4.3). Bei einem pH-Wert von 2,5 wurden mit der AB-Färbung 31,50±6,74 Becherzellen angefärbt, in der AB-1,0-Färbung stellten sich im Mittel nur noch 20,33±5,23 Zellen dar.

Auch hier wurde keine Korrelation zwischen Hautlokalisation und der angefärbten Becherzellzahl beobachtet.

(46)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

1 2 3 4

Fisch

Epidermisdicke (µm)

cranial medial caudal

Abb. 4.2: Mittelwert und Standardabweichung der Epidermisdicke an drei Lokalisationen (cranial, medial, caudal) von vier Karpfen vor der Exposition.

0 10 20 30 40 50 60

1 2 3 4

Fisch

Becherzellzahl/ 100 Basalzellen

H. E. AB 1,0 AB 2,5

(47)

0 5 10 15 20 25 30 35

1 2 3 4

Fisch

Clubzellen/ 100 Basalzellen

cranial medial caudal

Abb. 4.4: Mittelwert und Standardabweichung der Clubzellzahl an drei Lokalisationen

(cranial, medial, caudal) von vier Karpfen vor der Exposition.

Da die Clubzellen in stark schwankender Anzahl in der mittleren Epidermisschicht auftraten, wurden diese ebenfalls gezählt. Die Abbildung 4.4 zeigt jedoch, dass die Anzahl der Clubzellen sowohl zwischen den Individuen als auch innerhalb eines Fisches an den verschiedenen Lokalisationen große Unterschiede aufwies. Die Zahl variierte zwischen 4 und 27 Clubzellen pro 100 Basalzellen, es wurde kein Zusammenhang zwischen der Anzahl der Zellen und der Lokalisation festgestellt. Aus diesem Grund wurde bei den Karpfen, welche der Bakterienexposition ausgesetzt worden waren, nur der Medianwert des gesamten Fisches herangezogen.

(48)

4.2.2 Histochemische Untersuchungen

Bei den histochemischen Untersuchungen wurde das Färbeverhalten der Epidermis unter besonderer Berücksichtigung der Becherzellen beurteilt. Die unterschiedliche Reaktionsintensität der verschiedenen Epidermisschichten wurde in fünf Stufen von sehr schwach bis sehr stark eingeteilt. Durch die kohlenhydrathistochemischen Nachweisverfahren lässt sich zwischen neutralen und sauren Glykokonjugaten unterscheiden. In der AB 2,5- Färbung werden saure, karboxylreiche Glykokonjugate dargestellt, während in der AB 1,0- Färbung saure, sulfatierte reagieren. Neutrale Glykoproteine können mit der PAS-Reaktion nachgewiesen werden.

Hierbei zeigte die Epidermis vom Stratum basale bis zur äußeren Schicht des Stratum spinosum bei keiner der beschriebenen Färbungen eine Reaktion. Erst im Stratum superficiale konnte eine leichte Reaktion in allen drei Färbeverfahren festgestellt werden (s. Tab. 4.3). In der Basalmembran wurden nur neutrale Glykoproteine gefunden, sie stellten sich in der PAS- Färbung rosa und in der AB-PAS–Färbung rosa-violett dar (Abb. 4.5 A, B).

BM

c

b

a

B A

c

b

a CZ

BZ BZ

BM

c

b

a

B A

c

b

a CZ

BZ BZ

Abb. 4.5: A: Reaktion der Basalmembran (BM) und Clubzellen (CZ) in der AB-PAS-Färbung (40x). B: Schwache Färbung der Becherzellen (BZ) und der Basalmembran sowie

(49)

Verglichen mit den normalen Epithelzellen zeigten die Becherzellen in allen Färbungen deutliche Reaktionen. Besonders saure Glykokonjugate ließen sich in den Schleimzellen nachweisen. Hierbei fielen vor allem die tiefblauen, karboxylreichen Glykokonjugate auf, während sich die sulfatreichen Glykokonjugate hellblau färbten. Nach der AB 2,5-Färbung reagierten deutlich mehr Becherzellen als nach der AB 1,0-Färbung, es lagen also vermehrt karboxylierte Glykokonjugate vor. Die Reaktion der Becherzellen auf die PAS-Färbung war schwach (Abb. 4.5 B), und anhand der AB-PAS-Färbung wurde deutlich, dass die Menge der neutralen Glykoproteine in den Becherzellen deutlich geringer war als die der sauren Glykokonjugate.

A

b a c

CZ BZ

b BZ b

c BZ

c

B

C

BM

A A

b a c

CZ BZ

b BZ b

c BZ

c

B

C

BM

Abb. 4.6: Lektinfärbung der Karpfenepidermis mit dem Str. basale (a), Str. spinosum (b), Str.

superficiale (c), Basalmembran (BM), Becherzellen (BZ) und Clubzellen (CZ). (A:

Con A, 40x) (B: PNA, 100x) (C: SNA, 100x).

Mit Hilfe der Lektinhistochemie wurden die Glykokonjugate der Epidermis weiter differenziert. Die unter 3.4.7.5 aufgelisteten Lektine binden spezifisch an bestimmte Zucker.

Die Basalmembran reagierte mit allen Lektinen, bis auf SNA und MAA, schwach (Abb. 4.6 A). Bei sechs Lektinen (PNA, RCA, DAB, UEA 1, Con A, WGA) wurde eine zunehmende

(50)

Intensität der Färbung vom Stratum basale ins Stratum superficiale festgestellt (Abb. 4.6 A).

Die ersten drei Zellschichten der Epidermis waren annähernd gleich stark angefärbt, die Reaktion des Stratum superficiale war überwiegend stark. In den Becherzellen ließ sich Fukose nicht nachweisen, die übrigen Zucker reagierten schwach bis sehr schwach (Abb. A, B). Nur die sialinsäurespezifischen Lektine MAA und SNA färbten ausschließlich die Becherzellen an (Abb. 4.6 C). Eine Übersicht über das Färbeverhalten der einzelnen Epidermisschichten und der Becherzellen bei unbelasteten Karpfen ist in Tabelle 4.3 aufgelistet. Da vor allem die Becherzellen untersucht wurden, wird das Färbeverhalten dieser zusätzlich in einer Tabelle (Tab. 4.2) dargestellt.

Tab. 4.2: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) des histochemischen Färbeverhaltens von Becherzellen bei nicht exponierten Karpfen (n=4). Reaktionen:

Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS), Alcianblau pH 1,0 (AB 1,0), Alcianblau pH 2,5 (AB 2,5), Alcianblau-PAS (AB-PAS) Lektinhistochemie: Abkürzungen siehe 3.4.7.5.

Kohlenhydrathistochemie der Becherzellen Kontroll-

fisch

PAS AB- PAS

AB 2.5

AB 1,0

SNA RCA PNA MAA UEA1 Con A DBA WGA

1 3.0 3.0 3.3 3.2 2.8 0.3 0.5 2.5 0.0 0.3 2.0 1.3 2 3.3 3.7 3.5 3.5 2.5 0.0 0.0 3.0 0.0 0.3 2.2 1.3 3 3.3 3.0 3.7 3.3 3.0 0.5 0.0 3.0 0.0 0.3 2.5 2.5 4 3.2 3.5 3.0 2.5 3.0 0.3 1.0 2.5 0.3 1.3 2.0 1.0 MW 3.2 3.3 3.4 3.1 2.8 0.3 0.4 2.8 0.1 0.6 2.2 1.5 SD 0.1 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.4 0.3 0.1 0.4 0.2 0.6 Reaktionsintensität: 0=keine, 1=sehr schwach, 2=schwach, 3=mittel, 4=stark, 5=sehr stark

(51)

Tab. 4.3: Kohlenhydrathistochemie der Epidermisschichten und der Becherzellen der Kontrollfische (n=4). Reaktionen: Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS), Alcianblau pH 1,0 (AB 1,0), Alcianblau pH 2,5 (AB 2,5), Alcainblau-PAS (AB-PAS), Lektinhistochemie:

Abkürzungen siehe 3.4.7.5.

Reaktion Basal- membran

Str.

basale

Str.

spinosum (innen)

Str.

spinosum (außen)

Str.

super- ficiale

Becher- zellen

PAS 3 0 0 0 2 3

AB 1 0 0 0 0 2-3 3

AB 2,5 0 0 0 0 3 3-4

AB- PAS 3 0 0 0 3 3

Lektine

SNA 0 0 0 0 0 3

RCA 1-2 2 2 2 3 0-1

PNA 2 3 3 3 4 0-1

MAA 0 0 0 0 0 3

UEA 1 2 3 3 3 4 0

Con A 2 3 3 4 4-5 1

DBA 2 3 3 3 4 2

WGA 1-2 2 2-3 3 4 1-2

Epidermisschichten u. Becherzellen

Reaktionsintensität: 0=keine, 1=sehr schwach, 2=schwach, 3=mittel, 4=stark, 5=sehr stark

(52)

4.2.3 Muzinanalyse

Mit der verwendeten Methode ließ sich Mukus von der Haut von sechs Karpfen in reproduzierbarer Weise isolieren. Um die gewonnene Schleimmenge zu quantifizieren, wurden nach Auftrennung der Muzine in der Flüssigkeitschromatographie die nach PAS- Färbung erhaltenen Extinktionen von Fraktion 7 bis 22 aufsummiert. Um jedoch einzelne Fische mit unterschiedlicher Körperoberfläche miteinander vergleichen zu können, wurde ein Korrekturfaktor benötigt. Die von den Fischen gewonnene Schleimmenge wies mit dem Korpulenzfaktor der untersuchten Karpfen eine schwache Korrelation (Korrelationsfaktor:

0,55) auf, so dass der Korpulenzfaktor zur Normierung benutzt wurde. So erfolgten alle Angaben zur Muzinmenge in mOD/KF.

-0.1 0.4 0.9 1.4 1.9 2.4 2.9 3.4

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41

Fraktion

Extinktion (OD)

Thyro BSA Fer SMM

Abb. 4.7: Elutionsprofil von 3 mg Thyroglobulin (Thyro), 1 mg bovines Serumalbumin