3.5.1 Probengewinnung für die Histologie und Histochemie
Für die Histologie und Histochemie wurden sofort nach der Tötung der Karpfen jeweils etwa drei Millimeter dicke Darmabschnitte mit Hilfe eines Skalpels auf einer kühlen Unterlage (Kühlakku) abgetrennt und in Bouinscher Lösung (siehe Anhang) fixiert. Zur Untersuchung gelangten Abschnitte des Mitteldarmes, welche vier Zentimeter kaudal der magenähnlichen Erweiterung lagen.
Eine halbe Woche nach der Probennahme wurden die Gewebestücke über Alkohol entwässert, mit Paraffin durchtränkt und schließlich zur Anfertigung der histologischen und histochemischen Präparate in Paraffin aufgeblockt.
Da bei der histochemischen Auswertung eine exakte, computergesteuerte Messung von Farbqualitäten nicht möglich war, wurde für die untersuchten Parameter bei jeder Färbung aus 3.5.5 und 3.5.6 im Ergebnisteil dasselbe Beurteilungsschema zu Grunde gelegt (siehe Tab.
3.1):
Tab. 3.1: Beurteilungsschema zur Beschreibung der untersuchten Parameter
Zur Auswertung gelangten 33 Fische, vier Tiere als Kontrolle, neun Tiere zur Bestimmung des unbehandelten sowie zwanzig zur Bestimmung des stimulierten Zustandes nach Endotoxin-Applikation an den unterschiedlichen Versuchstagen. Beurteilt wurden bei jeder Färbung die Parameter Becherzellzahl, -form und –färbung sowie die Färbung des Mukus.
Eine statistische Auswertung der ermittelten Ergebnisse fand aufgrund der geringen Stichprobenzahl nicht statt.
3.5.2 Paraffineinbettung
Die in Bouinscher-Lösung (siehe Anhang) fixierten Proben wurden für die Paraffineinbettung in Plastik-Kapseln4 gebracht und in 70 %igem Alkohol gespült. Als die Gelbfärbung der Lösung komplett erloschen war, wurden die Proben für 24 Stunden in 80 %igen Alkohol überführt. Dieser wurde zwei- bis dreimal gewechselt. Danach schloss sich folgende aufsteigende Alkoholreihe an:
1.) 2 Stunden in 96 %igem Alkohol 2.) 2 Stunden in 100 %igem Alkohol 3.) 2 Stunden in Isopropanol
4 Plastik-Kapseln, Tissue Teck, Fa. Vogel, Gießen
Ausprägung des untersuchten Parameters zugewiesene Zahl
keine 0
geringgradig 1
gering- bis mittelgradig 2
mittelgradig 3
mittel- bis hochgradig 4
hochgradig 5
n.b. nicht beurteilbar
schlank und regelmäßig 1
schlank und regelmäßig bis dick und rund 2
dick und rund 3
Schließlich wurden die Proben zwei Mal für zwei Stunden in Xylol eingelegt, um hierauf mit flüssigem, 60 °C warmen Paraffin5 durchtränkt zu werden. Die Proben wurden je zwei Stunden in Paraffin I, II und III verbracht und letztendlich in Paraffin III ausgegossen. Eine Aushärtung fand im Kühlschrank bei 8 °C statt.
3.5.3 Aufblocken und Schneiden
Die Paraffinblöcke wurden mit einem manuellen Rotationsmikrotom in einer Dicke von 5 m geschnitten. Nach dem Aufbringen von je drei Schnitten auf einen Objektträger wurden die Präparate anschließend in einem Wärmeschrank 24 Stunden lang bei 60°C angetrocknet.
3.5.4 Histologische Übersichtsfärbungen
Für jede Färbung mussten die Schnitte zunächst entparaffiniert werden. Dies erfolgte in einem Xylolbad für zweimal fünfzehn Minuten. Anschließend wurden die Proben in eine absteigende Alkoholreihe mit Isopropanol (drei Minuten), 96 %igem (zwei Minuten), 80
%igem (zwei Minuten) sowie 70 %igem Alkohol (zwei Minuten) überführt und dann in den entsprechenden Färbungen weiterverwendet. Nach Abschluss der Färbungen wurden die Schnitte folgendermaßen entwässert und geklärt: zwei Minuten in 70 %igem, zwei Minuten in 80 %igem, zwei Minuten in 96 %igem Alkohol, zwei Minuten in Isopropanol sowie zweimal je fünf Minuten in Xylol. Die Schnitte wurden dann feucht mit Eukitt6 eingedeckt.
5 Paraffin, Fa. Sherwood Medical, St. Louis, Bestnr.: 02847-AB
6 Eukitt, Fa. Kindler, Freiburg
3.5.4.1 Hämatoxylin-Eosin Färbung (H.E.)
Für die H.E. Färbung der Paraffinschnitte wurde Hämalaun nach MAYER (siehe Anhang) verwendet. Vor Verwendung wurde die Färbelösung filtriert. Zur Gegenfärbung wurde bei den Paraffinschnitten eine 1 %ige wässrige Eosin-Lösung angesetzt, welcher einmalig ein bis zwei Tropfen Eisessig zugefügt wurden.
Folgendes Färbeprotokoll fand Anwendung:
1.) 8 min Hämalaun nach MAYER
2.) Kurz (2 -3 Sekunden) spülen in 1 %iger HCl (wässrige Lösung) 3.) 15 min in fließendem Leitungswasser spülen
4.) 3 min in 1 %igem wässrigen Eosin und ein bis zwei Tropfen Eisessig 5.) Spülen in Aqua dest.
6.) Differenzieren in 70 %igem Alkohol 7.) Aufsteigende Alkoholreihe / entwässern:
- 2 min in 80 %igem Alkohol, 2 min in 96 %igem Alkohol, 2 min in Isopropanol 8.) 2 x 5 min in Xylol
9.) Feucht eindecken mit Eukitt
3.5.5 Kohlenhydrat-Histochemische Nachweisverfahren
Wie unter 3.5.4 beschrieben wurden die Schnitte zunächst entparaffiniert und dann in eine absteigende Alkoholreihe überführt, um die Kohlenhydrat-Nachweise beginnen zu können.
3.5.5.1 Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS-Färbung)
Das in der Folge aufgezeigte Färbe-Protokoll fand bei der Reaktion Anwendung. PAS-positive Substanzen (neutrale Glykokonjugate) färben sich infolge dieser Reaktion rosa-rot (McMANUS 1948 in PEARSE 1972).
1.) 15 min in 0,8 % Perjodsäure
2.) 3 x für je 3 min in Aqua dest. spülen
3.) 40 min Schiffsches Reagenz (siehe Anhang) 4.) 3 x je 3 min in Aqua dest. spülen
3.5.5.2 Alcianblau-PAS-Färbung (AB-PAS)
Die durchgeführte Alcianblau-PAS-Methode ermöglicht den Nachweis von neutralen (rot) und sauren (blau) Glykokonjugaten, wobei keine Unterscheidung von Carboxyl- und Sulfatgruppen stattfindet (STEEDMAN 1950). PAS-positive saure Glykokonjugat-Verbindungen erscheinen in den entsprechenden Mischfarben (violett). Danach wird folgendes Protokoll verwendet:
1.) Kurz spülen in Aqua dest.
2.) 60 min in Alcianblau 8GX7, anschließend kurz spülen in Aqua dest.
3.) 10 min in 0,8 %iger Perjodsäure, dann 3 x 3 min spülen in Aqua dest.
4.) 30 min in Schiff´schem Reagenz, anschließend 3 min spülen in Aqua dest.
3.5.5.3 Standard Alcianblau-Färbung (pH 2,5)
Zur Anfärbung saurer Glykokonjugate fand folgendes Protokoll der Alcianblau-Färbung (MOWRY 1956) Anwendung:
1.) Spülen in Aqua dest.
2.) 30 min in frisch filtrierte Färbelösung (1 % Alcianblau 8GX in 3 %iger Essigsäure) 3.) Spülen mit Aqua dest.
7 Alcianblau 8GX, Fa. Sigma, München, Bestnr.: A5268
3.5.5.4 Standard Alcianblau-Färbung (pH 1,0)
Zur Anfärbung sulfatierter Glykokonjugate fand folgendes Protokoll nach LEV u. SPICER (1964) Anwendung:
1.) 30 Minuten in frisch filtrierter Färbelösung (1 % Alcianblau8GXin 0.1 N HCl (pH 1,0)
2.) Kurz in 0,1 N HCl geben
3.) Mit feinem Filterpapier abtrocknen
3.5.6 Lektin-Histochemische Nachweise von freien Zuckern
Es wurden acht verschiedene Lektinreaktionen an Paraffinschnitten durchgeführt (BROOKS et al. 1997; TSUKISE et al. 2000; MEYER et al. 2001; SAKAIRI et al. 2004). Dabei fanden biotingekoppelte Lektine Anwendung (siehe Tab. 3.2), welche diejenigen Liganden bevorzugt nachweisen, die in Glykokonjugaten vorkommen.
Tab. 3.2: Verwendete Lektine und nachgewiesene Liganden
8 Con A, Fa. Sigma, München, Bestnr.: C2272 12 RCA, Fa. Vector, Burmingham, Bestnr.: B1085
9 DBA, Fa. Sigma, München, Bestnr.:L6533 13 SNA, Fa. Vector, Burmingham, Bestnr.: B1306
10 UEA-I, Fa. Sigma, München, Bestnr.: L8262 14 MAA, Fa. Vector, Burmingham, Bestnr.: B1315
11 PNA, Fa. Sigma, München, Bestnr.: L6135 15 WGA, Fa. Sigma, München, Bestnr.: L5142 Lektin Quelle des Lektins Bevorzugter Ligand
Con A8 Canavalia ensiformis α-D-Mannose
DBA9 Dolichos biflorus N-Acetyl-α-D-Galaktosamin UEA-I10 Ulex europaeus α-D-Fukose
PNA11 Arachis hypogea Gal- -1-3GalNAc RCA12 Ricinus communis N-Acetyl- -D-Galaktosamin SNA13 Sambucus nigra NeuNAc-α-2-6-Galaktose MAA14 Maackia amurensis NeuNAc-α-2-3-Galaktose WGA15 Triticum vulgaris N-Acetyl- -D-Glukosamin
Dabei wurde eine Färbung der histologischen Präparate mit Hilfe eines Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Komplexes erreicht. Eine schematische Darstellung der ablaufenden Reaktion ist ergänzend im Kapitel 3.6.5 zu finden.
Folgender Färbungsverlauf kam zur Anwendung:
1.) Entparaffinieren:
-10-15 min Xylol -10-15 min Xylol -2 min Isopropanol -2 min 96 %iger Alkohol
-30 min 80 %iger Alkohol mit H202
-2 min 70 %iger Alkohol
2.) 3 × 5 min spülen in PBS (siehe Anhang)
3.) 60 min Lektinlösung einwirken lassen (0,1 mg biotinyliertes Lektin in 1 ml PBS ) in feuchter Kammer, danach 3 × 5min spülen in PBS
4.) 30 min mit Detektionssytem16 in feuchter Kammer 5.) 3 × 5 min spülen in PBS
6.) 5 min mit Farbstoff17 in feuchter Kammer
Eine Kontrolle der Lektin-Färbungen fand nach den Angaben von BROOKS et al. (1997) statt.
16Peroxidase-konjungiertes Streptavidin von Biogenix, Hamburg, Bestnr.: QP-900-9L
17 Diaminobenzidin (DAB), Fa. Biogenix, San Ramon, U.S.A., Bestnr.: CK-0906-01
3.5.7 Photographie
Die histologischen und histochemischen Präparate wurden mit Hilfe eines Zeiss Photomikroskops III auf Farbfilmen18 dokumentiert.