In dem Expositionsversuch wurden die Karpfen einer geringen Umweltbelastung ausgesetzt.
Ob diese Umweltveränderung bereits einen Reiz auf den Fisch darstellt und strukturelle Veränderungen in der Haut induziert, sollte durch eine histologische und histochemische Untersuchung und eine Mukusuntersuchung festgestellt werden. Als geeignetes Versuchsmodell erschien die Kontamination des Hälterungswassers mit Aeromonas hydrophila. Dieser ubiquitär vorkommende und fakultativ pathogene Keim führt in der Regel bei exponierten Karpfen zu keinen pathologischen Veränderungen (GEIGER 2001). Er wird jedoch häufig von erkrankten Fischen und in ihrer Umgebung isoliert. A. hydrophila wurde vor allem in Stressversuchen als zusätzlicher Reiz eingesetzt, um das Immunsystem der Fische zu untersuchen (YIN et al. 1995), und er diente auch als Indikatorkeim, um eine Wasserbelastung mit organischem Material zu beurteilen (IGER et al. 1988). Da er bereits vielfach in verschiedenen Studien verwendet wurde und ein klassischer Mikroorganismus des Wassers ist, erschien A. hydrophila für den Expositionsversuch als besonders geeignet.
Bei der Analyse der Epidermis und ihrer Produkte kann es durch die Entnahme sehr leicht zu einer Beeinträchtigung des Probenmaterials kommen. Folglich war es bei allen Untersuchungen wichtig, die Proben möglichst schonend zu gewinnen. Durch den Fang und Transport der Fische mit einem Kescher kann zum Beispiel die empfindliche Haut geschädigt werden und es kann viel Mukus am Kescher verbleiben. Um die Beeinflussung durch den Fang möglichst gering zu halten, wurden alle Versuchsfische daher nicht mit dem Kescher, sondern mit einem sauberen, transparenten 2 Liter fassendem Gefäß aus ihrem Hälterungsbecken gefangen. Es stellte sich als wichtig heraus, dass jedes Transportbecken nur für einen Fisch verwendet wurde, da die Tiere sonst starke Stressreaktionen zeigten. Auch andere Autoren setzten für jeden Fisch ein eigenes Transportgefäß ein (FAST et al. 2002a). In das Fangbecken wurde eine ausreichende Menge an Anästhetikum hinzugefügt, um die Fische schnell zu töten. Obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass das für die Euthanasie verwendete Anästhetikum MS 222 die empfindlichen Glykokonjugate beeinflusst (WIRTH
Um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden, erfolgte die Probenentnahme für die histologischen Untersuchungen von bereits fixierten Fischen. Deshalb wurden die Karpfen nach dem Tötungsbad zunächst direkt in Bouinscher-Lösung überführt und nach 4 Tagen die Gewebeproben herauspräpariert. Die Fixierung in Bouinscher-Lösung liefert für die Untersuchung von Muzinen bessere Resultate als die Fixierung in Formalin (BROOKS et al.
1997).
Die Epidermis der Karpfen ist nicht keratinisiert und die Zellen sind bis in die letzte Schicht vital. Daher können bei der Mukusisolierung leicht eine Vielzahl von Zellen und deren Inhaltsstoffe in die Probe gelangen (NOGA et al. 2002). Es ist sehr schwierig, Fischmukus völlig frei von Epidermiszellen zu gewinnen, zumal schon bei der physiologischen Mukussekretion Zellreste an die Epidermisoberfläche abgegeben werden (TAKASHIMA u.
HIBIYA 1995). Eine besonders hohe Kontamination mit Zellen ist zu erwarten, wenn der Mukus mit Hilfe eines Skalpells vom Fisch abgekratzt wird, wie von einigen Untersuchern vorgenommen (NOGA et al. 2002). ARANISHI et al. (1998) beobachteten, dass in Mukus, der durch Abkratzen gewonnen wurde, die Proteaseaktivität viel höher war, als wenn der Fisch mit einem Handschuh abgeschleimt wurde. Aber auch bei dieser Methode erschien die Kontamination mit Hautzellen unangemessen hoch. Ebenso war die Methode nicht geeignet, den Mukus zu sammeln, der von einem toten Fisch über mehrere Stunden hinweg in einer Plastikbox abgegeben worden war (HJELMELAND et al. 1983). In der vorliegenden Studie wurde zur Schleimgewinnung eine Methode von ROSS et al. (2000) angewendet. Hierbei wurde der tote Fisch vorsichtig in einer Ammoniumbicarbonat-Lösung gespült, so dass die Probe die natürliche Menge und Zusammensetzung des Mukus zum Zeitpunkt der Entnahme repräsentierte.
Bei der Mukusgewinnung durch ein Isolationsmedium wurden die Fische in den meisten Versuchen nur für wenige Minuten in dem Probengefäß geschwenkt (FIRTH et al. 2000;
HATTEN et al. 2001). Für die sich anschließende Gelchromatographie war jedoch ein ausreichendes Probenvolumen nötig, so dass die Karpfen für insgesamt 10 Minuten in einem Gefäß vorsichtig geschwenkt werden mussten. Um einen möglichen Zersetzungsprozess während der Isolierung zu verlangsamen, wurden die Gefäße in 4 °C kaltem Wasser bewegt.
Zusätzlich wurde der mit Puffer verdünnten Probe der Proteasehemmer
Phenylmethysulfonylfluorid (PMSF) zugesetzt. PMSF schützt die kaum glykosilierten und somit für Proteolyse sensitiven N- und C-Termini des Peptidkerns im Muzinmolekül. Ohne den Zusatz des Proteasehemmers würden die meisten der durch Gelfiltration gereinigten Muzinmoleküle ihre „minor regions“ verlieren (DEKKER et al. 1989).
Isolierte Muzine wurden über eine Gelchromatographie nach ihrer Größe aufgetrennt. Durch ihre Eigenschaft als Glykoproteine konnte mit der PAS-Reaktion die ungefähre Kohlenhydratmenge und mit der Bradford-Reaktion der ungefähre Proteinanteil ermittelt werden. Alle gemessenen Extinktionswerte wurden für die jeweiligen Fische mit dem Korpulenzfaktor korrigiert, da eine Abhängigkeit der isolierten Schleimmenge von dem Korpulenzfaktor der Fische zu erkennen war.
Bei den stark glykosilierten Muzinen ist der Proteinanteil der Bradford-Reaktion vielfach nicht vollständig zugänglich (URLAUB 1998). Daher wurde auf eine Quantifizierung der isolierten Mukusmenge hinsichtlich ihres Proteingehaltes verzichtet. Für eine übersichtlichere Darstellung der Daten wurde jedoch ein ungefähres Mukusgewicht anhand des Kohlenhydratanteils auf der Basis der Messwerte für Schweinemagen-Muzin kalkuliert. Eine exakte Quantifizierung der isolierten Muzinmenge erforderte die Kenntnis des Kohlenhydratanteils sowie der Zuckerzusammensetzung, da die Anfärbbarkeit des Mukus von der Zuckerzusammensetzung abhängig ist. So liegt bei einem hohen N-Acetyl-Galaktosamin-Anteil eine gute und bei einem hohen Fukose-N-Acetyl-Galaktosamin-Anteil eine schlechte PAS-Anfärbbarkeit vor (DUBOIS et al. 1956). In einer Studie über die Glykoproteine des Hautmukus von Elritzen wurden, um die Ergebnisse zu quantifizieren, die Proben lyophilisiert und das Glykoprotein auf die Trockensubstanz bezogen (WOLD u. SELSET 1977). Über Karpfenmuzine liegen jedoch keine vergleichbaren Untersuchungen vor, da sich bisher nur wenige Autoren mit der Untersuchung der Glykoproteine im Fischmukus beschäftigt haben. Die Schwerpunkte der Mukusanalyse lagen meist in der Viskosität (LOPEZ-VIDRIERO et al. 1980) oder in der Analyse ganz spezieller Bestandteile im Mukus (BUCHMANN et al. 2004).
5.2 Epidermisdicke, Becherzellzahl, Clubzellzahl
Für die Messung der Epidermisdicke wurde das Gewebe in wasserlöslichen Kunststoff eingebettet, da so die natürliche Struktur weitgehend erhalten bleibt (HANSTEDE u.
GERRITS 1983). Bei einer Paraffineinbettung hingegen treten Schrumpfungsartefakte auf, wodurch es zu sehr unterschiedlichen Messwerten kommen kann, wie von WIRTH (1999) zusammenfassend dargestellt. Dennoch ist es schwer, eine allgemeingültige Angabe über die Epidermisdicke zumachen, da diese von vielen Faktoren abhängig ist. Auch IGER et al.
(1988) und IGER u. ABRAHAM (1990) verwendeten in ihren Untersuchungen an der Karpfenhaut unterschiedliche Ausgangswerte. Die in den hier vorliegenden Untersuchungen 23 -)542545673 53 563 )53 7).3 3 253 $//3 123 523 ,563 43 53 43 053 3 '3 13 23 123 53 $+3 123 834-53 &3 WENDELAAR BONGA 1994; IGER et al. 1988).
Neben saisonal oder hormonell bedingten Schwankungen wirkt sich vor allem Stress auf die Epidermisdicke aus. Da die Wassertemperatur einen großen Einfluss auf die Stressadaption des Fisches hat (ROBERTS 1989), wurden die Versuchsfische bei 20 °C gehalten, was als optimale Haltungstemperatur für Karpfen eingeschätzt wird (BAUR u. RAPP 2003). Nach einer extremen Temperaturerhöhung von 15 °C auf 22 °C ließ sich bei Forellen eine Abnahme der Epidermisdicke in den ersten drei Stunden beobachten. Innerhalb von 24 Stunden stieg sie jedoch wieder auf ihren Normalwert an und überstieg diesen anschließend signifikant (IGER et al. 1994b). Auch auf Stress in Form eines pH-Abfalls des Wassers von pH 7,5 auf pH 6,0 reagierten die Karpfen mit einer Abnahme der Epidermisdicke. Sie erreichte am dritten Tag nach dem pH-Abfall ein Minimum und stieg danach wieder an. Ein pH-Wert von 5,0 schädigte die Haut hingegen dauerhaft und die anfänglich aufgetretenen Nekrosen der Zellen des Str. superficiale gingen in eine Degeneration über (IGER u. WENDELAAR BONGA 1994). Diese Beispiele zeigen, dass die Fischepidermis sehr unterschiedlich auf Einflüsse von außen reagiert. Entscheidend für die Reaktion ist offenbar die Spezifiät des Reizes, die Einwirkdauer sowie die Umgebungstemperatur. Auch die Daten der hier vorliegenden Untersuchung ließen eine Reaktion der Versuchsfische auf die Wasserkontamination erkennen. Die Epidermisdicke nahm ab und erreichte am dritten Tag nach der Kontamination
ein Minimum. Obwohl der Unterschied zu den nicht infizierten Karpfen statistisch nicht abgesichert werden konnte, lässt die bereits oben erwähnten Studie über die Auswirkung von pH-Absenkungen (IGER u. WENDELAAR BONGA 1994) vermuten, dass diese Abnahme der Epidermisdicke auf die Kontamination zurückzuführen ist.
Die anfängliche Epidermisdickenabnahme ist vermutlich eine Folge der natürlichen Zellabstoßung und Sekretionserhöhung, welche zu Beginn einer Hautreaktion steht (IGER u.
WENDELAAR BONGA 1994). Die in der vorliegenden Studie gesetzte Belastung war so gering, dass die sonst auftretende Nekrosen und Hyperplasie ausblieben (LEONARD u.
SUMMERS 1976). Um diese Hypothese zu unterstützen, schien eine Analyse der Anzahl der Becherzellen sinnvoll.
Die Becherzelldichte wurde hier in Anlehnung an die Studie von WIRTH (1999) in Relation zu 100 Basalzellen, aus denen sich die Becherzellen differenzieren, ausgezählt. Auch für die Becherzelldichte sind die Angaben in der Literatur sehr unterschiedlich, die Daten dieser Studie liegen im Rahmen der Literaturangaben (WIRTH 1999). Aufgrund der hohen individuellen Varianz ließen sich Veränderungen in der Zahl der Becherzellen nach Exposition mit A. hydrophila statistisch nicht absichern. Trotzdem war eine Reaktion erkennbar, die sich in mehrere Phasen einteilen ließ. Zu Beginn wanderten bereits aus den Basalzellen differenzierte Zellen ins Str. superficiale, um die Mukussekretion zu unterstützen.
Die Becherzellzahl stieg also aufgrund der Kontamination über 24 Stunden an. In der nächsten Phase, bis 72 Stunden nach der Kontamination, sankt die Anzahl der Zellen bis unter den Ausgangswert der Kontrollfische, da sich ein Großteil der Becherzellen entleerte. In der anschließenden dritten Phase, der Zeit der Akklimation, wurden Becherzellen ersetzt und Muzine in den Zellen synthetisiert. Auch Karpfen, die in organisch gedüngtem Wasser gehalten wurden, wiesen am dritten Tag nach der Exposition fast keine Becherzellen in der Epidermis mehr auf (IGER et al. 1988). Es wurde vermutet, dass dies mit der Entwicklungszeit der Becherzellen zusammenhängt. Unter physiologischen Bedingungen liegt die Entwicklungsdauer von Becherzellen zwischen vier und sechs Tagen, diese Zeit wird mindestens benötigt, bis wieder Becherzellen im Str. superficale vorliegen (PICKERING et al.
Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Studie Becherzellzahl und Epidermisdicke so reagierten, wie es für andere belastende Einflüsse über das Wasser bisher nachgewiesen wurde (IGER et al. 1994b;, IGER u. WENDELAAR BONGA 1994; LEDY et al. 2003).
Neben den vielen Parametern, die sich auf die Zählergebnisse von Becherzellen auswirken, ist auch die Lokalisation der Probennahme auf dem Fisch entscheidend. So waren im kranialen Bereich des Fisches mehr Becherzellen lokalisiert, damit sich der Mukus während der Fortbewegung gleichmäßig über den Fisch verteilt. Diese Ergebnisse wurden vor allem von schnell schwimmenden Arten wie Forelle und Aal erbracht (PICKERING 1974; LEONARD u. SUMMERS 1976; SAGLIO et al. 1988). Bei den hier untersuchten Lokalisationen konnte kein Unterschied zwischen kranialen und posterioren Lokalisationen festgestellt werden. Da jedoch der Karpfen ein sehr langsamer Schwimmer ist und nach PICKERING (1974) auch bei Forellen hohe individuelle regionale Schwankungen der Becherzellen auftreten, kann das eigene Ergebnis durchaus die natürliche Verteilung dieses Zelltyps widerspiegeln.
Im Gegensatz dazu war die Anzahl der Clubzellen sehr starken Variationen unterworfen, so dass kein Zusammenhang mit der Kontamination mit A. hydrophila auffiel. Dieser Zelltyp der Fischepidermis differenziert sich erst sehr spät in der Epidermisentwicklung (TREVISAN u.
PEDERZOLI 1984), was eine deutlich Reaktion auf die kurze Exposition dieses Versuchs unwahrscheinlich macht. Auch IGER u. ABRAHAM (1990) vermuteten, dass dies die Ursache für die nicht vorhandende Reaktion der Clubzellen auf schwache Reize war.
5.3 Kohlenhydrathistochemie
Die Angaben zur Kohlenhydrathistochemie der Fischhaut sind in der Literatur oft widersprüchlich, so stellten HENSCHEL u. MÜLLER (1979) einen höheren Gehalt von Sialinsäure in der Haut von limnischen Salmoniden im Vergleich zu marinen Arten fest, während SOLANKI u. BENJAMIN (1982) u. TREVISAN u. PEDERZOLI (1984) das Gegenteil registrierten. In den Alcianblau-Färbungen (AB 1,0-, AB 2,5-, AB-PAS-) sowie in der PAS-Färbung reagierten vor allem die Becherzellen und in sehr geringer Intensität das
Stratum superficiale. Daher wurden die pH-Untersuchungen vor allem an den Becherzellen ausgewertet. Der Inhalt der Becherzellen besteht aus einem Gemisch von neutralen und sauren Glykokonjugaten (WHITEAR u. MITTAL 1984). Es konnte bei der kombinierten Färbetechnik (AB-PAS) keine Regionalisierung von Sekretanteilen innerhalb einer Zelle oder der Epidermis gesehen werden, ferner lagen weniger neutrale als saure Glykokonjugate vor.
Die sauren Glykokonjugate zeigten sich überwiegend in der karboxilierten Form. Gleiche Befunde erhoben HARRIS u. HUNT (1973) bei Lachsen und Forellen sowie TREVISAN u.
PEDERZOLI (1984) bei Elritzen und WIRTH (1999) bei verschiedenen Fischgruppen.
Sulfatierte Glykokonjugate schränken die Proliferation von Mikroorganismen ein (MITTAL et al. 1994), so dass diese Glykokonjugate unter bestimmten Bedingungen ansteigen. So vermehrt sich zum Beispiel der Gehalt an sulfatierten, sauren Glykoproteinen, wenn Fische in einem Tank zusammen mit vielen Artgenossen gehalten werden. GONA (1979) vermutete, dass diese hohen Gehalte an saurem Mukus einen Schutz gegen Mikroorganismen darstellen.
Veränderungen dieser Art waren in der vorliegenden Studie nicht zu beobachten.
Für eine genauere Darstellung der Glykokonjugate und ihrer Verteilung in und auf der Epidermis wurde in der vorliegenden Studie die empfindliche Lektinhistochemie eingesetzt.
Lektine sind lösliche oder membrangebundene, spezifisch–zuckerbindende Proteine, die Monosaccharide in terminaler Stellung identifizieren. Es wurden Glukose, Galaktose, Mannose, L-Fukose, N-Acetyl-Glukosamin, N-Acetyl-Galaktosamin und Sialinsäure, die typischen Zuckerbestandteile der Glykokonjugate höhere Vertebraten, detektiert. Bei allen Lektinbindungen bis auf die, welche die Sialinsäuren erfassen, wurde eine kontinuierliche Zunahme vom Str. basale zur Oberfläche beobachtet. In diesen Schichten konnten die meisten Lektine neben der Glykokalyx der Zellmembran und der extrazellulärer Matrix binden (BROOKS et al. 1997). Die starke Reaktionsintensität des Str. superficiale bewirkten die sekretorischen Vesikel (BROOKS et al. 1997). Diese lagen vermehrt in der obersten Schicht der Epidermis vor und wurden unterschiedlich stark von allen Lektinen nachgewiesen.
Das Lektin Con A, welches an Mannose bindet, auch wenn dieser Zucker nicht terminal vorliegt (SZENTKUTI u. ENSS 1998), reagierte in allen Schichten. Mannose-enthaltende
da er in seiner Schutzfunktion noch von dem Mukus, den die Filamentzellen bilden, unterstützt wird (BURKHARDT-HOLM 1997). Galaktose (detektiert über RCA) sowie N-Acetyl-Galaktosamin (detektiert über DBA und PNA) kommen ebenfalls vor. Diese Monosaccharide haben eine verdichtende und barrierebildende Aufgabe, indem sie Wasser binden und die Adhäsion von Substanzen fördern (MEYER 1986). Fukose (detektiert über UEA 1) lag reichlich verteilt in der Epidermis der Karpfen vor. Sie spielt eine wichtige Rolle bei morphogenetischen Prozessen an Zytoplasmamembranen (SCOCCO et al. 1996).
Terminal an Kohlenhydratketten gebunden zeigt die Fukose hydrophobe Eigenschaften (SCHULTE et al. 1985). Daher lässt sich vermuten, dass dieser Zuckerrest gemeinsam mit der Galaktose und dem N-Acetyl-Galaktosamin eine wasserregulierende Funktion hat. In den Becherzellen jedoch wurde die Fukose fast gar nicht detektiert. Da sie sich jedoch durch die Gaschromatographie meist nachweisen lässt (SZENTKUTI u. ENSS 1998), liegt Fukose in Muzinen anscheinend so vor, dass sie für die Lektine schwer zugänglich ist (SZENTKUTI u.
ENSS 1998). N-Acetyl-Glukosamin (detektiert über WGA) ist auch ein wesentlicher Bestandteil der Muzine. Die hier beobachtete schwache Färbung der Becherzellen könnte durch den Gehalt an Sialinsäuren bedingt sein, da diese häufig als terminale Zucker an GlcNAc binden und sie somit verdecken (WIRTH 1999). Sialinsäuren wurden im Unterschied zu den übrigen Zuckern nur in den Becherzellen gefunden. Sie bilden ebenfalls einen Schutz für das Muzinmolekül gegenüber proteolytischen Angriffen und verhindern die Adhäsion von pathogenen Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilzen oder Viren an der Hautoberfläche (MITTAL et al. 1994).
Im Laufe der Untersuchungen wurde für die Lektinbindung kein Unterschied zwischen den Kontrollfischen und den Versuchsfischen nach Bakterienexposition erkannt. Aufgrund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass die eingesetzte Kontamination einen geringen Umweltreiz darstellte, der keine mittels histochemischer Methoden erkennbare Veränderung des Glykosilierungsmusters sezernierter Haut-Muzine zu induzieren vermochte. Diese Schlussfolgerung legten auch schon die Messergebnisse der Epidermisdicke und Becherzellzahl nahe.
5.4 Muzinanalyse
Die Befunde der histochemischen Untersuchungen ließen, da sie keine signifikanten Ergebnisse lieferten, noch einige Fragen offen: Handelte es sich hier tatsächlich um eine gezielte Reaktion auf eine Umweltveränderung? Wurde quantitativ mehr Mukus produziert?
Oder wie wirkte sich die geringe Schwankung der Becherzellzahl auf der Fischoberfläche aus? Daher wurde neben der Auswertung der histologischen und histochemischen Befunde der sezernierte Mukus auch biochemisch charakterisiert. Wenn es bei Fischen aufgrund einer Wasserbelastung zu massiver Mukussekretion kommt, ist das meist schon makroskopisch an einem weißen Schleier auf der Haut zu erkennen (FERGUSON 1989). Einige Erkrankungen führen jedoch auch zu einem unsichtbaren Mukus auf der Fischoberfläche (ROBERTS 1989).
Viele Studien stützen sich bei der Beurteilung der Mukussekretion vor allem auf die Untersuchung der Becherzellen (BUCHMANN et al. 2004). Die Becherzellen produzieren einen großen Teil der in der Mukusschicht vorkommenden Glykoproteine, daher wird ein Anstieg oder eine Abnahme ihrer Zahl als Indikator für eine Veränderung in der Mukussekretion gewertet (s. a. 5.2).
In dieser Untersuchung wurde Mukus von der Haut von Karpfen isoliert. Anhand isolierter Muzine wurde zum Beispiel auch die Reaktion der Intestinalmukosa auf Endotoxine untersucht (ENSS et al. 1996; URLAUB 1998). Im Darm liegen die niedermolekularen Muzine meist im Lumen vor, während die hochmolekularen in der Plasmamembran verankert sind (URLAUB 1998). Beim Hautmukus ist jedoch zu beachten, dass durch den direkten Kontakt mit dem umgebenden Wasser kein Unterschied zwischen luminalen und epithelialen Muzinen gemacht werden kann. So zeigten die Elutionsprofile des Hautmukus keinen mit einem Darmprofil vergleichbaren niedermolekularen Anteil (URLAUB 1998). Es ist daher davon auszugehen, dass ein Großteil der niedermolekularen Mukusbestandteile vom Wasser abgeschwemmt wurde.
Nach der Auftrennung des Mukus wurde für alle Versuchstage ein Elutionsprofil erstellt und
Anschließend fiel die Muzinmenge langsam ab, erreichte allerdings erst am 20. Tag wieder den Ausgangwert. Besonders deutlich wurde die Zunahme der Muzinmenge, wenn im Elutionprofil der Bereich mit den hochmolekularen Muzinen betrachtet wurde. Aber auch der Gehalt an weniger glykosilierten Muzinen mit geringer Molekülmasse stieg vor allem am ersten und dritten Tag an. In Studien an Ratten stieg die Darmsekretion von Muzinen beim Kontakt mit Membranbestandteilen von gram-negativen Bakterien bereits am ersten Tag an und wurde auch noch am fünften Tag nachgewiesen (ENSS et al. 1996). Dieses wurde als Entzündungsreaktion interpretiert, die zu einer Hypersekretion von Muzinen führte. Es kann daher vermutet werden, dass der in der vorliegenden Studie sichtbare Anstieg der Muzinmenge ebenfalls auf die Bakterienkontamination im Wasser zurückzuführen ist.
Der Proteingehalt der Muzine an den verschiedenen Tagen nach der A. hydrophila-Exposition verhielt sich ähnlich wie der Kohlenhydratanteil. Auch hier stieg die Proteinmenge bis zum dritten Tag an, wobei sich der Gipfel leicht von niedermolekularen Muzinen im Bereich drei der Elutionskurve zu höhermolekularen im Bereich zwei verschob. Im weiteren Verlauf der Studie sank die Proteinmenge bis am Versuchstag 20, wo sie dann unter dem Ausgangswert lag. Am ersten Tag nach der Kontamination ließ sich eine Zunahme der Proteinfraktionen des zweiten Peaks beobachten. Diese Fraktionen stellten bereits im Elutionsprofil der Kontrollfische den größten Anteil dar. Da in diesem Bereich die niedermolekularen Moleküle lokalisiert waren wurde vermutet, dass der Anteil an gering glykosilierten oder „unreifen“
Proteinen zugenommen hatte. Am dritten Tag nach der Kontamination schob sich der Gipfel der Kurve leicht in den Bereich der hochmolekularen Glykoproteine oder des ersten Peaks, was als eine Vermehrung des Anteils großer Moleküle interpretiert wurde. Auch ROBERTS u. POWELL (2005) dokumentierten eine Steigerung der Proteinkonzentration im Hautmukus aufgrund einer Infektion der Kiemen von Salmoniden mit Amöben.
Beide Elutionskurven zeigten am 13ten Tag nach der Kontamination immer noch eine hohe Extinktion, welche erst am 20sten Versuchstag wieder auf den Ausgangswert abfiel. Die Verteilung zwischen niedermolekularen und hochmolekularen Muzinen entsprach bereits ab dem sechsten Tag den Befunden bei nicht exponierten Karpfen. Ab diesem Versuchstag konnte keine vermehrte Ausschüttung von gering glykosilierten Muzinen mehr beobachtet werden. Die letzte Probe wurde in Anlehnung an die Studien von IGER u. WENDELAAR
BONGA (1994) und IGER et al. (1994b) auf den 20sten Tag festgelegt, da sich in den Versuchsreihen dieser Autoren zwischen dem 14 und 23 Tag nach Exposition noch Veränderungen in der Haut von Forellen und Karpfen gezeigt hatten. In der eigenen Studie erreichte die Mukusproduktion 20 Tage nach Exposition wieder das Ausgangsniveau.
BONGA (1994) und IGER et al. (1994b) auf den 20sten Tag festgelegt, da sich in den Versuchsreihen dieser Autoren zwischen dem 14 und 23 Tag nach Exposition noch Veränderungen in der Haut von Forellen und Karpfen gezeigt hatten. In der eigenen Studie erreichte die Mukusproduktion 20 Tage nach Exposition wieder das Ausgangsniveau.