4.3.1 Messungen an der Epidermis
Die Epidermisdicke an den Versuchstagen 1 bis 20 lag bei 82,75±14,89 µm und war somit niedriger als am Tag vor der Bakterienkontamination (105,66±18,63 µm). Sie sank kontinuierlich von 95,15±18,18 µm am Tag 1 auf 78,76±10,26 µm am Tag 20 ab (Abb. 4.13).
Die Epidermisdicke war schon am ersten Tag nach der Kontamination geringer als vor der Exposition, an den übrigen Tagen war sie mit einem Durchschnitt von 79,65±1,03 µm an allen Tagen ungefähr gleich dünn. Beim Vergleich der Medianwerte konnte jedoch am Tag 20 ein leichter Anstieg erkannt werden. Bezogen auf den Befund der Kontrollfische hatte sich die Epidermisdicke spätestens 72 Stunden nach der Kontamination deutlich verringert und hielt dieses Niveau bis zum Tag 20.
0 20 40 60 80 100 120 140
Kontrolle 1 3 6 13 20
Tage nach der Exposition
Epidermisdicke (µm)
Abb. 4.13: Epidermisdicke von Karpfen nach der Exposition mit A. hydrophila. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von jeweils sechs Karpfen pro Tag.
Die Becherzellzahl lag an den Tagen 1 bis 20 nach der Exposition im Durchschnitt bei 47,23±10,16 pro 100 Basalzellen, war aber Schwankungen unterworfen (Abb. 4.14). 24 Stunden nach der Kontamination stieg die Anzahl der Becherzellen von 42,04±2,49 Zellen vor der Exposition auf 47,71±4,94 an. Nach 72 Stunden fiel die Zellzahl auf 38,35±8,06 ab und stieg dann wieder bis zum sechsten Tag auf 50,92±6,27 an. Am 13ten Tag lag die Anzahl der Becherzellen bei 46,14±4,47 und am 20sten bei 53,03±9,09. Es konnte an keinem Tag ein signifikanter Unterschied zu der Anzahl der Becherzellen vor der Exposition festgestellt werden, auffällig war jedoch, dass 72 Stunden nach der Kontamination die Zellzahl unter den Ausgangswert sank.
0 10 20 30 40 50 60 70
Kontrolle 1 3 6 13 20
Tage nach der Exposition
Becherzellzahl/100 Basalzellen
Abb. 4.14: Anzahl der Becherzellen in der Epidermis von Karpfen nach der Exposition mit A.
hydrophila. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von jeweils sechs Karpfen pro Tag.
Die Becherzellen wurden auch nach der Färbung mit AB 1,0 und AB 2,5 gezählt. Die Zahl der AB 1,0 gefärbten Zellen war nur sehr geringen Schwankungen unterworfen (Abb. 4.15). Im Mittel lag die Zahl der Becherzellen pro 100 Basalzellen an allen Versuchstagen bei
Färbung (Abb. 4.15). Sie stieg am Tag 1 schwach an, sank am Tag 3 leicht ab, und stieg an dem folgenden Versuchstag wieder an. Ab Tag 6 pendelte sich die Zellzahl auf ein einheitliches Niveau ein.
0 10 20 30 40 50 60 70
Kontrolle 1 3 6 13 20
Versuchstag
Becherzellen/ 100 Basalzellen
H.E. AB 1,0 AB 2,5
Abb. 4.15: Anzahl der Becherzellen in der Epidermis von Karpfen (n=6/Tag) nach der Expositon mit A. hydrophila in der HE-, AB 1,0- und AB 2,5-Färbung. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung der Becherzellzahl.
Die Zahl der Clubzellen unterlag auch nach der Exposition der Karpfen mit A. hydrophila so großen individuellen Schwankungen, dass keine Aussage getroffen werden konnte. Sie lag am Tag 1 mit 7 und Tag 2 mit 8,5 Zellen pro 100 Basalzellen im Bereich der Zählungen für die Kontrollfische (9 CZ/100 Basalzellen). An den folgenden Tagen 6, 13 und 20 schwankte sie zwischen 0,25 und 6,5 Clubzellen pro 100 Basalzellen.
4.3.2 Histochemische Untersuchungen
In der kohlenhydrathistochemischen Untersuchung der Epidermis von Karpfen konnten nach der Exposition mit Aeromonas hydrophila keine Veränderungen festgestellt werden. Sowohl in der Alcianblau- und PAS-Färbung als auch in der Lektinhistochemie stellten sich die einzelnen Epidermischichten wie bereits unter 4.2.2 beschrieben dar. Auch das Färbeverhalten der Becherzellen änderte sich nicht nach der Kontamination (Tab. 4.5). Sie ließen sich mit der Alcianblau-, der PAS-Reaktion und mit den Lektinen SNA und MAA anfärben. In der Beurteilung der Färbungen konnten jedoch außer minimalen Schwankungen keine Veränderungen an bestimmten Tagen festgestellt werden.
Tab. 4.5: Histochemische Färbung der Becherzellen in der Haut von Karpfen (n=6/Tag) nach der Expositon mit A. hydrophila. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung.
Kohlenhydrathistochemie der Becherzellen nach der Bakterienexposition
4.3.3 Muzinanalyse
Nach der Kontamination des Hälterungswassers mit A. hydrophila war bei exponierten Karpfen eine gesteigerte Schleimsekretion zu beobachten.
Um eine veränderte Mukussekretion an den einzelnen Versuchstagen zu analysieren, wurden in den Abbildungen 4.16 und 4.17 jeweils Elutionsprofile von Karpfen nach der Bakterienexposition und von Kontrollfischen dargestellt und abschließend das kalkulierte Gewicht oder die OD-Werte der Versuchstage verglichen.
Bei den Kohlenhydratprofilen wurde nach 24 Stunden ein leichter Anstieg des Kohlenhydratanteils der Muzine mit großer Molekülmasse aus dem ersten Bereich des Elutionsprofils sichtbar (Abb. 4.16), welcher am Tag 3 mit über doppelt so viel Kohlenhydraten in einem signifikanten Unterschied gipfelte. An diesem Tage war zudem der Anteil von Muzinen mit mittlerer Molekülmasse aus dem Bereich zwei des Elutionsprofils im Schleim der Karpfen nach der Bakterienexposition deutlich größer als bei nicht exponierten Karpfen. 6 sowie 13 Tage nach der Bakterienkontamination war die Muzinmenge im ersten und im zweiten Bereich des Elutionsprofils, verglichen mit Kontrollkarpfen, weiterhin erhöht.
Am 20sten Tag nach Kontamination entsprach die Muzinmenge schließlich wieder den Meßwerten der Kontrollfische vor der Bakterienexposition
Auch bei der Analyse des Proteingehalts im Mukus von der Haut exponierter Karpfen wurden Veränderungen durch den Vergleich der Elutionsprofile exponierter Karpfen mit Kontrollkarpfen vor der Exposition deutlich (Abb. 4.17).
Kontrolle
Abb. 4.16: Kohlenhydrat-Elutionsprofile von Muzinen isoliert von der Haut von Karpfen nach der Exposition mit A. hydrophila. Kolhenhydratanteil in den Muzinen (Median) von
Kontrolle
Abb. 4.17: Protein-Elutionsprofile von Muzinen isoliert von der Haut von Karpfen nach der Exposition mit A. hydrophila. Proteinanteil in den Muzinen (Median) von exponierten Karpfen (n=6/Tag) im Vergleich zu nicht exponierten Kontrollkarpfen (n=6). Fraktionsvolumen: 1,3 ml/15 min, Gelbettvolumen: 58,4 ml.
Die Proteinanalyse zeigte, dass es am Tag 1 nur zu einem geringfügigen Anstieg des Anteils der Muzine mit großer Molekülmasse aus den Fraktionen 7-10 kam, jedoch fast zu einer Verdoppelung des Muzinanteils in den Fraktionen 10-21 von einem OD-Wert von 6 auf 15.
Der Proteinanteil war 72 Stunden nach der Exposition signifikant höher als der der Kontrollfische. In der Muzinprobe, die 72 Stunden nach der Kontamination von Karpfen isoliert wurde, war der Anteil von Muzinen aus den Fraktionen 10-21 zu dem Maximum von 18 optischer Dichte angestiegen. Außerdem verschob sich der Gipfel dieser Kurve von Fraktion 17 (24 Stunden nach der Expositon) auf Fraktion 14. Dies zeigte, dass 72 Stunden nach der Exposition deutlich mehr Muzine mit höherem Molekulargewicht im Hautschleim zu finden waren. Dieser Befund wird durch den Vergleich der Kohlenhydrat- und Proteinprofile der 72 Stunden nach der Exposition gewonnenen Schleimprobe bestätigt. Am sechsten Tag nach der Kontamination kam es zu einem leichten Abfall auf einen OD Wert von 14, der Proteingehalt lag jedoch am 13ten Tag immer noch bei einem OD-Wert von 17. An den Versuchstagen 6, 13 und 20 wurde der höchste Proteingehalt in den Fraktionen 15-17 gemessen, vergleichbar mit den Schleimen vor Versuchsbeginn und 24 Stunden nach der Exposition. Erst am 20sten Versuchstag entsprach das Elutionsprofil nach der Bakterienkontamination dem nicht exponierter Karpfen.
Die Menge der Kohlenhydratbestandteile des Mukus im Probenvolumen von 2 ml und die Verteilung auf die drei Bereiche des Elutionsprofils wurde anhand des kalkulierten Mukusgewichts dargestellt.
In den isolierten Schleimproben stieg der Kohlenhydratgehalt insgesamt von 0,51 mg in 2 ml Probenlösung vor der Kontamination auf 0,78 mg/2 ml am Tag 1 und auf 1,01 mg/2 ml 3 Tage nach der Exposition. Auch im weiteren Verlauf, an den Tagen 6 und 13 nach der Kontamination waren noch erhöhte Kohlenhydratmengen zu sehen (Tab. 4.6). Am Tag 20 lag der Kohlenhydratgehalt wieder bei 0,52 mg/2 ml. Wurde die Verteilung der Muzine auf die drei Bereiche an den einzelnen Tagen betrachtet, so lag an allen Versuchstagen der größte Teil des gewonnen Mukus (%+335233,56. Besonders deutlich wurde dies am dritten Tag mit 47 %. Am zweiten Versuchstag waren im Bereich zwei und drei jeweils 30 % zu
An den übrigen Versuchstagen sank der prozentuale Anteil von Bereich zwei nach drei ab (Tab. 4.6).
Tab.4.6: Verteilung des Kohlenhydratanteils des isolierten Mukus auf drei Bereiche bezogen auf das kalkulierte Gewicht des jeweiligen Versuchtags
Fraktionen 7-22 7-10 11-15 16-22
Versuchstage Gewicht in mg
(100%) Bereich 1 (%) Bereich 2 (%) Bereich 3 (%)
Kontrolle 0.51 43 24 33
1 0.78 40 30 30
3 1.01 47 31 22
6 0.63 45 28 27
13 0.80 45 33 22
20 0.52 45 28 27
Um die Verteilung der Muzine im Laufe des Versuchs zu beurteilen, wurde das kalkulierte Mukusgewicht aller Tage auch auf das Gewicht von den Proben der Kontrollgruppe bezogen.
Tab. 4.7: Verteilung des Kohlenhydratanteils des Mukus der Versuchstage auf die einzelnen Bereiche in % bezogen auf das kalkulierte Gewicht der Mukusmenge vor der Exposition.
Fraktion 7-22 7-10 11-15 16-22
Versuchstage kalkuliertes
Gewicht (mg) Bereich 1 (%) Bereich 2 (%) Bereich 3 (%)
Kontrolle (100%) 0.51 43 24 33
1 0.78 60 46 46
3 1.01 92 61 44
6 0.63 55 35 33
13 0.80 70 51 33
20 0.52 45 28 27
Am Tag vor der Exposition war die Mukusmenge, bezogen auf die Fraktionen zwischen dem zweiten und dritten Bereich, gleichmäßig verteilt (s. Tab. 4.4). 24 Stunden nach der Kontamination stieg jedoch der Anteil der beiden Bereiche an, so dass sie zusammen mehr Muzine als Bereich 1 beinhalteten, hierbei lagen je 46 % des Mukus in Bereich zwei und drei, während nur 60 % in Bereich eins lagen. Am folgenden Versuchstag verschob sich das Verhältnis zu Gunsten des ersten Bereichs. Hier lagen nun 92 % des Mukus, während auf dem dritten Bereich nur noch 44 % zu finden waren. Diese Verhältnisse blieben bis zum 20. Tag bestehen.
Die gesteigerte Schleimsekretion auf der Haut von Karpfen nach Kontamination des Hälterungswassers mit A. hydrophila manifestierte sich auch nach der Analyse des Proteingehaltes der Mukus-Isolate. In der Tabelle 4.8 wird anhand der OD-Werte die Verteilung der Proteine auf die drei Bereiche dargestellt. Der größte Anteil der Proteine lag im Bereich der niedermolekularen Muzine (Bereich 3), nur am dritten Tag nach der Bakterienexposition kam es zu einer deutliche Verschiebung Richtung Bereich zwei, dem Übergang zu den hochmolekularen Muzinen.
Tab. 4.8: Prozentuale Darstellung der Proteinverteilung im Mukus an den Versuchstagen auf die drei Bereiche, anhand der Summe der OD-Werten (Fraktion 7-22).
Fraktion 7-22 7-10 11-15 16-22
Versuchstage OD-Wert
(gesamt) Bereich 1 (%) Bereich 2 (%) Bereich 3 (%)
Kontrolle (100%) 44.12 13 38 49
1 100.08 19 58 149
3 126.32 24 140 112
6 89.92 24 68 112
13 117.80 25 111 131
20 21.56 10 29 10
Kontrolle
Bereich 1 Bereich 2 Bereich 3
nach 20 Tagen
Abb. 4.18: Terminale Glykosilierung der Muzine isoliert von der Haut von Karpfen. Bindung von Lektinen an Moleküle aus den drei Bereichen des Elutionsprofils der Karpfen (n=6/Tag) nach der Exposition mit A. hydrophila. (Lektin-Abk. s. 3.4.7.5)
In der Analyse der terminalen Glykosilierung von Hautschleimen nach der Bakterienkontamination konnten im Unterschied zu den Elutionsprofilen keine deutlichen
Veränderungen beobachtet werden (Abb. 4.18). Grundsätzlich konnte an allen Tagen vor allem N-Acetyl-*-Galaktosamin mit Hilfe von DBA gefunden werden. Auch Mannose war sehr deutlich mit Con A nachweisbar, während Galaktose über RCA und Sialinsäure über SNA in wesentlich geringeren Mengen gefunden wurde. Fukose wurde über Bindung von UEA 1 nur in minimalen Mengen nachgewiesen.
Nach der Bakterienkontamination stieg zunächst vor allem bei Muzinen mit großer und mittlerer Molekülmasse aus den Bereichen eins und zwei des Elutionsprofils die Bindung von SNA und RCA an. Der Gehalt an N-Acetyl-*-Galaktosamin, ermittelt über die Bindung von DBA, verringerte sich in Molekülen mit mittlerer Molmasse (Bereich 2) und stieg dafür im ersten Bereich an. In allen Bereichen wurde ein erhöhter Gehalt an Mannose über die Bindung von Con A beobachtet. 72 Stunden nach Versuchsbeginn nahm der nachweisbare Zuckeranteil im Vergleich zu 24 Stunden nach der Exposition isolierten Schleimproben ab. Anschließend nahm die Intensität der Bindungen wieder zu und erreichte auch am 20sten Tag nicht wieder die Werte der Kontrollfische.
5 DISKUSSION
Die Arbeitshypothese dieser Studie war, dass die Struktur der Karpfenepidermis und die Muzinsekretion der Karpfenhaut schon von geringen Umwelteinwirkungen beeinflusst wird.
Reaktionen der Mukussekretion auf veränderte Umweltbedingungen wurden bereits beschrieben. So wurde die Veränderung der zellulären Bestandteile der Haut auf organisch gedüngtes oder auf saures Wasser untersucht (IGER et al. 1988; IGER u. WENDELAAR BONGA 1994). Außerdem liegen Befunde zur Schleimzellanwort auf saures sowie mit Ammonium belastetes Wasser vor (LEDY et al. 2003). Ebenso beschäftigten sich verschiedene Autoren mit Parasiteninfektionen und deren Bedeutung für die Mukussekretion (POTTINGER et al. 1984; BUCHMANN et al. 2004). In diesen Studien basierten die Ergebnisse vor allem auf histologischen Befunden. Neben solchen Untersuchungen wurde in einigen Studien auch Mukus isoliert und vor allem auf Inhaltsstoffe untersucht (EBRAN et al.
1999; NOGA et al. 2002). In der vorliegenden Arbeit wurden histologische, histochemische und biochemische Methoden für die Untersuchung der Mukuspoduktion und des Mukustyps kombiniert eingesetzt. Bei der Mukusisolierung stand nicht die Bestimmung einzelner Bestandteile des Schleims im Vordergrund, sondern zunächst die Charakterisierung von Muzingröße und Glykosilierungsmuster.
Die Diskussion der Befunde wird in der gleichen Reihenfolge durchgeführt wie die Darstellung der Daten im Ergebnisteil, so dass zuerst die Methode der Probenentnahme und Schleimisolierung, dann die Ergebnisse der histologischen und histochemischen Untersuchungen und abschließend die biochemische Muzinanalyse erörtert wird.