Kenntnisse zur genomischen Struktur lagen für das Schwein nur bei den Zytokin-Genen IL-2 und IFN-γ vor. Jedoch waren auch in diesen Fällen die codierenden DNA-Bereiche nicht bekannt. Daher wurden Alignments mit Zytokin-Genen anderer Säugerspezies durchgeführt. Auf dieser Basis wurden bei den Genen IL-6 und IL-12B auf die Exon/Intron-Struktur und den tsp der porcinen Zytokin-Gene geschlossen. Im Falle der Gene IL-2 und IFN-γ ließen sich durch heterologe Vergleiche die codierenden DNA-Bereiche erkennen.
4.1.1 Interleukin-2-Gen (IL-2)
Aus Tab. 18 geht hervor, dass das IL-2 in den berücksichtigten Säugerspezies stets vier ähnlich große Exons aufweist, von denen der überwiegende Teil (462 - 510 bp von insgesamt 738 - 892 bp je nach Spezies) auch translatiert wird. Beim Schwein ist der genomische DNA-Bereich ab ca. -2650 bp bp bekannt und weist, insbesondere in den tsp-nahen Bereichen sowie den Exonbereichen, z. T. hohe Homologien zu den DNA-Sequenzen des Menschen und des Rindes auf (Abb. A1 und A2, S. 149f.). Die aus den Daten der Tab. 18 abzuleitende Struktur des porcinen IL-2 ist in der Abb. 12 dargestellt.
Hierbei sind die Längen von Exon 1 und 4 aus heterologen Vergleichen abgeleitet, und die Daten vom Schwein stammen aus einem Sequenzierprojekt (Genbank Acc. No.
AB041935).
Abb. 12: Genomische Struktur des porcinen IL-2-Gens
Transkriptionsstart und -ende wurden aus Alignments mit der humanen (Genbank Acc.
No. X00695) und porcinen Sequenz (Genbank Acc. No. AB041935) abgeleitet. Die aus den heterologen Vergleichen entnommenen Zahlenwerte für das Schwein sind kursiv geschrieben. Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Sequenzen (CDS) schwarz und die nicht-codierenden (3’- und 5’-UTR) weiß dargestellt sind.
60 147 111/283 bp
5’ 3’
89 2252 1787 bp
53/147
Tab. 18: DNA-Sequenzen für die Ermittlung der porcinen IL-2-Genstruktur
Exon Intron
Spezies Referenz-Sequenz 1)
Nr. Start (bp) 2)
Länge/CDS
(bp) 3) Nr. Start (bp) 2)
Länge (bp)
CDS (bp) 4)
Mensch X00695 1 1363 200/147 1 1563 90 462
2 1653 60/60 2 1713 2292
3 4005 144/144 3 4149 1861
4 6010 394/111
Mensch AF359939 1 833 194/147 1 1027 90 462
2 1117 60/60 2 1177 2290
3 3467 144/144 3 3611 1848
4 5459 400/111
Mensch J00264 1 <413 -/147 1 625 90 462
2 715 60/60 2 775 2293
3 3068 144/144 3 3212 1845
4 5057 387/111
Maus AF195956 1 <4562 -/189 1 4751 99 510
2 4850 60/60 2 4910 2423
3 7333 147/147 3 7480 1774
4 9254 496/114
Schwein AB041935 1 <48 -/147 1 195 89 465
2 284 60/60 2 344 2252
3 2596 147/147 3 2743 1787
4 4530 -/111
1) Genbank Acc. No.
2) Angabe des ersten Nukleotids relativ zur Referenzsequenz. Die Bezeichnung „<“ gibt an, dass der tsp nicht bekannt ist; der Start wurde dann geschätzt.
3) CDS: codierende Sequenz, d.h. Sequenz, die translatiert wird.
4) Ermittelt aus der Addition der codierenden Abschnitte der Exons.
-: Keine Angabe
4.1.2 Interleukin-6-Gen (IL-6)
Zur Ermittlung der Genstruktur von IL-6 standen je eine genomische Sequenz für den Menschen und die Maus zur Verfügung. Außerdem wurden die Sequenz des 5’-flankierenden Bereichs beim Rind sowie je eine cDNA-Sequenz für das Schwein und das Rind berücksichtigt (Tab. 19). In den Spezies Mensch und Maus wurden fünf Exons gefunden; die CDS ist in den Spezies annähernd gleich lang. Homologien der DNA-Sequenzen zwischen den Spezies werden in Abb. A3, S. 151f., dargestellt; sie zeigen stärkere Ähnlichkeiten in den Exonsequenzen zwischen Schwein und Rind als zwischen Schwein und Mensch. Die aus der porcinen cDNA sowie den genomischen DNA-Sequenzen von Mensch und Maus zu erkennende Struktur des porcinen IL-6 ist in der Abb. 13 wiedergegeben. Hierbei ergibt sich die Aufteilung in Exon/Intron-Abschnitte weitgehend durch den Vergleich der genomischen Sequenzen von Mensch und Maus mit der porcinen cDNA.
Abb. 13: Chromosomale Struktur des porcinen IL-6-Gens
Ableitung durch Alignment von humaner Sequenz (Genbank Acc. No. AF372214) und porciner Sequenz (Genbank Acc. No. M86722). Die aus den heterologen Vergleichen entnommenen Zahlenwerte für das Schwein sind kursiv geschrieben. Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Sequenzen (CDS) schwarz und die nicht-codierenden (3’- und 5’-UTR) weiß dargestellt sind.
707
5’
1745 bp 162 1058
62/19 191 114 147
3’
168/424 bp
Tab. 19: DNA-Sequenz für die Ermittlung der Genstruktur des porcinen IL-6-Gens
Exon Intron
Spezies Referenz-sequenz 1)
Nr. Start (bp) 2)
Länge/CDS
(bp) 3) Nr. Start (bp) 2)
Länge (bp)
CDS (bp)
Mensch AF372214 1 1685 81/19 1 1766 162 639 4)
2 1928 191/191 2 2119 1058
3 3177 114/114 3 3291 707
4 3998 147/147 4 4145 1745
5 5890 592/168
Maus M20572 1 <1328 -/19 1 1347 162 636 4)
2 1509 185/185 2 1694 1253
3 2947 114/114 3 3061 2981
4 6042 150/150 4 6192 1261
5 7453 -/168
Rind Z11749 1 1215 - - - -
-Rind X57317 - - - 627 5)
Schwein M86722 - - - 639 5)
1) Genbank Acc. No.
2) Angabe des ersten Nukleotids relativ zur Referenzsequenz. Die Bezeichnung „<“ gibt an, dass der tsp nicht bekannt ist; der Start wurde dann geschätzt.
3) CDS: codierende Sequenz, d.h. Sequenz, die translatiert wird.
4) Ermittelt aus der Addition der codierenden Abschnitte der Exons.
5) Angabe der cDNA-Sequenzierung.
-: Keine Angabe.
4.1.3 Interleukin-12-Gen (IL-12B)
IL-12B ist als genomische Sequenz beim Menschen und bei der Maus bekannt (Tab. 20). Bei der Maus befinden sich jedoch nicht die gesamten Intronbereiche in der Genbank. In dieser Spezies ist außerdem die CDS-Länge erst aus einer zweiten Referenzsequenz zu entnehmen. In beiden Spezies wurden für IL-12B acht Exons mit ähnlichen Längen gefunden. Lediglich Exon 8 ist beim Menschen deutlich (um 524 bp) länger als bei der Maus, und beim Menschen wird Exon 8 nicht für die Translation benutzt, während bei der Maus ein kurzer Abschnitt von 13 bp als CDS angegeben wird. Für das Schwein ist lediglich die cDNA-Sequenz bekannt.
Auch hier zeigen sich vor allem in den Exonbereichen sowie in den tsp-nahen Regionen Homologien (Abb. A4, S. 153). Die aus der porcinen cDNA sowie den genomischen DNA-Sequenzen von Mensch und Maus abzuleitende Struktur erlaubt eine Einteilung des porcinen IL-12B in Exon/Intron-Abschnitte (Abb. 14). Dabei kann man aufgrund der Angabe der CDS im Genbankeintrag U08317 davon ausgehen, dass Exon 1 und 8 - wie beim Menschen - nicht translatiert werden.
Abb. 14: Genomische Struktur des porcinen IL-12B
Ableitung durch Alignment von humaner Sequenz (Genbank Acc. No. AY008847) und porciner Sequenz (Genbank Acc. No. U08317). Die aus den heterologen Vergleichen entnommenen Zahlenwerte für das Schwein sind kursiv geschrieben. Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Sequenzen (CDS) schwarz und die nicht-codierenden (3’- und 5’-UTR) weiß dargestellt sind.
1) Aus den Alignments wurde ersichtlich, dass es im Vergleich zum Menschen einige InDels gibt, die im Exon 5 zu dem Längenunterschied von 12 bp führen.
3649 3365 542 1873 1412 1920 584 bp 276
58 88
5’
118
3’
203 1) 158 132 1059 bp
Tab. 20: DNA-Sequenzen für die Ermittlung der Genstruktur des porcinen IL-12B-Gens
Exon Intron
Spezies Referenz-sequenz 1)
Nr. Start (bp) 2)
Länge/CDS
(bp) 3) Nr. Start (bp) 2)
Länge (bp)
CDS (bp)
Mensch AY008847 1 2426 58/0 1 2484 3649 987 4)
2 6133 88/88 2 6221 3365
3 9586 276/276 3 9862 542
4 10404 118/118 4 10522 1873
5 12395 215/215 5 12610 1412
6 14022 158/158 6 14180 1920
7 14022 132/132 7 16232 584
8 16816 1318/0
Maus S82420 1 691 162/0 1 853 - 1008 4)
S82421 2 166 88/88 2 254
-S82422 3 134 267/267 3 401
-S82422 4 781 118/118 4 899
-S82423 5 153 218/218 5 370
-S82424 6 171 179/179 6 350
-S82425 7 116 125/125 7 241
-S82426 8 122 794/13
Maus M86671 - - - 1008 5)
Schwein U08317 - - - 975 5)
1) Genbank Acc. No.
2) Angabe des ersten Nukleotids relativ zur Referenzsequenz.
3) CDS: codierende Sequenz, d.h. Sequenz, die translatiert wird.
4) Ermittelt aus der Addition der codierenden Abschnitte der Exons.
5) Angabe der CDS.
-: Keine Angabe.
4.1.4 Interferon-γ-Gen (IFN-γ)
Wie der Tab. 21 (S. 77) zu entnehmen ist, wurden für das IFN-γ Vergleichssequenzen von Mensch, Rind, Maus und Schwein berücksichtigt. In diesen Spezies weist IFN-γ stets vier Exons auf, die auch - jedenfalls teilweise - translatiert werden. Beim Schwein beginnt der sequenzierte genomische DNA-Bereich mit dem tsp. Auffallend sind die über die Spezies hinweg (ausgenommen Maus) gleich langen CDS. Die Homologien der DNA-Sequenzen zwischen Menschen, Rind, Maus und Schwein in Abb. A5 und A6 (S. 154ff.) verweisen auf starke Konservierung in den Exonbereichen, wobei die Maus am stärksten abweicht. Ebenso ist der 5’-flankierende Bereich auf einer Länge von ca.
500 bp zwischen Mensch und Rind sehr homolog. Auffällig ist der nur beim Menschen vorkommende CA-Repeat im Intron 1, welcher nachweislich Einfluss auf die Expressionsrate nimmt (vgl. S. 50). Die Struktur des porcinen IFN-γ, die in der Abb. 15 dargestellt ist, stammt vollständig aus den Angaben der Genbank Acc. No. X53085.
Abb. 15: Genomische Struktur des porcinen IFN-γ
Nach Angaben der porcinen Sequenz, Genbank Acc. No. X53085. Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Sequenzen (CDS) schwarz und die nicht-codierenden (3’- und 5’-UTR) weiß dargestellt sind.
4.2 Vergleiche der Sequenzen für die Zytokin-Gene zwischen Schwein,