DNA-Varianten in Zytokin codierenden Genen beim Schwein

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Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem

Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung, Fachgebiet Tierzüchtung und Biotechnologie der Universität Hohenheim

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DNA-Varianten in Zytokin codierenden Genen beim Schwein

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von von

Tania Peischl aus Hausham

Hannover 2006

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. O. Distl

Prof. Dr. H. Geldermann

1. Gutachter: Prof. Dr. O. Distl 2. Gutachter: Prof. Dr. N. Baltes

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2006

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Meinen Eltern

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung 11

2 Literaturübersicht 12

2.1. Aufbau und Funktion der Zytokine 12

2.2 Beschreibung einiger Zytokine 17

2.2.1 Interleukin-2 17

2.2.4 Interferon-γ 20

2.3 Aufbau und chromosomale Lokalisation der Zytokin-codierenden Gene 21

2.4 Regulation der Zytokin-Gene 23

2.5 Beschreibung der untersuchten Zytokin-codierenden Gene 24

2.5.1 Interleukin-2-Gen (IL-2) 34

2.5.3 Interleukin-12B-Gen (IL-12B) 43

2.5.4 Interferon-γ-Gen (IFN-γ) 46

3 Material und Methoden 52

3.1 Informative Tiergruppen und Probenerfassung 52

3.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 53

3.3 Puffer, Lösungen und Medien 55

3.4 Spezialgeräte 57

3.5 Vektoren und Bakterien 57

3.6 DNA-Isolierung 58

3.6.1 DNA-Isolierung aus Vollblut 58

3.6.2 DNA-Isolierung aus Sperma 59

3.6.3 Prüfung der DNA-Konzentration und -Qualität 59

3.7 Auswahl der Gene, DNA-Bereiche und Primer 60

3.8 Optimierung und Durchführung der Polymerasenkettenreaktion (PCR) 61

3.9 Agarosegel-Elektrophorese 63

3.10 Klonierung von PCR-Produkten 63

3.11 DNA-Sequenzierung 66

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3.12 Etablierung der RFLP-Darstellung 67 3.13 RFLP-Analyse von DNA eines ausgewählten Tiermaterials 68

4 Ergebnisse 69

4.1 Struktur der ausgewählten Zytokin-Gene beim Schwein 69

4.1.3 Interleukin-12-Gen (IL-12B) 73

4.1.4 Interferon-γ-Gen (IFN-γ) 75

4.2 Vergleich der Sequenzen für die Zytokin-Gene zwischen Schwein, Mensch, Maus und Rind

75 4.3 Ausgewählte Bereiche der Zytokin-Gene für die Sequenzierung 85

4.4 Ausgewählte Primer und PCR-Bedingungen 86

4.5 Ergebnisse der vergleichenden Sequenzierung 86

4.6 Vergleich der Sequenzbereiche der porcinen Zytokin-Gene mit humanen bzw. murinen Sequenzen

95

4.6.1 Homologie der sequenzierten Bereiche 95

4.6.2 Potenzielle Response-Elemente in den sequenzierten Bereichen der Zytokin-Gene

98 4.6.3 Vergleich der in humanen Zytokine-Genen nachgewiesenen

Response-Elemente mit porcinen Sequenzen

101

4.7 Nachweis der DNA-Varianten als RFLP 105

4.7.1 RFLP-Darstellung 105

4.7.2 Analyse desRFLP bei Schweinen verschiedener Rassen 108

5 Diskussion 110

5.1 Auswahl der Zytokin-Gene als Kandidaten der Immunabwehr 110 5.2 Homologien zwischen orthologen Zytokin-Genen 112 5.3 Funktionell bedeutsame Bereiche in den untersuchten porcinen

Zytokin-Genen

113 5.4 Auswahl und Optimierung von Methoden für den Nachweis von

DNA-Varianten in spezifischen Genregionen

115 5.5 Varianten in den ausgewählten Bereichen der porcinen Zytokin-Gene 118 5.6 Potenziell funktionelle Bedeutung der gefundenen DNA-Varianten 119

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5.7 Polymorphe Verbreitung und veterinärmedizinisch-züchterische Bedeutung der Zytokin-Gen-Varianten in Schweinerassen

123

5.8 Folgerungen für weitere Forschungsarbeiten 124

6 Zusammenfassung 126

7 Summary 128

8 Literaturverzeichnis 130

9 Anhang 149

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Abkürzungsverzeichnis

A Adenin

APS Ammoniumperoxidisulfat

bp Basenpaare

C Cytosin

CDS Coding Sequence

cM CentiMorgan

cDNA Copy DNA

CSF Colony Stimulating Factor CTL Cytotoxic T Lymphocytes

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

DTE Dithioerytritol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EMSA Electromobility Shift Assay

G Guanin

IFN Interferon

IL Interleukin

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid iTreg induzierbare regulatorische T-Zellen

kDa kilo Dalton

MHC II Major Histocompatibility Complex II mRNA messenger Ribonukleinsäure NK-Zellen natürliche Killerzellen

nTreg natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen

ORF Open Reading Frame

PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative Trait Locus

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

RT Raumtemperatur

SNP Single Nucleotide Polymorphism

T Thymin

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Taq Thermophilus aquaticus

TBE Tris Borat EDTA

TCR T Cell Receptor

TE Tris EDTA

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

Th T Helfer

Th1 T Helfer 1

Th2 T Helfer 2

Th3 T Helfer 3

TNF-α Tumornekrosefaktor-α

Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan TRI regulatorische T-Zellen Typ I tsp Transkriptionsstartpunkt

UTR Untranslated region

v/v Volumen pro Volumen

w/v Masse pro Volumen

x g x Erdbeschleunigung

X-Gal 4-Brom-3-Chlor-indolyl-β-D-galactopyranosid

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1 Einleitung

Untersuchungen einzelner für die Krankheitsresistenz wichtiger Gene befinden sich bei Nutztieren noch im Anfangsstadium, und nur in wenigen Fällen wird die Gendiagnostik bereits in der Zuchtpraxis für eine Verbesserung der Krankheitsresistenz eingesetzt. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass eine Vielzahl an Genen eine Bedeutung für die Abwehr von Pathogenen hat, wie etwa die Gene für die Immunglobuline, Histokompatibilität oder Zelldifferenzierungen. Zu einer wichtigen Gengruppe für die Regulation und Kontrolle der Immunantwort gehören die Zytokin-Gene. Wie Untersuchungen beim Menschen gezeigt haben, besitzen Zytokine eine maßgebliche Bedeutung für die allgemeine Krankheitsresistenz. Varianten in Zytokin-codierenden Genen traten bei den Trägerindividuen mit einer allgemein verbesserten bzw.

verschlechterten Immunkompetenz gegenüber vielen Erregern assoziiert auf. Damit sind die Zytokin-Gene auch beim Schwein wichtige Kandidaten für die Krankheitsresistenz. In dieser Spezies gibt es Kenntnisse über die Produkte (mRNA, Proteine) einiger dieser Gene, während die Struktur und Funktion der porcinen Zytokin- Gene auf genomischem Niveau nahezu unbekannt sind.

Ziel der Forschungsarbeiten war es, Gene für die Standortanpassung und Krankheitsresistenz bei lokalen Schweinerassen in Vietnam zu untersuchen. Durch einen Vergleich vietnamesischer mit chinesischen und europäischen Schweinen konnten Informationen gewonnen werden, ob ausgewählte Kandidatengene je nach Herkunft der Schweine unterschiedliche Allele besitzen. In dieser Arbeit wurden nur einige Zytokin-Gene untersucht, und es ging zunächst darum, auf der Basis von DNA- Sequenzvergleichen zwischen verschiedenen Säugerspezies die Struktur und Sequenz der porcinen Gene abzuleiten. Dabei konnten potenziell funktionswichtige DNA- Bereiche des Menschen benutzt werden, um die homologen porcinen Regionen zu identifizieren. Für diese DNA-Regionen erfolgte eine vergleichende Sequenzierung, in welche Schweine genetisch stark unterschiedlicher Rassen einbezogen wurden. Soweit dies möglich war, wurden die Varianten als RFLPs identifiziert und ihre polymorphe Verbreitung an genetisch heterogenen Schweinen geprüft. Außerdem wurde untersucht, ob für eine ausgewählte Gengruppe besondere Allele in den verschiedenen Schweinerassen vorkommen und ob Aussagen über potenziell wichtige regulatorische Elemente in den sequenzierten Abschnitten gemacht werden können. Die auf diesem Wege verifizierbaren polymorphen DNA-Varianten sind genetischen Untersuchungen der Krankheitsresistenz zugänglich.

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2 Literaturübersicht

2.1 Aufbau und Funktion der Zytokine

Bei den Zytokinen handelt es sich um eine heterogene Gruppe löslicher Proteine mit Molekülgrößen von ca. 6 - 30 kDa, die in hormonähnlicher Weise die funktionelle Aktivität von Zellen und Geweben des Immunsystems beeinflussen (ARAI et al., 1990).

Außerdem wirken Zytokine auf zahlreiche weitere Prozesse des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Die Gruppe der Zytokine umfasst Interleukine (IL), Interferone (IFN), Kolonie-stimulierende Faktoren (Colony Stimulating Factors, CSF), Wachstumsfaktoren und Chemokine (Tab. 1). Meist handelt es sich bei den Zytokinen um Glykoproteine, die von spezifischen Zellen des Immunsystems sezerniert werden. Gewöhnlich haben sie nur eine kurze Halbwertszeit. Die Expression der Zytokine erfolgt normalerweise erst nach vorheriger Stimulation und kann auf allen Ebenen der Genexpression reguliert werden. Durch alternatives Splicing entstehen bei einigen Zytokinen variable Formen mit unterschiedlicher Bioaktivität. In vielen Fällen unterscheiden sich die Expressionsmuster verschiedener Zytokinformen, so dass auf eine spezifische Aufgabe einer jeden Form geschlossen wird (IBELGAUFT, 2003).

Immunregulatorische Funktion der Zytokine. Aufgrund ihrer Funktion als Immunmodulatoren und –regulatoren nehmen die Zytokine eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung einer wirksamen Immunabwehr ein. Sie steuern die Entwicklung, Vermehrung, Differenzierung und Alterung von Zellen des Immunsystems. Dabei sind sie auf folgende Weise sowohl bei der angeborenen als auch bei der erworbenen Immunantwort von Bedeutung:

• Bedeutung der Zytokine bei der angeborenen Immunität. Das angeborene Immunsystem umfasst u. a. unspezifische Abwehrmechanismen nach erstem Antigenkontakt. Zytokine wirken hierbei entweder direkt auf den Erreger oder indirekt durch die Aktivierung von NK-Zellen (Natürliche Killerzellen) und Makrophagen. Die Interferone α, β und γ verhindern eine virale Replikation, indem sie die Körperzellen in einen Zustand der Resistenz gegenüber Viren versetzen können. Außerdem induzieren sie die Synthese antiviral wirksamer Stoffe, welche

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virale mRNA-Moleküle degradieren, und sie aktivieren andere Gene - z.B. das Mx(Myxovirus)-Gen (STAEHELI, 1990) - zur Expression antiviraler Proteine. Die Interleukine 1, 6 und 12 aktivieren Makrophagen und NK-Zellen, was zur Phagozytose des Pathogens und zur Antigenpräsentation führt (LEE et al., 1989;

D’ANDREA et al., 1992; LOCKSLEY et al., 1993). Der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) ist für entzündliche Prozesse verantwortlich. Er erhöht die Permeabilität der Blutgefäße für Stoffe der Immunabwehr, wie Immunglobuline, Complement etc.

• Bedeutung der Zytokine bei der erworbenen Immunantwort. Die erworbene oder spezifische Immunantwort wird in zwei Komponenten unterteilt, die humorale (vermittelt über B-Lymphozyten und Immunglobuline) und die zellvermittelte (vermittelt über cytotoxische T-Lymphozyten) Immunantwort. Beide Komponenten werden von T-Helfer-Lymphozyten (Th-Zellen) und deren Zytokinen gesteuert.

Dabei unterscheidet man anhand des sezernierten Musters an Zytokinen die Th1- und die Th2-Zellen (CHERWINSKI et al., 1987; MOSMANN und COFFMAN, 1989;

DE VRIES et al., 1991; SEDER und PAUL, 1994). Zu den Th1-Zytokinen gehören IL-2, IFN-γ, IL-12 und TNF-β (TRINCHIERI, 1995), während die Th2-Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 umfassen (FINKELMAN et al., 1997; IBELGAUFT, 2003).

Beide Zelltypen entwickeln sich nach Stimulation durch spezifische Zytokine aus den Th0-Zellen (T-Helfer-Vorläuferzellen).

Tab. 1: Einteilung der Zytokine anhand ihrer Funktionen Zytokingruppe Prinzipielle Funktionen Beispiele;

Symbol ¹) Alternative Bezeichnung Interleukine (IL) Vor allem Wachstums- und

Differenzierungsfaktoren für lymphoide Zellen

IL-2 IL-6 IL-12

T-cell growth factor B cell stimulating factor Cytotoxic lymphocyte maturating factor; natural killer stimulating factor Interferone (IFN) Antivirale und

immunologische Funktion IFN-α IFN-β IFN-γ

Leukozyten-IFN Fibroblasten-IFN Immun-IFN

1) In der vorliegenden Arbeit berücksichtigte Interleukine. Für die Proteine und Gene wird das gleiche Symbol benutzt, für Gene in kursiver Schreibweise.

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Abb. 1: Schema zur Zytokinproduktion (modifiziert nach OSTERRIEDER und WOLF, 1998)

Pfeile kennzeichnen Differenzierung bzw. Aktivierung; Doppelpfeile (↔) weisen auf eine positive Feedback-Regulation hin; unterbrochene Pfeile verdeutlichen inhibitorische Wirkungsweisen. Th0-Zellen erkennen über den T-Zell-Rezeptor (TCR) das von den APC (Antigen-präsentierende Zellen) präsentierte Antigen und werden so aktiviert.

Durch Stimulation von IL-12 oder IL-4 differenzieren sich die aktivierten Th0-Zellen zu Th1- oder Th2-Zellen. Th1-Zellen aktivieren cytotoxische T-Zellen (CTL) durch Sezernierung von vor allem IL-2, IL-12 und IFN-γ. Die Th2-Subpopulation induziert über die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10 die Antikörperproduktion durch aktivierte B-Lymphozyten (B).

IL-4 IL-12

TCR

MHC-II

IL-2 IL-12 IFN-γ IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 APC

Immunglobulin- Produktion Th0

Th1 Th2

CTL B

Ziel- zelle

IL-4 IL-5 IL-6 IL-10

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Je nach Muster der Zytokinsekretion durch die Th-Zellen werden unterschiedliche Komponenten des Immunsystems aktiviert (Abb. 1). So fördern Th1-Zytokine die zellvermittelte Immunantwort, während Th2-Zytokine eine humorale (antikörpervermittelte) Antwort hervorrufen (ROMAGNANI, 1991, 2000; IBELGAUFT, 2003). Th1-Zellen und deren Zytokine schützen vor allem gegen intrazelluläre, (d. h.

insbesondere virale) Infektionen, während die Th2-vermittelte Immunantwort einen Schutz gegen extrazelluläre (bakterielle und parasitäre) Infektionen bieten (MOSMANN und COFFMAN, 1989; ROMAGNANI, 1991). Das Verhältnis von Th1:Th2-Zytokinen bestimmt, ob eine Immunantwort stärker zell- (Th1) oder humoralvermittelt (Th2) sein wird.

Bedeutung der Zytokine bei Infektion und Resistenzausprägung. In der frühen Phase einer Infektion führt die Interaktion zwischen Pathogen und Zellen der angeborenen Immunität (z.B. NK-Zellen) zur Induktion der entsprechenden Th1- oder Th2-spezifischen Zytokine, welche die Ausbildung einer protektiven Immunantwort dirigieren und so zu einer genetisch bedingten Resistenz bzw. Empfänglichkeit gegenüber Pathogenen führen (WILKIE und MALLARD, 2000). Die Differenzierung von T-Helfer-Vorläuferzellen (Th0) in Th1-Zellen wird durch IL-12 gefördert, das durch phagozytierende Zellen im frühen Stadium einer Infektion produziert wird (TRINCHIERI, 1995). Mäuse, die eine Th1-vermittelte Resistenz gegenüber Leishmania major aufweisen, werden daher für diese empfänglich, wenn die Gene für IL-12 an der Expression gehindert werden (SHER und COFFMAN, 1992; MATTNER et al., 1996).

Ebenso beruht die Empfänglichkeit bzw. Resistenz bei der Listeriose (Listeria monocytogenes) bei ingezüchteten Mäusen auf der Synthese von Th1- oder Th2- Zytokinen (TRINCHIERI, 1995). Auch die experimentell ausgelöste zerebrale Malaria bei Mäusen zeigt eine Verknüpfung von genetisch bedingter Empfänglichkeit und der Zytokinsynthese (KNIGHT et al., 1999). Das Niveau und der Typ der Zytokinproduktion scheint auch bei der Erholung des Organismus von Infektionen ein bedeutender Faktor zu sein (WOOD und SEOW, 1996; LUNNEY, 1998).

Bedeutung der Zytokine bei Immunsuppression. Neben den Th1- und Th2-Zellen existieren weitere zytokinproduzierende T-Zell-Untergruppen, die so genannten regulatorischen T-Zellen. Sie sind in der Lage, T-Zell-vermittelte Immunantworten zu unterdrücken. Auf diese Weise kontrollieren sie die Balance zwischen Th1- und Th2-

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vermittelten Immunantworten und verhindern pathogene Einflüsse aufgrund einer Überstimulation durch Th-Zellen sowohl bei infektiösen Erkrankungen als auch bei autoimmunen Prozessen.

Bei den regulatorischen T-Zellen unterscheidet man natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (nTreg), welche Zell-zu-Zell-Kontakte für ihre immunsuppressive Wirkung benötigen und induzierbare regulatorische T-Zellen (iTreg), die Immun- suppression vorwiegend durch zytokin-abhängige Mechanismen vermitteln (DAMOISEAUX, 2006).

Zu den induzierbaren regulatorischen T-Zellen gehören u. a. die TRI- und Th3-Zellen.

Sie werden durch ihre Zytokin-Sekretion unterschieden: TRI-Zellen sezernieren nach Induktion durch dendritische Zellen, Infektionen und anderen Treg-Zellen die immunsuppressiven Zytokine IL-10 und TGF-β. während die Th3-Zellen zusätzlich IL-4 freisetzen (JANEWAY et al., 2005). IL-10 unterdrückt die T-Zell-Proliferation und Zytokin-Produktion, bewirkt jedoch eine hohe Antikörper-Produktion durch Plasmazellen. Zusätzlich wirken IL-10 und TGF- β auf antigenpräsentierende Zellen (APCs) und dendritische Zellen. IL-10 beeinflusst die Differenzierung von dendritischen Zellen indem es die IL-12-Produktion verhindert. Damit wird die Aktivierung von T- Zellen durch dendritische Zellen gestört. Aktiviert werden diese TRI-Zellen durch IL-10 und IFN-α beim Menschen (LEVINGS et al., 2001).

Die nTreg-Zellen sind durch eine hohe Expression von CD25 und der Expression des Transkriptionsfaktors FOXP3 charakterisiert (FONTENOT et al., 2003). Die Entstehung dieser natürlichen regulatorischen T-Zellen erfordert neben der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und MHC-Molekülen im Stroma des Thymus auch IL-2 (BAYER et al., 2005).

Bedeutung der Zytokine beim Schwein. Hinsichtlich der Zytokinfunktion sowie -regulation ähneln sich die Säugerspezies, so dass die oben genannten Mechanismen auch beim Schwein wirksam sind. Beispielsweise sind auch beim Schwein Immunantworten beschrieben worden, die vorwiegend durch Th1 oder Th2 dominiert werden (ZUCKERMANN et al., 1998; FISCHER et al., 2000). Bei den folgenden

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Erkrankungen des Schweines wurde die Funktion der Zytokine bei der Immunabwehr nachgewiesen:

• Bei der hochkontagiösen Pneumonie des Schweines, hervorgerufen durch Actinoba- cillus pleuropneumoniae, unterscheiden sich gering und stark resistente Tiere durch den IL-1- und IL-6-Spiegel im Blut (BAARSCH et al., 1995). IL-6 wird durch mitogene Stimulation, Lipopolysaccharide von Bakterien und inflammatorische Zytokine induziert.

• Bei der Immunantwort nach Infektion mit dem Alpha-Herpesvirus der Aujezkyschen Erkrankung nehmen Zytokine eine entscheidende Funktion ein. Sowohl die humorale als auch die zellvermittelte Immunität sind an der Ausbildung einer protektiven Immunität gegenüber Herpesviren beteiligt, wobei die zellvermittelte Immunität wichtiger zu sein scheint (SCHMID und ROUSE, 1983, 1992; YORK und JOHNSON, 1993).

• ZUCKERMANN et al. (1998, 2000) konnten mit Vakzinierungsexperimenten beim Schwein für den Aujeszky-Impfstoff zeigen, dass der Schutz vor Erkrankungen stark an die Ausbildung einer zellvermittelten Immunantwort geknüpft ist, welche vor allem durch IFN-γ vermittelt wird. Eine zusätzliche Applikation von IL-12 verbessert durch die Verstärkung der zellvermittelten Immunität den Immunschutz.

• Die mit dem Schwein verwandten Spezies der Pinselohr- und Warzenschweine zeigen sich gegenüber dem Erreger der Afrikanischen Schweinepest vergleichs- weise resistent (OURA et al., 1998). Dies soll nach MARTINS et al. (1993) auf Zytokinfreisetzungen aus infizierten Makrophagen beruhen.

2.2 Beschreibung einiger Zytokine

Nachfolgend werden die Wirkungen von Zytokinen beschrieben, deren Gene in dieser Arbeit untersucht wurden.

2.2.1 Interleukin-2

Interleukin-2 (IL-2) ist ein stark immunregulatorisches Zytokin, welches von antigenaktivierten T-Lymphozyten produziert wird. Es wurde 1975 als

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wachstumsfördernder Faktor für knochenmarkstämmige T-Zellen identifiziert (MORGAN et al., 1976). Seine Funktion besteht in der Induktion von Wachstum und Differenzierung verschiedenartiger Zellen, insbesondere der T-, B- und NK-Zellen (THEZE et al., 1996), Lymphokin-aktivierten Killerzellen (GRIMM et al., 1982), Monozyten, Makrophagen (MOSMANN und COFFMAN, 1989) und Oligodendrozyten.

Die biologischen Effekte des IL-2 werden durch spezifische Rezeptoren (IL-2- Rezeptoren), die sich auf den Oberflächen der Zielzellen befinden, vermittelt.

Durch IL-2-Stimulation gelangen T-Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus (STERN und SMITH, 1986). IL-2 wird von CD4+ T-Zellen und in geringerem Ausmaß auch von CD8+ T-Zellen produziert (FITCH et al., 1995). Die wichtigsten IL-2-Effekte sind nach ABBAS und LICHTMAN (2001) die Wirkungen auf Lymphozyten:

• IL-2 ist der wichtigste autokrine Wachstumsfaktor für T-Lymphozyten. Die Menge des synthetisierten IL-2 bestimmt die Intensität der T-Zell-abhängigen Immunabwehrmechanismen.

• IL-2 stimuliert außerdem die Synthese anderer T-Zell-stämmiger Zytokine, wie z.B.

IFN-γ.

• IL-2 stimuliert das Wachstum von NK-Zellen und verstärkt deren cytolytische Funktion (O’GARRA et al., 1988). IL-2 induziert zusammen mit IL-12 die IFN-γ- Synthese durch NK-Zellen.

• IL-2 wirkt als Wachstumsfaktor auf B-Zellen und induziert deren Antikörper- Synthese.

• Die Anzahl der Memory-T-Zellen wird durch das IL-2:IL-15-Verhältnis kontrolliert.

Das porcine IL-2-Molekül weist in der Aminosäuresequenz eine hohe Homologie (ca.

80 %) zu den entsprechenden Molekülen anderer Säugerspezies auf (BAZAN et al., 1992).

2.2.2 Interleukin-6

Interleukin-6 (IL-6) wird vor allem von mitogenstimulierten Lymphozyten sowie von mononukleären Phagozyten produziert (SCAMURRA et al., 1996). Es ist hauptsächlich

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an der finalen Reifung der B-Zellen in antikörperproduzierende Zellen (HIRANO et al., 1986; HIRANO et al., 1987) sowie an der Stimulation von T-Zell-Wachstum und -Diffe- renzierung beteiligt (GARMAN et al., 1987; TAKAI et al., 1988). Die IL-6-Synthese wird durch bakterielle Endotoxine, virale Infektionen und andere Zytokine stimuliert. IL-6 beeinflusst die antigenspezifische Immunantwort sowie Entzündungsreaktionen.

Eine veränderte IL-6-Produktion ist daher an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen beteiligt. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass beim Menschen hohe IL-6-Titer assoziiert mit multiplem Myelom und Kaposi-Sarkom auftreten (BIDWELL et al., 1999, 2001; HAUKIM et al., 2002). Außerdem wird IL-6 mit der systemischen juvenilen Arthritis, der rheumatoiden Arhritis, Osteoporose und Psoriasis in Verbindung gebracht.

Das porcine IL-6-Protein weist eine Homologie von 61 % und 43 % zu IL-6 des Menschen bzw. der Maus auf (MATHIALAGAN et al., 1992).

2.2.3 Interleukin-12

Interleukin-12 (IL-12) ist das Produkt aktivierter Makrophagen, dendritischer Zellen und B-Lymphozyten (TRINCHIERI, 1993; HENDERSON et al., 1998). Es setzt sich aus einer 35-kDa- und einer 40-kDa-Untereinheit zusammen, welche von verschiedenen Genen (IL-12A, IL-12B) codiert werden (GUBLER et al., 1991; QUESNIAUX, 1992). Die IL-12-Produktion wird von Bakterien, bakteriellen Produkten, Parasiten, intrazellulären Pathogenen und IFN-γ induziert (HSIEH et al., 1993; TRINCHIERI und GEROSA, 1996;

HESSLE et al., 2000). IL-12 ist für die Differenzierung der Th1-Zellen und damit der zellvermittelten Immunität gegen Pathogene von entscheidender Bedeutung (HSIEH et al., 1993). Wegen seiner Effekte auf NK-Zellen und T-Zellen ist IL-12 ein bedeutender Regulator der zellvermittelten Immunantwort gegenüber intrazellulären Pathogenen (SYPEK et al., 1993; FINKELMAN et al., 1994). Die Zellproliferation und Zytotoxität der NK-Zellen und T-Zellen wird gesteigert, und sie werden zur Transkription von IFN-γ stimuliert (QUESNIAUX, 1992; GEROSA et al., 1996; TRINCHIERI 1997). IL-12 stimuliert die Differenzierung von CD8+ T-Zellen in reife, funktionell aktive CTLs (QUESNIAUX, 1992).

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2.2.4 Interferon-γ

Interferon-γ (IFN-γ) nimmt eine zentrale Stellung bei der Regulation der Immunantwort ein (TRINCHIERI und PERUSSIA, 1985) und ist eines der wichtigsten Modulatoren der Makrophagenaktivität (BALKIWILL und BURKE, 1989). Es ist ein Hauptvermittler der immunstimulierenden Effekte der Adjuvantien von Impfstoffen (ODEAN et al., 1990) und beeinflusst den von B-Zellen durch Switch produzierten Immunglobulin-Isotyp (FINKELMAN et al., 1988). IFN-γ stimuliert die Antikörpersynthese (VERCELLI et al., 1989) sowie die Aktivität der NK-Zellen, Makrophagen und Neutrophilen Zellen (BIELEFELDT OHMAN et al., 1987). Es verstärkt die IL-12B-Transkription in aktivierten Makrophagen und verbessert die Bindung von NFκB-verwandten Faktoren an den Promotor des IL-12B-Gens (MURPHY et al., 1995). IFN-γ stimuliert zudem die Differenzierung von Th1-Zellen aus den Th0-Vorläuferzellen (siehe Abb. 1, S. 14).

IFN-γ erhöht die Expression der Klasse-I-MHC-Moleküle und aktiviert die Expression von Klasse-II-MHC-Molekülen in verschiedenen Zelltypen (BOEHM et al., 1997). So potenziert IFN-γ die kognitive Phase der Immunantwort, indem es Klasse-II-restriktive CD4+ T-Helfer-Zellen aktiviert. IFN-γ kann sowohl die zelluläre als auch die humorale Immunantwort verstärken. Es wirkt direkt auf T- und B-Lymphozyten und bewirkt deren Differenzierung. Außerdem wird die cytolytische Aktivität der NK-Zellen stimuliert. IFN-γ aktiviert Endothelzellen; es fördert die Adhäsion und die morphologische Änderung der CD4+ T-Zellen für ihre Wanderung aus den Blutgefäßen zum Ort der geweblichen Infektion.

IFN-γ wird von Th0- und Th1-Zellen und von nahezu allen cytotoxischen CD8+ T-Zellen produziert. Die Transkription erfolgt direkt als Konsequenz der Antigenaktivierung und wird durch IL-2 und IL-12 verstärkt. IFN-γ wird auch von NK-Zellen produziert. In diesem Zusammenhang ist IFN-γ ein Effektor der angeborenen Immunität.

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2.3 Aufbau und chromosomale Lokalisation der Zytokin-codierenden Gene

Die Zytokin-codierenden Gene weisen bei den verschiedenen Säugerspezies strukturelle Ähnlichkeiten auf. Wie auch bei anderen Genen ist diese Homologie entweder auf funktionelle Bedeutung zurückzuführen oder aus der phylogenetischen Verwandtschaft zu erklären.

In ihrer überwiegenden Zahl sind jeweils mehrere der Zytokin-codierenden Gene in relativ kleinen Chromosomenabschnitten lokalisiert. Dies wird mit Duplikationen von Vorläufergenen erklärt. Allerdings haben einige der Loci unterschiedliche Genstrukturen, so dass eine Entstehung aus verschiedenen Vorläufer-Genen angenommen wird. Beispielsweise liegt ein Zytokin-Gen-Cluster auf dem humanen Chromosom 4q12-21. Bisher wurden hier zehn Zytokin-Gene identifiziert, darunter IL-2 und IL-8; ein weiteres Cluster liegt im Chromosom 17q21 (TUNNACLIFFE et al., 1992;

LEE und FARBER, 1996; Map Viewer, URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/

static/MVstart.html, 2005).

Es wird angenommen, dass das Produkt des duplizierten und nachfolgend mutierten Gens die Fähigkeit gewinnt, an andere Bindungsproteine anzudocken. Wenn dies der Fall ist und sich als evolutionär nützlich erweist, bewirkt der einsetzende Selektionsprozess eine Veränderung im Zytokin-codierenden Gen und Rezeptorgen.

Hierdurch wird das Zytokin-codierende Gen im Bereich, der die Bindungsstelle codiert, angepasst, so dass dieser Bereich eine sekundäre Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Rezeptorgen annimmt. Beispielsweise fanden ZELUS et al. (2000) bei den Wiederkäuern eine hohe Rate an nicht-synonymen Substitutionen, was sie mit einer positiven Selektion erklärten. Auch ZHANG und NEI (2000) konnten durch Vergleich der IL-2-Sequenz bei 15 Säugerspezies eine rasche Evolution des IL-2-Gens feststellen mit einer ebenfalls hohen Rate nicht-synonymer Substitutionen.

In den Promotorbereichen der T-Zell exprimerten Zytokin-Gene IL-2, IL-4, IL-5 und IL-13 wurde von STAYNOV et al. (1995) beim Menschen ein konserviertes Motiv gefunden, welches die Konsensussequenz CTTGG...CCAAG enthält und Bestandteil palindromischer Sequenzen von Zytokin-Genen sein soll. Dieses Element weist einen

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starken regulatorischen Effekt auf und ist eventuell für die koordinierte Expression der betreffenden Zytokin-codierenden Gene verantwortlich.

Beim Schwein sind über 30 Zytokine auf Proteinebene bekannt. Nur für einige der codierenden Gene gibt es Informationen über die chromosomale Lokalisation. Eine Auswahl wichtiger Interleukin- und Interferon-Gene und deren chromosomale Positionen sind in Tab. 2 wiedergegeben.

Tab. 2: Wichtige Porcine Zytokin-Gene Zytokin-Gen Symbol Position

Cytogenetisch ¹) cM ²) Referenz

Interleukin-1α IL-1α 3q1.2-1.3 3,7 KRULL et al. (1992);

MELLINK et al. (1994);

JOHANSSON et al. (1994) Interleukin-1β IL-1β 3q1.1-1.4 3,2 KRULL et al. (1992)

Interleukin-2 IL-2 8 8,7 ELLEGREN et al. (1993);

BAARSCH et al. (1995)

Interleukin-4 IL-4 2 - RETTENBERGER et al.

(1996) Interleukin-6 IL-6 9 q1.4-q1.5

9q1.2-q2.1

- RETTENBERGER et al.

(1996); BRUCH et al. (1996);

LAHBIB-MANSAIS et al.

(1999)

BURK et al. (1997) Interleukin-7 IL-7 4q1.1-q1.3 - UENISHI et al. (2001) Interleukin-21 IL-21 8q2.2-q2.3 - MUNETA et al. (2004) Interferon-α IFN-α 1q2.5-q2.6prox. 1,9 SARMIENTO et al.(1993) Interferon-β IFN-β 1q2.5-q2.6 - LEE et al. (2001)

Interferon-γ IFN-γ 5p1.2-q1.1 5,3 YERLE et al. (1986);

SARMIENTO et al. (1993);

JOHANSSON et al. (1993)

1) Die erste Zahl verweist auf die Chromosomennummer; p und q bezeichnen die Chromosomenarme und die nachgestellten Zahlen die Chromosomenbanden.

2) -: Keine Angaben.

(23)

2.4 Regulation der Zytokin-Gene

Die 5´-flankierenden Regionen der Zytokin-Gene enthalten mehrere DNA-Motive für die Bindung von Transkriptionsfaktoren, die entweder verstärkend oder hemmend auf die Expression wirken können. In Bezug auf die Zytokin-Gene gibt Tab. 3 (S. 25ff.) einen Überblick zu den Transkriptionsfaktoren und deren Bindungsstellen in der DNA, den Response-Elementen.

Unterschiede in der Zytokin-Expression hängen von genetischen Einflüssen ab, die mit DNA-Varianten in den 5’-flankierenden Regionen in Verbindung gebracht werden können. Beispielsweise wurden funktionelle Polymorphismen (SNPs oder variable Anzahl von Dinukleotidrepeats) in den regulatorischen Regionen der Loci IL-2, IL-6, IL- 10 und TNF-α nachgewiesen (DASER, 1996). Diese DNA-Varianten können eine unterschiedlich effektive Transkriptionsfaktorbindung bewirken (KEEN, 2002), so dass die Fähigkeit von Zytokin-exprimierenden Zellen, auf einen Stimulus mit einer unterschiedlichen Produktion von Zytokinen zu reagieren, genetisch determiniert ist.

Eine unterschiedliche Expression der Zytokin-Gene kann zu einer veränderten Immunantwort nach Infektion führen, etwa durch Beeinflussung des Th1:Th2- Verhältnisses.

Beim Menschen liegt der Schwerpunkt der Untersuchungen zur Zytokin-Genetik im Bereich der Autoimmunerkrankungen, während beim Tier insbesondere Infektionskrankheiten betrachtet werden (DUFF, 1994). Zahlreiche Untersuchungen haben ergeben, dass Polymorphismen in den Kontrollelementen bestimmter Zytokin- Gene eine Rolle bei der Empfänglichkeit gegenüber Infektionen spielen. Beispiele hierfür sind:

• Ein SNP im 5´-Bereich des TNF-α führte nach KNIGHT et al. (1999) zu einer veränderten Bindung des Transkriptionsfaktors Oct1 und damit zu einer veränderten Expression des Gens in humanen Monozyten. Eine Variante, die bei ca. 5 % der Afrikaner vorgefunden wurde, ist mit einer 4-fach erhöhten Empfänglichkeit für die schwere Verlaufsform der Malaria assoziiert.

• Von der bovinen Herpesvirus-Infektion (BHV-1; Infektiöse bovine Rhinotracheitis, IBR) ist bekannt, dass Typ-1-Interferone das Ausmaß der Erkrankung beeinflussen

(24)

(RYAN et al., 1993; RYAN und WOMACK, 1997). Diese Gene (IFN-α, IFN-β, IFN-ω) sind auf dem Rinder-Chromosom 8 lokalisiert. RFLPs in diesen Genen standen in Beziehung mit der Ausprägung einer schweren klinischen Erkrankung oder konnten mit einer milden Verlaufsform der IBR in Verbindung gebracht werden.

• CRAWFORD und McEWEN (1998) identifizierten 36 SNPs und InDels innerhalb des ovinen IFN-γ-Gens. Die Varianten zeigten eine starke Assoziation mit der Resistenz gegenüber gastrointestinalen Nematoden. Dies lässt sich erklären, da, wie auf S. 20 beschrieben ist, IFN-γ eine Th1-geprägte Immunantwort reguliert und die Produktion der Th2-Zellen inhibiert (WAKELIN, 1996).

• Eine Deletion im IL-12B-Gen führte im homozygoten Zustand bei einem Kind zu einer Infektion mit Salmonella enteritidis und einer generalisierten Infektion mit einem ansonsten für den Menschen schwach pathogenen Mycobakterium (ALTARE et al., 1998).

• In einigen Untersuchungen zur Heritabilität von Krankheitsresistenzmerkmalen beim Schwein wurde u. a. die Zytokin-Expression (IL-2, IFN-γ) nach Stimulation als Parameter der Immunantwort gemessen. Dabei wurde eine genetisch bedingte Determination der IL-2- sowie der IFN-γ-Expression festgestellt (EDFORS-LILJA et al., 1994; 1998).

2.5 Beschreibung der untersuchten Zytokin-codierenden Gene

Die genomischen Sequenzen der porcinen Zytokin-Gene sind bislang kaum untersucht worden. Meistens gibt es lediglich Kenntnisse über die mRNA-Sequenzen. Da die Struktur der einzelnen Zytokin-Gene zwischen den Säugerspezies konserviert ist, werden auch Untersuchungen der entsprechenden humanen und murinen Genen herangezogen.

(25)

Tab. 3: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente für Zytokin-Gene

Transkriptionsfaktor Response-Element

Name Synonyme Bezeichnungen

(Beispiele)

Name ¹) Konsensussequenz ²) (5’ - 3’)

Referenz AP1 (Activator protein

1)

c-jun/ v-jun TRE-BP (TPA response element binding protein)

TRE TGASTCA

TGASTCAG

SwissProt P05412;

DE GROOT et al. (1991) LOCKER (1996)

AP2 (Activator protein 2)

AP2-alpha; Activating enhancer- binding protein 2 alpha

- GCCNNNGGC

GSSWGSCC

SwissProt P05549 LOCKER (1996) ATF1 (Activating

transcription factor 1) Cyclic-AMP-dependent transcription

factor-1 CRE GTGACGTMR

TGACGTCA

SwissProt P18846 LOCKER (1996) CD28 (Cluster of

differentiation 28)

T-cell-specific surface glycoprotein CD28

CD28RE RGARNTTCC SwissProt P10747;

FRASER et al. (1991);

WARD et al. (1998) CEBPA (CCAAT-

enhancer binding protein alpha)

C/EBP alpha

CCAAT Box TKNNGNAAK ATTGCGCAAT

SwissProt P49715 LOCKER (1996) LATCHMAN (1998) CEBPB (CCAAT-

enhancer binding protein beta)

C/EBP beta; nuclear factor NF-IL6 CCAAT Box (IL-1 RE im

IL-6-Gen)

TKNNGNAAK SwissProt P17676

LATCHMAN (1998) CRE-BP1 (cAMP

response element binding protein 1)

ATF2 (activating transcription factor 2); Cyclic-AMP-dependent

transcription factor-2

CRE GTGACGTMR SwissProt P15336

Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(26)

Tab. 3: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente für Zytokin-Gene (Forts.)

(Beispiele)

Referenz

CREB (cAMP response element binding protein)

CREBP CRE TGACG SHORT et al. (1994)

c-Rel Rel/ NFκB-Genfamilie NFκB Site GGAAATCCCA

BGGRWAACC

NASCHBERGER et al.

(2004)

JASPAR DATABASE (2005)

E4BP4 bZIP domain; transcriptional repressor

- GTAAY

TTAYRTAAB

HAAS et al. (1995) NEWMAN und KEATING (2003) JASPAR Database (2005)

ETS-2 (v-ets avian erythroblastosis virus E2 oncogene

homolog 2)

C-ets-2 protein EBS CAGGAAAGC

GGAW

RCCGGAWGY

SwissProt P15036;

NAKAJIMA et al. (1993);

HOLLENHORST et al.

(2004)

LOCKER (1996) GATA-1 (GATA

binding protein 1)

Globin transcription factor 1 GATA Site WGATAR SwissProt P15976 LOCKER (1996) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(27)

(Beispiele)

Referenz

GATA-3 (GATA binding protein 3)

Trans-acting T-cell specific transcription factor GATA-3

GATA Site AGATAG SwissProt P23771

GMCSF (Granulocyte-

macrophage colony- stimulating factor)

CSF (colony-stimulating factor) CCAT-Box CCAT SwissProt P04141;

ESGCP (2002)

GR (Glucocorticoid-

Receptor) GRE (MRE/

PRE/ ARE) AGAACANNNTGTTCT GGTACANNNTGTTCT

LI und WRANGE (1993) LOCKER (1996)

ICSBP (IFN

consensus sequence binding protein)

IRF-8 (Interferon regulatory factor 8) ICS (IFN consensus sequence)

TGCTTTCACTTCT SwissProt Q02556;

KIM et al. (2000);

TAMURA et al. (2003)

IKRS-1 (Ikaros 1) LYF-1 - GGGAAGGGAT

GGGA GGGAAW

HU et al. (2001) GEORGOPOULOS (2002)

LOCKER (1996) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(28)

Tab. 3: Berücksichtigte Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente für Zytokin-Gene (Forts.)

(Beispiele)

Referenz IRF-1 (Interferon

regulatory factor 1)

ISRE (IRF-E;

pIRE) ICS

TTCNNGGAA

GGGGAAGTAC GAAA(A)SYGAAASY

SwissProt P10914;

TANIOKA et al. (2005);

KANNO et al. (1993);

LOCKER (1996) IRF-3 (Interferon

regulatory factor 3)

ISRE GAAANNGAAANN SwissProt Q92985

LIN et al. (2000) IRF-7 (Interferon

regulatory factor 7) ISRE GAAANNGAAANN SwissProt Q14653

NF-1 (Nuclear factor 1)

CTF NF-1 Binding

Site

TGGNNNNNNNGCCAA TGGA/C(N)5GCCAA

LOCKER (1996) BLOMQUIST et al.

(1999)

NFκB Rel/ NFκB-Genfamilie NFκB Site GGGRHTYYCC

GGGACTTTCC

LOCKER (1996) NFκB (p65) (Nuclear

factor kappa B p65) Rel A; 65 kDa Protein; Rel/ NFκB-

Genfamilie NFκB Site GGGRNNYYCC

BGGRNTTTCC

MARTONE et al. (2003) JASPAR DATABASE (2005)

NFκB (p50) (Nuclear

factor kappa B p105) NFκB1, p105 precursor NFκB-Binding Site

GGRNNYYCC GGGACTTTCC

SwissProt P19838;

IBELGAUFT (2003) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(29)

Name Synonyme Bezeichnungen (Beispiele)

Referenz

NFκB (p52) (Nuclear factor kappa B p100)

NFκB2, p100 precursor NFκB-Binding Site

NFAT1 (Nuclear factor of activated T cells)

NFAC2; NFAT pre-existing subunit;

NF-ATp

NFAT Site GGAAAA

GAGGA

SwissProt Q13469;

RIEGEL et al. (1992) ; ROONEY et al. (1995) NFIL-2A, -2B, -2C, -

2D, -2E (Nuclear factors interleukin 2A, 2B, 2C, 2D, 2E)

- Bezeichnung nach

Footprints; Sequenzangaben für längere Bereiche

RIEGEL et al. (1992)

NFIL-6 (Nuclear factor interleukin 6)

C/EBP beta; transcription factor 5;

CEBPB

IL6RE (IL-1 response element in the IL-6 gene) CCAAT Box

TKNNGNAAK CTGGGA ATTGCGCAAT

SwissProt P17676 IBELGAUFT (2003) LATCHMAN (1998) Oct1 (octamer-

binding transcription factor 1)

OTF-1; NF-A1; POU domain, class 2, transcription factor 1

Octamer motif;

Octa-Box

ATTTGCAT ATGTAGAT ATGCAAAT

SwissProt P14859 HOVDE et al. (2002) LOCKER (1996) Oct6 (octamer-

binding transcription factor 6)

POU-domain transcription factor SCIP, POU domain, class 3, transcription factor 1

Octamer motif;

Octa-Box

ATTTGCAT ATGCAAAT

SwissProt Q 03052 LOCKER (1996) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(30)

(Beispiele)

Referenz PAX5 transcription

factor BSAP (B-cell- specific activator protein)

Pax-5 gene codes for the

transcription factor BSAP, Paired box protein

PAX5 Site RGCATSAWGCGKRMM

RNKMANBSNWGNRKRMM

LOCKER (1996) CZERNY und

BUSSLINGER (1995) Pu.1 (Transcription

factor PU.1)

31 kDa transforming protein Pu-Box GAGGAA SwissProt P17947;

PIO et al. (1995);

KLEMZS et al. (1990) RORA1 (Retinoic

acid-receptor-related orphan receptor a subunit)

RZR alpha; RAR related orphan receptor alpha; RZRA Retinoic acid binding receptor alpha

HRE WWAWBTAGGTCA SwissProt P35398;

JIN et al. (2001)

RREB1 (RAS- responsive element binding protein 1)

- Ras-responsive

element

CCCAAAHCACCCC SwissProt Q92766 PEREZ-GOMEZ et al.

(2003)

JASPAR DATABASE (2005)

SATB (Special AT- rich sequence Binding protein 1)

- MAR (WC) > 5 LOCKER (1996)

BOULIKAS (1993) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(31)

(Beispiele)

Referenz

SP-1 (Specific protein 1)

GC-box binding protein;

TGGGC-binding factor

GC-Box KGGGCGGRRY

TGGGC GGGCGG

CHRISTENSEN et al.

(1993)

NAGAOKA et al. (2001) STAT1 (Signal

transducer and activator of transcription 1)

ISGF-3 (components p91/p84) IFN-γ activation site (GAS) ISRE

TTNCNNNAA LOCKER (1996)

SwissProt P 42224

STAT4 (Signal transducer and activator of transcription 4)

- IFN-γ activation

site (GAS)

WTTCCSGGAAW TTNCNNNAA

SwissProt Q14765;

YAMAMOTO et al.

(1997)

LOCKER (1996) STAT5 (Signal

transducer and activator of transcription 5)

Mammary Gland Factor IFN-γ activation site (GAS)

TTNCNNNAA LOCKER (1996)

SwissProt P4229

STAT6 (Signal transducer and activator of transcription 6)

IL-4 Stat IFN-γ activation

site (GAS) TTNNN(N)GCT TTNCNNNAA

SwissProt P42226;

iHOP (2005) LOCKER (1996) Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(32)

(Beispiele)

Referenz

T-bet (T box

expressed in T cells)

Tbx-21; T-box transcription factor TBX21

T-Box GTGT SwissProt Q9UL17;

HATTON und WEAVER (2003)

TONG et al. (2005) TBP (TATA-box

binding protein)

TATA-box factor; TATA binding factor; TATA sequence-binding protein

TATA-Box TATAAAA

TATAWAW

SwissProt P20226

TCF11 (Transcription factor 11)

NF-E2 related factor 1; NRF1 - ATGAC SwissProt Q14494

TIEG1 (Transforming growth factor-beta- inducible early growth response protein 1 )

KLF10 (Krueppel-like factor 10) - GGTGTG SwissProt Q13118

TIEG2 (Transforming growth factor-beta- inducible early growth response protein 2)

KLF11 (Krueppel-like factor 11), EKLF (erythroid Krueppel-like factor)

CACCC-Box CACCC PERKINS et al. (1995)

Fußnoten am Ende der Tabelle, S. 33.

(33)

(Beispiele)

Referenz

YY-1 (Yin Yang 1) Transcriptional repressor protein YY1;

delta transcription factor NF-E1

PRE* (polycomb group response element)

YY1 Site

CCATNTT CNGCCATC

SwissProt P25490;

SATIJN et al. (2001) LOCKER (1996)

1) ARE: Androgen Response Element; CRE: cAMP Response Element; EBS: Ets-binding site; GAS: Gamma-Activating Site; GRE:

Glucocorticoid-Receptor Response Element; HRE: Hormon-Response-Element; ICS: IFN Consensus Sequence; IRF-E: IRF- Element; ISRE: Interferon Stimulated Response Element; MAR: Matrix associating region; MRE: Mineralocorticoid Response Element; pIRE: palindromic IRF-1-Response-Element; PRE: Progesterone Response Element; PRE*: Polycomb Group Response Element; Pu-Box: Purin-reiche Sequenz; RRE: Ras Response Element; TRE: TPA Response Element.

2) R: Purin (A oder G); Y: Pyrimidin (T oder C); W: A oder T; S: G oder C; M: A oder C; K: G oder T; H: A, T oder C (not-G); B: G, C oder T (not-A); V: G, A oder C (not-T); D: G, A oder T (not-C); N: G, A, T oder C.

SwissProt (BOECKMANN et al., 2003; URL: http://www.expasy.org/sprot/ und http://www.ebi.ac.uk/swissprot/).

IHOP (HOFFMANN und VALENCIA, 2005; URL: http://pdg.cnb.uam.es/UniPub/iHOP/).

(34)

2.5.1 Interleukin-2-Gen (IL-2)

Genomische Struktur und Genprodukte

Das IL-2 des Schweins wurde auf Chromosom 8 lokalisiert (ELLEGREN et al., 1993).

Der sequenzierte Bereich der porcinen mRNA umfasst 573 bp (GOODALL et al., 1991) bzw. 526 bp (LEFEVRE, 1991). Die CDS enthält 465 bp, und das reife Peptid wird nach Abspaltung der Signalsequenz von einer 405-bp-Sequenz translatiert. Für die genomische Sequenz des IL-2 beschrieben IWATA et al. (2000) 4921 bp mit codierenden Abschnitten von 147 bp (Exon 1), 60 bp (Exon 2), 147 bp (Exon 3) und 111 bp (Exon 4). Das porcine IL-2 (Abb. 2) umfasst demzufolge vier Exons und drei Introns und weist damit eine strukturelle Ähnlichkeit zu dem IL-2 anderer Säugerspezies auf.

Abb. 2: Genomische Struktur des porcinen IL-2-Gens (nach Daten von IWATA et al., 2000; Genbank Acc.No. AB041935)

Schwarze Rechtecke stellen die CDS (codierende Sequenz) der Exons 1 bis 4 dar. Die Angaben der Basenpaare beziehen sich auf die Exons und Introns. Für Exon 1 und 4 werden nur die CDS dargestellt.

Beim Menschen ist die genomische Struktur des IL-2 eingehend bekannt. So sequenzierten FUJITA et al. (1983) und HOLBROOK et al. (1984) 5561 bp des humanen IL-2. Das erste Exon umfasst 200 bp, wovon – wie bei der Transkription des porcinen IL-2 – 147 bp als CDS dienen. Ähnlich verhält es sich beim humanen Exon 4:

Es umspannt einen Bereich von 394 bp, wovon - wie beim Schwein - 111 bp als codierende Sequenz zur Verfügung stehen.

111 147

147

5’ 3’

60

89 2252 1787 bp

bp

(35)

Für das porcine IL-2-Protein fanden GOODALL et al. (1991) eine 72 %ige Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins von Mensch und Schaf. Das porcine IL-2- Protein weist eine Kreuzreaktivität im Hinblick auf die Induktion des T-Zell-Wachstums zum humanen IL-2-Protein auf. Dies könnte nach GOODALL et al. (1991) an der Ähnlichkeit des porcinen IL-2-Moleküls im Bereich der Kontaktstellen mit dem IL-2- Rezeptor liegen. Beim Menschen werden diese Kontaktstellen von den Aminosäuren 11 bis 20 für die p75IL-2-Rezeptor-Untereinheit und von den Aminosäuren 33 bis 56 für die p55-Untereinheit gebildet (JU et al., 1987; COLLINS et al., 1988). Die entsprechenden Kontaktstellen finden sich nach GOODALL et al. (1991) beim porcinen IL-2 an den gleichen Positionen. Hierfür zeigt Abb. 3 die Aminosäuresequenzen sowie die zugrunde liegenden codierenden Nukleotidabfolgen.

31 60

Sequenz AAG AAA CAA CTG GAG CCA TTG CTG CTG GAT

Aminosäure K K Q L E P L L L D

97

Sequenz AAT GCA GAT CTC TCC AGG ATG CTC ACA TTT AAA TTT

Aminosäure N A D L S R M L T F K F

168

Sequenz TAC ATG CCC AAG CAG GCT ACA GAA TTG AAA CAC CTT

Aminosäure Y M P K Q A T E L K H L

Abb. 3: Nukleotid- und Aminosäureabfolgen in Bereichen der Kontaktstellen des Proteins mit den Rezeptoruntereinheiten p75 (oben, 31 bis 60 bp) und p55 (Mitte und unten, 97 bis 168 bp)

Oberhalb der Sequenz ist jeweils die Position des Nukleotids in der cDNA wiedergegeben (Referenzsequenz: Genbank Acc.No. X56750). A: Alanin; D: Aspartat;

E: Glutamat; F: Phenylalanin; H: Histidin; K: Lysin; L: Leucin; M: Methionin; N:

Asparagin; P: Prolin; Q: Glutamin, R: Arginin; S: Serin; T: Threonin; Y: Tyrosin.

Transkription und Regulation

Die 5’-flankierende Region des IL-2 enthält Bindungsstellen insbesondere für die Transkriptionsfaktoren NFAT1, NFκB, AP1 und Oct1. Die Regulation der IL-2- Expression erfolgt primär auf Transkriptionsebene (RIEGEL et al., 1992). Stimuli an den Oberflächen der T-Zellen führen zur Aktivierung ubiquitärer und gewebespezifischer Transkriptionsfaktoren. Diese Faktoren interagieren mit Sequenz-Elementen in einem Bereich bis ca. -300 bp (FUJITA et al., 1986; DURAND, 1988) und kontrollieren

(36)

gemeinsam eine fein regulierte Transkription. Durch Deletions-, EMSA- und Footprint- Studien wurden in dieser Region fünf sequenzspezifische DNA/Protein-Komplexe identifiziert. Die Bindungssequenz für NFAT1 ist Purin-reich. RIEGEL et al. (1992) unterschieden bei Deletionsstudien die in Abb. 4 gezeigten Elemente, von denen die tsp-nahen Elemente NFIL-2A und –2B eine drastisch reduzierte Transkription bewirkten. Auch die Deletion der Elemente NFIL-2D und -2E führte jedoch zu einem Rückgang der Transkription. In Tab. 4 sind die Transkriptionsfaktoren und Response- Elemente für den 5’-Bereich von IL-2 aufgeführt.

Abb. 4: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente im 5’-Bereich des IL-2 (modifiziert nach RIEGEL et al., 1992; Referenzsequenz: Genbank Acc.No.

X00695)

Dargestellt ist der Bereich von –287 bis –72 bp relativ zum tsp. Schwarze Rechtecke stellen Proteinbindungsstellen (Response-Elemente) dar. Zu den Abkürzungen siehe Tab. 3, S. 25ff. Die in der letzten Zeile aufgeführten Elemente NFIL-2E bis -2A werden in Tab. 3 als Bereiche für DNA-bindende Proteine definiert; sie beziehen sich jedoch auf Deletionsstudien von RIEGEL et al. (1992) und werden im Text erklärt.

DNA-Varianten und deren Wirkung auf Merkmalswerte

In Tab. 5 (S. 38) werden Assoziationen zwischen einigen der IL-2-Allele und Merkmalswerten dargestellt. Diese Angaben betreffen den Menschen. Mit Hilfe der In- situ-Fluoreszenz-Hybridisierung und der Single-Cell-PCR bei Zellen mit verschiedenen IL-2-Allelen demonstrierten HOLLÄNDER et al. (1998), dass die IL-2-Expression in ausgereiften Thymozyten und T-Zellen nicht erkennbar von den Allelen beeinflusst wird.

NFAT1 Pu-Box

AP1

TRE

CD28

CD28RE

NFκB1 Oct1

Octa-Box TRE

AP1 NFAT1

Pu-Box

-72 bp

5’ 3’

NFIL-2E NFIL-2D NFIL-2C NFIL-2B NFIL-2A

-287

Oct1 Octa-Box

(37)

Tab. 4: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der 5’-flankierenden Region des IL-2 von Mensch und Maus (nach RIEGEL et al., 1992 und WARD et al., 1998)

Response-Element Trans-

kriptions-

faktor ¹) Position (bp)²) Gefundene Sequenz³) Konsensus- sequenz ⁴) NFAT1 H: -287 bis -277

M: -288 bis -278

Pu-Box: AAGGAGGAAAAA AAGGAGGAAAAT

AGGAA Oct1 H: -254 bis -247

M: -250 bis -257 ATGCAATT (-)

ATACAATG (-) ATGCAAAT

SP-1 H: -222 bis -218 M: -224 bis -220

TGGGC TGGGC

TGGGC NFκB ⁴) H: -204 bis -195

M: -207 bis -198

GGGATTTCAC GGGATTTCAC

GGGAATCTCCC/

GGGACTTTCC AP1 H: -185 bis -179

M: -187 bis -198 TRE-like: TCAGTCA

TCAGTCA TRE:TGACTCA - H: -174 bis -170

M: -176 bis -172

TTGGG ATGGG

ATGG CD28 H: -164 bis -154

M: -166 bis -156 CD28RE: AAAGAAATTCC

AAAGAAATTCC RGARNTTCC AP1 H: -151 bis -145

M: -154 bis -146

TRE-like: AGAGTCA AGAGTCA

TRE:TGACTCA NFAT1 H: -130 bis -140

M: -143 bis -133

AAGAGGAAAAA AAGAGGAAAAA

AGGAA Oct1 H: -72 bis -79

M: -86 bis -73 ATGTAAAA ATGTAAAA

ATGCAAAT EKLF H: -60 bis -65

M: -60 bis -65

CACCC CACCC

CACCC TBP H: -57 bis -50

M: -57 bis -50 TATTATT

TATTATT TATAAA

TBP H: -28 bis -33 M: -28 bis -33

TATAAA TATAAA

TATAAA

1) Zu den Abkürzungen der Transkriptionsfaktoren und Response-Elementen siehe Tab. 3, S. 25ff.

-: Es wurde keine Bezeichnung für den Transkriptionsfaktor angegeben.

2) H: Human; M: Maus. Referenzsequenzen: Genbank Acc.No. X00695 (Mensch) und X01663 (Maus).

3) (-): Gegenstrang (Antisense-Strang).

4) Es werden die von den Autoren gefundenen Konsensussequenzen genannt.

Weitere Sequenzen siehe Tab. 3, S. 25ff.

(38)

Tab. 5: Assoziationen zwischen IL-2-Allelen und Merkmalswerten beim Menschen DNA-Variante Position

(bp)

Wirkung auf Merkmalswerte

Literatur SNP (T/G)

“

-330 “

Nierentransplantat- abstoßungsreaktion Periodontale Krankheit

MORGUN et al. (2003) SCAREL-CAMINAGA et al.

(2002)

SNP (T/G) -174 “ JOHN et al. (1998) SNP (A/G) +122 Rheumatoide Arthritis KHANI-HANJANI (2001)

Merkmalsausbildung bei IL-2-Knock-Out-Mäusen

SCHORLE et al. (1991) beschrieben IL-2-Knock-Out-Mäuse (IL2^tm1Hor), die normale lymphoide Organe und Lymphozytenpopulationen entwickelten und eine nur geringgradig verminderte T-Zell-Antwort gegenüber viralen Infekten aufwiesen (KUNDIG et al., 1993). Nach vier Wochen erkrankten diese Tiere jedoch an einer autoimmunen hämolytischen Anämie, woran ca. 50 % der Knock-Out-Tiere im Alter von neun Wochen starben (HORAK et al., 1995). Die überlebenden Tiere litten an einer entzündlichen Darmkrankheit, was möglicherweise aus einer Überreaktion des Immunsystems auf die normale Darmflora resultiert (SADLACK et al., 1993). Es kommt hierbei zu einer Überproduktion von CD4+ T-Zellen, was eventuell die Folge einer gestörten Regulation der T-Zell-Entwicklung zugunsten einer Th1-dominierten Antwort ist (LUDVIKSSON et al., 1997).

2.5.2 Interleukin-6-Gen (IL-6)

Bisher ist für IL-6 beim Schwein lediglich die mRNA beschrieben worden, so dass sich die folgenden Ausführungen auf Untersuchungen des murinen und humanen Gens stützen.

Das porcine IL-6 liegt auf dem Chromosom 9. Durch In-situ-Hybridisierung wurde der chromosomale Bereich auf 9 q14-q15 eingegrenzt (BRUCH et al., 1996;

RETTENBERGER et al., 1996).

(39)

IL-6 besteht bei Mensch und Maus aus fünf Exons und vier Introns (YASUKAWA et al., 1988; TANABE et al., 1988); es weist zwischen den beiden Spezies eine große Ähnlichkeit auf (Abb. 5). Die Homologie in den codierenden Abschnitten beträgt ca. 60

%, während die 3’-flankierende Region, 300 bp der 5´-flankierenden Region und die 5’- UTR hochkonserviert sind (Homologie > 80 %). Der 3´-Bereich, der für die mRNA- Stabilität verantwortlich ist, weist sogar Homologien bis zu 100 % auf (TANABE et al., 1988). Auch in den Intronbereichen findet man Abschnitte hoher Homologie zwischen den Spezies. Außerdem enthält der 5´-Bereich des Gens beider Spezies die gleichen Response-Elemente (TANABE et al., 1988).

Das 3’-Ende von Exon 1 und der Beginn von Exon 2 codieren im IL-6 die Aminosäuren Nr. 63 bis 113, welche für die Rezeptorbindung zuständig sind (KALAI et al., 1997;

SIMPSON et al., 1997).

Die IL-6-Expression wird größtenteils über die Transkriptionsfaktoren NFIL-6, NFκB, AP1 und CRE-BP reguliert (Abb. 6). Die Region –180 bis –123 bp scheint für die Transkriptionsinduktion als Antwort auf virale Infektionen, Second Messenger und andere Zytokine, wie IL-1 oder TNF-α, von Bedeutung zu sein (RAY et al., 1988;

ISSHIKI et al., 1990). Die Aktivierung der Transkription erfordert die synergistische Aktivität von NFIL-6 (-158 bis -145 bp) und NFκB (-73 bis -64 bp) (MATSUSAKA et al., 1993; RAY und PREFONTAINE, 1994). ARMENANTE et al. (1999) identifizierten durch Footprint-Analysen zusätzlich zwei potenzielle Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor SP-1. In Tab. 6 sind die Sequenzmotive für die Transkriptionsfaktoren sowie die Positionen ihrer Response-Elemente in der 5’- flankierenden IL-6-Region aufgeführt.

(40)

Mensch

Maus

Abb. 5: Vergleichende Darstellung der murinen und humanen Genstruktur des IL- 6 (modifiziert nach TANABE et al., 1988)

Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Bereiche (CDS) schwarz, nicht-codierende (5’- und 3’-UTR) hingegen weiß dargestellt sind. Die Zahlen der Basenpaare verweisen auf die Längen der entsprechenden Abschnitte. Die Homologien der Nukleotidsequenzen sind: Exon 1: 74 %; Exon 2: 59 %; Exon 3: 69 %;

Exon 4: 65 %; Exon 5: 65 %.

Abb. 6: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der 5’-flankierenden Region des humanen IL-6 (modifiziert nach GRASSL et al., 1999; TERRY et al., 2000)

Zu den Bezeichnungen der Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente siehe Tab. 3, S. 25ff.

165 bp

706

5’

1737 bp

154 1047

19 191 114 147

3’

185 19

5’ 3’

1261 bp

162 1253 2981

165 bp

150 114

3’

5’ ^CRE-BP1 NFκB TBP

TATA-Box GR

GRE

-557 -26 bp

AP1 GRE TRE

GR NF-IL6

(41)

Tab. 6: Bindungsmotive in der 5’-flankierenden Region des IL-6 nach Angaben von YASUKAWA et al. (1987), TANABE et al. (1988), ARMANENTE et al.

(1999) und TERRY et al. (2000) Response-Element Trans-

kriptions-

faktor¹) Name ¹) Position

(bp) Sequenz ³)

GR GRE -557 bis -552 AGAAC

GR GRE -466 bis -461 AGAAC

AP1 TRE -283 bis -277 TGAGTCA

- MRE -173 bis -145 ATGCTAAAGGACGTCACATTGCAACAATCT

CRE-BP1 CRE -163 bis -157 ACGTCA

NFIL-6 GRE -158 bis -145 ACATTGCACAATCT SP-1 GC-Box -124 bis -119 CCACC

SP-1 GC-Box -104 bis -108 CCACC

NFκB N-BS ²) -73 bis -64 GGGATTTTCC TBP TATA-Box -51 bis -45 AATATTA TBP TATA-Box -28 bis -21 TAAATATA

1) Vgl. Tab. 3, S. 25ff.

2) N-BS: NFκB-binding site.

3) Es werden die Sequenzen von den in der Tabelle genannten Autoren angegeben.

-: Keine Bezeichnung.

DNA-Varianten und ihre Wirkung auf Merkmalswerte

Es sind viele DNA-Varianten im IL-6 bekannt. Beispielsweise wurden in Sequenzen der Datenbanken für das humane IL-6-Gen durch vergleichende Alignments mehrere Varianten gefunden (Genbank Acc.No. Y00081) (Beispiele: ein zusätzliches T an Position –584 bp, zwei zusätzliche G an Position +117 bp, ein AAGG-Insert an Position +154 bp, eine C – A Substitution an Position +158 bp, ein CG anstelle von GC an Position +165/166 bp, ein zusätzliches C an Position +204 bp, T - A Substitutionen an den Positionen +431 bp und +506 bp, ein C-Insert an +465 bp, eine C-Deletion an +471 bp, ein TGC-Insert an Position +478 bp sowie ein CC-Insert an Position +490 bp).

Polymorphismen im 5’-flankierenden Bereich von IL-6 können auf die Transkriptionsrate wirken und damit die Konzentration des Proteins beeinflussen. Hierdurch sind die Beobachtungen von Zusammenhängen zwischen IL-6-Varianten und der

(42)

Empfänglichkeit gegenüber einer breiten Palette an Krankheiten zu interpretieren, die in Tab. 7 zusammengefasst sind. Beispielsweise beeinflusst beim Menschen ein Polymorphismus an Position –174 bp (G → C) die IL-6-Transkription und tritt zugleich mit der juvenilen Arthritis assoziiert auf (FISHMAN et al., 1998). Diese DNA-Variante liegt im MRE-Bereich (siehe Abb. 6, S. 40), so dass ein Einfluss auf die Transkriptionsregulation zu erklären ist.

Tab. 7: DNA-Varianten im 5’-flankierenden Bereich des humanen IL-6 und ihre Assoziationen mit Merkmalswerten

DNA-Variante Position (bp)

Wirkung auf Merkmalswerte

Literatur SNP G/A

SNP G/C SNP A/T SNP C/G

-597 -572 -373 -174

Transkriptionsrate TERRY et al. (2000)

SNP G/C -572 Chronische

Peridontitis

HOLLA et al. (2004) SNP C/G

“

-174

“

Arteria Carotis Artherosklerose Juvenile chronische Arthritis

RAURAMAA et al. (2000) FISHMAN et al. (1998)

“ “ Insulinabhängiger

Diabetes mellitus

JAHROMI et al. (2000)

“ “ Systemischer Lupus

erythematodes SCHOTTE et al. (2001)

Minisatellit -

(3’-UTR)

Multiple Sklerose VANDENBROECK et al.

(2000)

Minisatellit -

(3’-UTR)

Systemischer Lupus erythematodes

LINKER-ISRAELI et al. (1996)

-: Keine Angaben.

Merkmalsausbildung bei IL-6-Knock-Out-Mäusen

IL-6-Knock-Out-Mäuse zeigten eine reduzierte T-Zell-abhängige Antikörperantwort (KOPF et al., 1994). Daraus resultierte eine hochgradig verschlechterte Immunantwort auf virale Infektionen. IL-6-defiziente Mäuse besaßen 20 – 40 % weniger Thymozyten

(43)

und periphere T-Zellen als Kontrolltiere (LA FLAMME und PEARCE, 1999). LeBLANC et al. (1999) wiesen nach, dass IL-6-Knock-Out-Mäuse empfänglich gegenüber einer Infektion mit Herpes Simplex Virus (HSV) sind. Bei diesen Tieren lag die Sterberate nach experimenteller HSV-Infektion bei 93 %, während 40 % der Wildtyp-Mäuse die Infektion überlebten.

2.5.3 Interleukin-12B-Gen (IL-12B)

Das Gen, welches das 35 kDa IL-12 codiert, wird IL-12A genannt und das Gen für die 40 kDa IL-12-Untereinheit wird als IL-12B bezeichnet. IL-12B ist auf dem porcinen Chromosom 2 lokalisiert. Es befindet sich dort in einem Cluster gemeinsam mit den Interleukin-Genen IL-3, IL-4, IL-5 und IL-9. Das humane und murine IL-12B besteht aus 8 Exons und 7 Introns, wobei beim Menschen (Abb. 7) das erste Exon und das achte Exon außerhalb des ORF liegen (HUANG et al., 2000), während bei der Maus jedoch ein Teil von Exon 8 zur CDS zählt (TONE et al., 1996).

Abb. 7: Schematische Darstellung des humanen IL-12B (unter Vorlage von Genbank Acc. No. AY008847)

Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Bereiche (CDS) schwarz, nicht-codierende (5’- und 3’-UTR) hingegen weiß dargestellt sind. Die Zahlen der Basenpaare verweisen auf die Längen der entsprechenden Abschnitte.

Die Molekülzahl für das IL-12-Protein wird durch die IL-12-p40-Untereinheit reguliert, während die p35-Untereinheit konstitutiv und ubiquitär produziert wird (D’ANDREA et

3649 3365 542 1873 1412 1920 584 bp 276

58 88

5’

118

3’

215 158 132 1318 bp

(44)

al., 1992; BECKER et al., 2003). IL-12-p40 entsteht in Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen nur nach vorheriger Stimulation durch Lipopolysaccharide (LPS) und Bakterien (YOSHIMOTO et al., 1997).

Wie Tab. 8 darstellt, wurden für das IL-12B-Gen in Regionen von ca. -300 bp bis zum tsp durch Deletions-, EMSA- und Footprint-Studien mehrere Response-Elemente identifiziert. So berichteten MURPHY et al. (1995), dass eine Bindungsstelle für die Transkriptionsfaktoren C-Rel und NFκB für die IFN-γ- und LPS-abhängige Aktivierung des murinen IL-12B-Promotors wichtig ist. PLEVY et al. (1997) identifizierten ein weiteres Response-Element, welches mit der C-Rel-/NFκB-Bindungsstelle kooperiert.

Im menschlichen IL-12B konnten MA et al. (1996) nachweisen, dass eine EBS- Bindungsstelle proximal der C-Rel-/NFκB-Bindungsstelle für die Transkriptionsaktivierung durch IFN-γ und LPS von Bedeutung ist. Dieses EBS- Response-Element bindet einen Protein-Komplex, der mehrere Faktoren umfasst.

Soweit durch Footprint-Analysen nachgewiesen werden konnte, binden weitere Transkriptionsfaktoren im Bereich -292 bis –196 bp um das EBS-Response-Element.

Dazu gehört auch ICSBP, ein zur IRF-Familie (IRF: IFN Regulatory Factor) gehöriger Transkriptionsfaktor, der von Makrophagen nach LPS- und/oder IFN-γ-Stimulation produziert wird (WANG et al., 2000). MARUYAMA et al. (2003) identifizierten ein weiteres Response-Element im IL-12B, welches den Transkriptionsfaktor IRF-1 bindet.

Diese Bindung führt bei gleichzeitiger Anlagerung des C-Rel-/NFκB-Proteinkomplexes zu einer maximalen IL-12B-Expression in den Makrophagen.

DNA-Varianten und ihre Wirkung auf Merkmalswerte

Es wurden zahlreiche Varianten an verschiedenen Stellen des IL-12B beschrieben.

Beispielsweise identifizierten HUANG et al. (2000) durch ein Datenbank-Screening 13 Varianten (überwiegend SNPs) in Intronbereichen. Bislang konnten jedoch nur wenige Varianten im IL-12B mit Erkrankungen assoziiert werden. Experimentell herbeigeführte Mutationen im murinen 5’-flankierenden Bereich von IL-12B, die zu einer gestörten Expression führen, haben bei der Maus eine erhöhte Empfänglichkeit gegenüber Infektionen zur Folge (SCHARTON-KERSTEN et al., 1995, 1997; WANG et al., 2000).

Außerdem existieren beim Menschen Fallanalysen über IL-12B-Mutationen.

Beispielsweise fanden ALTARE et al. (1998) bei einem Kind nach wiederkehrenden

(45)

Infektionen mit intrazellulären Erregern eine homozygote Deletion im IL-12B, und zugleich war die IFN-γ-Produktion durch Lymphozyten stark gestört. Eine weitere Mutation im IL-12B wurde bei mehreren Patienten nach wiederkehrenden Infektionen mit ansonsten schwach pathogenen intrazellulären Erregern identifiziert (PICARD et al., 2002). Hierbei handelte es sich um eine Insertion, die zu einem Frameshift führt, durch den ein funktionsuntüchtiges Protein ensteht. Eine Assoziation zwischen den SNPs A/G und A/C an den Positionen 4237 und 6402 bp des humanen IL-12B und Asthma belegten RANDOLPH et al. (2004). Hierbei konnten Haplotypen mit verschiedener phänotypischer Ausprägung von Asthma in Verbindung gebracht werden.

Tab. 8: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der 5’-flankierenden Region des IL-12B (nach MURPHY et al., 1995; MA et al., 1996; WANG et al., 2000)

Response-Element Trans-

kriptions-

faktor ¹) Name ¹) Position (bp) ²) Sequenz ³)

ETS-2 EBS H: -212 bis -207

M: -219 bis -214

TTTCCT (-: AGGAAA) TTTCCT (-: AGGAAA) Pu.1 Pu-Box H: -127 bis -122

M: -143 bis -138

GAGGAA GAGGAA C-Rel/ NFκB N-BS H: -117 bis -107

M: -131 bis -121

AAAATTCCCC (-: GGGGAATTTT) AAAATTCCCC (-: GGGGAATTTT)

IRF-1 IRF-E H: -75 bis -56 AGTTTCTACTTTGGGTTTCC

TBP TATA-Box H: -30 bis -24 M: -30 bis -24

TATATAA TATATAA

1) Vgl. Tab. 3, S. 25ff.; N-BS: NFκB-binding site.

2) H: Mensch; M: Maus.

3) Angaben der Autoren; -: Gegenstrang (Antisense-Strang). Die Konsensussequen- zen sind unterstrichen.

Merkmalsausbildung bei IL-12B-Knock-Out-Mäusen

MATTNER et al. (1996) beschrieben, dass Mäuse mit einem IL-12B-Knock-Out empfänglich für eine Infektion mit Leishmania major waren, Wildtyp-Mäuse mit einem intakten IL-12B hingegen nicht. Die IL-12B-Knock-Out-Mäuse waren nicht imstande, eine Th1-vermittelte Immunantwort gegen den protozoischen Erreger auszubilden. Zu

(46)

einem ähnlichen Ergebnis kamen COOPER et al. (2002) bei einem Vergleich von IL- 12A- und IL-12B-defizienten Mäusen mit Wildtyp-Mäusen nach Infektion mit Mycobakterium tuberculosis. Die Knock-Outs wiesen eine erhöhte Empfänglichkeit und eine höhere Mortalität im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen auf, wobei ein IL-12B-Knock-Out zu stärkeren Auswirkungen führte.

2.5.4 Interferon-γ-Gen (IFN- γ)

Das humane (GRAY und GOEDDEL, 1982), murine (GRAY und GOEDDEL, 1983) und bovine (CERRETTI et al., 1986) IFN-γ-Gen wurde kloniert und charakterisiert. Die Homologie der DNA-Sequenz zwischen den Spezies beträgt 47 - 63 %; die Proteine sind jedoch speziesspezifisch in Bezug auf ihre biologische Funktion (BIELEFELDT OHMANN, 1987).

Die genomische Struktur des IFN-γ-codierenden Gens beim Schwein wurde von DIJKMANS et al. (1990; Genbank Acc. No. X53085) bestimmt. Die Struktur weist eine große Ähnlichkeit zu der des Menschen auf (GRAY und GOEDDEL, 1982; Genbank Acc. No. V00536). Das Gen besteht bei mehreren Säugerspezies aus vier Exons und drei Introns. Die Analyse der codierenden Regionen zeigt, dass das IFN-γ duplizierte DNA-Abschnitte enthält (SEHGAL et al., 1986). Auch Response-Elemente liegen dupliziert vor (YOUNG und GOSH, 1997). Vom ersten Exon werden die 5’-UTR sowie die Codons für die Signalsequenz und die ersten Aminosäuren des reifen Proteins codiert. Das vierte Exon codiert die 3’-UTR. Das porcine IFN-γ-Gen wurde auf das Chromosom 5 (5p1.2 – 5q1.1) kartiert (JOHANSSON et al., 1993).

Das IFN-γ codiert beim Menschen eine mRNA, welche die Basen TGC CAG GAC an den Positionen +196 bis +204 für die Aminosäuren 23 bis 25 des reifen Proteins trägt.

Diese Aminosäuren sind wichtig für die Interaktion des IFN-γ mit dessen Rezeptor (WALTER et al., 1995). Beim porcinen IFN-γ befindet sich die Nukleotidfolge TGC CAG GCG an den Positionen +192 bis +200 und wird vom Exon 1 codiert (Genbank Acc. No.

X53085).