2.5 Beschreibung der untersuchten Zytokin-codierenden Gene
2.5.1 Interleukin-2-Gen (IL-2)
Genomische Struktur und Genprodukte
Das IL-2 des Schweins wurde auf Chromosom 8 lokalisiert (ELLEGREN et al., 1993).
Der sequenzierte Bereich der porcinen mRNA umfasst 573 bp (GOODALL et al., 1991) bzw. 526 bp (LEFEVRE, 1991). Die CDS enthält 465 bp, und das reife Peptid wird nach Abspaltung der Signalsequenz von einer 405-bp-Sequenz translatiert. Für die genomische Sequenz des IL-2 beschrieben IWATA et al. (2000) 4921 bp mit codierenden Abschnitten von 147 bp (Exon 1), 60 bp (Exon 2), 147 bp (Exon 3) und 111 bp (Exon 4). Das porcine IL-2 (Abb. 2) umfasst demzufolge vier Exons und drei Introns und weist damit eine strukturelle Ähnlichkeit zu dem IL-2 anderer Säugerspezies auf.
Abb. 2: Genomische Struktur des porcinen IL-2-Gens (nach Daten von IWATA et al., 2000; Genbank Acc.No. AB041935)
Schwarze Rechtecke stellen die CDS (codierende Sequenz) der Exons 1 bis 4 dar. Die Angaben der Basenpaare beziehen sich auf die Exons und Introns. Für Exon 1 und 4 werden nur die CDS dargestellt.
Beim Menschen ist die genomische Struktur des IL-2 eingehend bekannt. So sequenzierten FUJITA et al. (1983) und HOLBROOK et al. (1984) 5561 bp des humanen IL-2. Das erste Exon umfasst 200 bp, wovon – wie bei der Transkription des porcinen IL-2 – 147 bp als CDS dienen. Ähnlich verhält es sich beim humanen Exon 4:
Es umspannt einen Bereich von 394 bp, wovon - wie beim Schwein - 111 bp als codierende Sequenz zur Verfügung stehen.
111 147
147
5’ 3’
60
89 2252 1787 bp
bp
Für das porcine IL-2-Protein fanden GOODALL et al. (1991) eine 72 %ige Homologie zur Aminosäuresequenz des reifen Proteins von Mensch und Schaf. Das porcine IL-2-Protein weist eine Kreuzreaktivität im Hinblick auf die Induktion des T-Zell-Wachstums zum humanen IL-2-Protein auf. Dies könnte nach GOODALL et al. (1991) an der Ähnlichkeit des porcinen Moleküls im Bereich der Kontaktstellen mit dem IL-2-Rezeptor liegen. Beim Menschen werden diese Kontaktstellen von den Aminosäuren 11 bis 20 für die p75IL-2-Rezeptor-Untereinheit und von den Aminosäuren 33 bis 56 für die p55-Untereinheit gebildet (JU et al., 1987; COLLINS et al., 1988). Die entsprechenden Kontaktstellen finden sich nach GOODALL et al. (1991) beim porcinen IL-2 an den gleichen Positionen. Hierfür zeigt Abb. 3 die Aminosäuresequenzen sowie die zugrunde liegenden codierenden Nukleotidabfolgen.
31 60
Sequenz AAG AAA CAA CTG GAG CCA TTG CTG CTG GAT
Aminosäure K K Q L E P L L L D
97
Sequenz AAT GCA GAT CTC TCC AGG ATG CTC ACA TTT AAA TTT
Aminosäure N A D L S R M L T F K F
168
Sequenz TAC ATG CCC AAG CAG GCT ACA GAA TTG AAA CAC CTT
Aminosäure Y M P K Q A T E L K H L
Abb. 3: Nukleotid- und Aminosäureabfolgen in Bereichen der Kontaktstellen des Proteins mit den Rezeptoruntereinheiten p75 (oben, 31 bis 60 bp) und p55 (Mitte und unten, 97 bis 168 bp)
Oberhalb der Sequenz ist jeweils die Position des Nukleotids in der cDNA wiedergegeben (Referenzsequenz: Genbank Acc.No. X56750). A: Alanin; D: Aspartat;
E: Glutamat; F: Phenylalanin; H: Histidin; K: Lysin; L: Leucin; M: Methionin; N:
Asparagin; P: Prolin; Q: Glutamin, R: Arginin; S: Serin; T: Threonin; Y: Tyrosin.
Transkription und Regulation
Die 5’-flankierende Region des IL-2 enthält Bindungsstellen insbesondere für die Transkriptionsfaktoren NFAT1, NFκB, AP1 und Oct1. Die Regulation der IL-2-Expression erfolgt primär auf Transkriptionsebene (RIEGEL et al., 1992). Stimuli an den Oberflächen der T-Zellen führen zur Aktivierung ubiquitärer und gewebespezifischer Transkriptionsfaktoren. Diese Faktoren interagieren mit Sequenz-Elementen in einem Bereich bis ca. -300 bp (FUJITA et al., 1986; DURAND, 1988) und kontrollieren
gemeinsam eine fein regulierte Transkription. Durch Deletions-, EMSA- und Footprint-Studien wurden in dieser Region fünf sequenzspezifische DNA/Protein-Komplexe identifiziert. Die Bindungssequenz für NFAT1 ist Purin-reich. RIEGEL et al. (1992) unterschieden bei Deletionsstudien die in Abb. 4 gezeigten Elemente, von denen die tsp-nahen Elemente NFIL-2A und –2B eine drastisch reduzierte Transkription bewirkten. Auch die Deletion der Elemente NFIL-2D und -2E führte jedoch zu einem Rückgang der Transkription. In Tab. 4 sind die Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente für den 5’-Bereich von IL-2 aufgeführt.
Abb. 4: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente im 5’-Bereich des IL-2 (modifiziert nach RIEGEL et al., 1992; Referenzsequenz: Genbank Acc.No.
X00695)
Dargestellt ist der Bereich von –287 bis –72 bp relativ zum tsp. Schwarze Rechtecke stellen Proteinbindungsstellen (Response-Elemente) dar. Zu den Abkürzungen siehe Tab. 3, S. 25ff. Die in der letzten Zeile aufgeführten Elemente NFIL-2E bis -2A werden in Tab. 3 als Bereiche für DNA-bindende Proteine definiert; sie beziehen sich jedoch auf Deletionsstudien von RIEGEL et al. (1992) und werden im Text erklärt.
DNA-Varianten und deren Wirkung auf Merkmalswerte
In Tab. 5 (S. 38) werden Assoziationen zwischen einigen der IL-2-Allele und Merkmalswerten dargestellt. Diese Angaben betreffen den Menschen. Mit Hilfe der In-situ-Fluoreszenz-Hybridisierung und der Single-Cell-PCR bei Zellen mit verschiedenen IL-2-Allelen demonstrierten HOLLÄNDER et al. (1998), dass die IL-2-Expression in ausgereiften Thymozyten und T-Zellen nicht erkennbar von den Allelen beeinflusst wird.
NFAT1 Pu-Box
AP1
TRE
CD28
CD28RE
NFκB1 Oct1
Octa-Box TRE
AP1 NFAT1
Pu-Box
-72 bp
5’ 3’
NFIL-2E NFIL-2D NFIL-2C NFIL-2B NFIL-2A
-287
Oct1 Octa-Box
Tab. 4: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der 5’-flankierenden Region des IL-2 von Mensch und Maus (nach RIEGEL et al., 1992 und WARD et al., 1998) NFAT1 H: -287 bis -277
M: -288 bis -278
Pu-Box: AAGGAGGAAAAA AAGGAGGAAAAT
AGGAA Oct1 H: -254 bis -247
M: -250 bis -257 ATGCAATT (-)
ATACAATG (-) ATGCAAAT
M: -187 bis -198 TRE-like: TCAGTCA
TCAGTCA TRE:TGACTCA
M: -166 bis -156 CD28RE: AAAGAAATTCC
AAAGAAATTCC RGARNTTCC NFAT1 H: -130 bis -140
M: -143 bis -133
AAGAGGAAAAA AAGAGGAAAAA
AGGAA Oct1 H: -72 bis -79
M: -86 bis -73 ATGTAAAA ATGTAAAA
M: -57 bis -50 TATTATT
TATTATT TATAAA
1) Zu den Abkürzungen der Transkriptionsfaktoren und Response-Elementen siehe Tab. 3, S. 25ff.
-: Es wurde keine Bezeichnung für den Transkriptionsfaktor angegeben.
2) H: Human; M: Maus. Referenzsequenzen: Genbank Acc.No. X00695 (Mensch) und X01663 (Maus).
3) (-): Gegenstrang (Antisense-Strang).
4) Es werden die von den Autoren gefundenen Konsensussequenzen genannt.
Weitere Sequenzen siehe Tab. 3, S. 25ff.
Tab. 5: Assoziationen zwischen IL-2-Allelen und Merkmalswerten beim Menschen DNA-Variante Position
(bp)
Wirkung auf Merkmalswerte
Literatur SNP (T/G)
“
-330 “
Nierentransplantat-abstoßungsreaktion Periodontale Krankheit
MORGUN et al. (2003) SCAREL-CAMINAGA et al.
(2002)
SNP (T/G) -174 “ JOHN et al. (1998) SNP (A/G) +122 Rheumatoide Arthritis KHANI-HANJANI (2001)
Merkmalsausbildung bei IL-2-Knock-Out-Mäusen
SCHORLE et al. (1991) beschrieben IL-2-Knock-Out-Mäuse (IL2tm1Hor), die normale lymphoide Organe und Lymphozytenpopulationen entwickelten und eine nur geringgradig verminderte T-Zell-Antwort gegenüber viralen Infekten aufwiesen (KUNDIG et al., 1993). Nach vier Wochen erkrankten diese Tiere jedoch an einer autoimmunen hämolytischen Anämie, woran ca. 50 % der Knock-Out-Tiere im Alter von neun Wochen starben (HORAK et al., 1995). Die überlebenden Tiere litten an einer entzündlichen Darmkrankheit, was möglicherweise aus einer Überreaktion des Immunsystems auf die normale Darmflora resultiert (SADLACK et al., 1993). Es kommt hierbei zu einer Überproduktion von CD4+ T-Zellen, was eventuell die Folge einer gestörten Regulation der T-Zell-Entwicklung zugunsten einer Th1-dominierten Antwort ist (LUDVIKSSON et al., 1997).