Interferon-γ-Gen (IFN- γ)

Genomische Struktur und Genprodukte

Das humane (GRAY und GOEDDEL, 1982), murine (GRAY und GOEDDEL, 1983) und bovine (CERRETTI et al., 1986) IFN-γ-Gen wurde kloniert und charakterisiert. Die Homologie der DNA-Sequenz zwischen den Spezies beträgt 47 - 63 %; die Proteine sind jedoch speziesspezifisch in Bezug auf ihre biologische Funktion (BIELEFELDT OHMANN, 1987).

Die genomische Struktur des IFN-γ-codierenden Gens beim Schwein wurde von DIJKMANS et al. (1990; Genbank Acc. No. X53085) bestimmt. Die Struktur weist eine große Ähnlichkeit zu der des Menschen auf (GRAY und GOEDDEL, 1982; Genbank Acc. No. V00536). Das Gen besteht bei mehreren Säugerspezies aus vier Exons und drei Introns. Die Analyse der codierenden Regionen zeigt, dass das IFN-γ duplizierte DNA-Abschnitte enthält (SEHGAL et al., 1986). Auch Response-Elemente liegen dupliziert vor (YOUNG und GOSH, 1997). Vom ersten Exon werden die 5’-UTR sowie die Codons für die Signalsequenz und die ersten Aminosäuren des reifen Proteins codiert. Das vierte Exon codiert die 3’-UTR. Das porcine IFN-γ-Gen wurde auf das Chromosom 5 (5p1.2 – 5q1.1) kartiert (JOHANSSON et al., 1993).

Das IFN-γ codiert beim Menschen eine mRNA, welche die Basen TGC CAG GAC an den Positionen +196 bis +204 für die Aminosäuren 23 bis 25 des reifen Proteins trägt.

Diese Aminosäuren sind wichtig für die Interaktion des IFN-γ mit dessen Rezeptor (WALTER et al., 1995). Beim porcinen IFN-γ befindet sich die Nukleotidfolge TGC CAG GCG an den Positionen +192 bis +200 und wird vom Exon 1 codiert (Genbank Acc. No.

X53085).

Schwein

Mensch

Abb. 8: Vergleich der Genstruktur des porcinen und homologen humanen IFN-γ (Angaben nach Genbank-Einträgen: Schwein Acc. No. X53085, DIJKMANS et al., 1990; Mensch Acc. No. J00219, GRAY und GOEDDEL, 1982).

Die Exons werden mit Rechtecken wiedergegeben, wobei die codierenden Bereiche (CDS) schwarz und nicht-codierende weiß dargestellt sind. Die Zahlen verweisen auf die Längen der entsprechenden Abschnitte in Basepaaren. Der Längenwert für die 3’-UTR-Region im Exon 4 ist noch fraglich.

Transkription und Regulation

Die 5’-flankierende Region des IFN-γ ist bei den Säugerspezies stark konserviert. So liegt die Homologie zwischen Mensch und Maus in dieser Region bei 77 % (GRAY und GOEDDEL, 1982, 1983; TAYA et al., 1982; FOX et al., 1991). Für die Promotorfunktion ist die Sequenz –100 bis –30 bp essenziell (CHRIVIA et al., 1990; PENIX et al., 1993).

In diesem Bereich wurden in Th-Zellen zwei Response-Elemente identifiziert, ein proximales und ein distales. Beide werden nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation aktiviert (PENIX et al., 1993; PENIX et al., 1996; AUNE et al., 1997). Bei den CD8+ T-Zellen wird nur das distale Element aktiviert, was gegenüber CD4+ Zellen eine schwächere IFN-γ-Expression zur Folge hat. Das proximale Element weist imperfekte CRE-Response-Elemente auf und wird von Komplexen der Transkriptionsfaktoren AP1, ATF1, CRE-BP1 (ATF2) und CRE-BP gebunden, während die distalen Response-Elemente von AP1, GATA-3, GMCSF und Oct1 erkannt werden (PENIX et al., 1996;

1147 95 2800 bp

239/114 69 183 135/900 bp

5’ 3’

3’

125/114 69 183 135/586 bp

5’

1239 95 2425 bp

ZHANG et al., 1998). Die Verteilung der Response-Elemente im humanen IFN-γ wird in Abb. 9 und Tab. 9 gezeigt.

Abb. 9: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der 5’-flankierenden Region (bis -134 bp) des humanen IFN-γ (modifiziert nach AUNE et al., 1997, ZHU et al., 2001)

Tab. 9: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der IFN-γ −Region -134 bp bis tsp (nach PENIX et al., 1996; KAISER et al., 1997; ZHANG et al., 1998; ZHU et al., 2001)

Response-Element

CRE -57 bis -51 TACGTAA TCACGTCA

TCAGTCA

AP1 TRE -63 bis -53 TGAAAATACGT TGASTCA

NFIL-2A -71 bis -49 AAAACTTGTGAAAATACGTAATCC Oct1;

GATA-1 -94 bis -91 TATC GATA

AP1 TRE ca. -88 bis

ca. -78 TGCCTAT GMCSF

CCAT-Box

-89 bis -79 GTCACCATCT CCAT

1) Vgl. Tab. 3, S. 25ff.

2) -: Gegenstrang (Antisense-Strang). Angaben der Sequenzen erfolgt nach den oben zitierten Autoren. Konsensussequenzen sind unterstrichen.

5’ AP1 3’

Weitere regulatorische Elemente im 5’-flankierenden Bereich von IFN-γ konnten zwischen -280 und -180 bp identifiziert werden (YE et al., 1996; SICA et al., 1997;

SWEETSER et al., 1998). In dieser Region wurden Response-Elemente für u. a. AP1, AP2, NFAT-Proteine, NFκB und YY-1 sowie eine Aktivierung durch die Zytokine IL-12 und IL-18 nachgewiesen (BARBULESCU et al., 1998). Der Transkriptionsfaktor YY-1 wirkt dabei nach CHRIVIA et al. (1990) und YE et al. (1996) als Silencer-Element. NFκB (Konsensussequenz: GGGAMTNYCC) und die NFAT-Proteine binden unabhängig voneinander; die Aktivierung durch NFAT-Proteine erfordert jedoch eine Kooperation mit AP1. Für die Th1-selektive Expression des IFN-γ ist in T-Zellen nach SOUTTO et al. (2002) ein weiterer 5’-flankierender Bereich zwischen -565 und -410 bp verantwortlich. In dieser Region wird eine Bindung des Th1-spezifischen Transkriptionsfaktors T-bet angenommen, jedoch konnten SOUTTO et al.

(2002) im EMSA die Bindung dieses Faktors nicht nachweisen. Abb. 10 zeigt die Verteilung der Response-Elemente im IFN-γ−Bereich -565 bis -155 bp.

Abb. 10: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente im Bereich -565 bis -155 bp des humanen IFN-γ (nach SOUTTO et al., 2002)

Die Angaben für -565 bis -410 bp stammen aus einer Computeranalyse, die der übrigen Angaben aus Proteinbindungsanalysen.

Auch in weiteren DNA-Bereichen konnten regulatorische Elemente nachgewiesen werden. So identifizierten SICA et al. (1997) im Intron 1 eine Region (GAATTTTCC), an welche das von Bakterien stammende C-Rel-Protein bindet. In den Introns 1, 2 und 3 befinden sich zahlreiche NFκB- und NFAT-Bindungsstellen, welche die Genexpression verstärken können (SICA et al., 1997). Im dritten Intron wurden CD28-Response-Elemente gefunden (YOUNG und GHOSH, 1997). GONSKY et al. (2003) zeigten für das humane IFN-γ, dass STAT4 - abgesehen vom proximalen Promotorbereich - auch an Sequenzbereiche im ersten Intron bindet. HARDY et al. (1987) identifizierten eine DNase I hypersensitive Region (AGTTTCTTTG), die mit

T-bet

90 %iger Homologie (AGTNTCTTTT) u.a. in den Genen IFN-γ und IL-2 vorkommt. Des Weiteren befindet sich im Intron 1 mit dem Mikrosatellit (CACA)n eine DNase hypersensitive Region. Für dieses Mikrosatellitenmotiv sind beim Menschen und Schaf Polymorphismen beschrieben worden, die mit der Krankheitsempfänglichkeit assoziiert auftreten (POCIOT et al., 1997; COLTMAN et al., 2001). PRAVICA et al. (1999) konnten nachweisen, dass die Längen-Polymorphismen im Mikrosatelliten für eine veränderte IFN-γ-Expression verantwortlich sind.

Tab. 10: Transkriptionsfaktoren und Response-Elemente in der Region -565 bis -155 bp des humanen IFN-γ (nach YE et al., 1996; SICA et al., 1997;

SWEETSER et al., 1998; SOUTTO et al., 2002) Response- Element

Trans-

kriptions-faktor Position (bp) Sequenz ¹)

2) -565 bis -410 ²)

T-bet -450 bis -410 AATTTCACACCTAGGTGTGAATT

RORA1 -435 bis -432 GGTC

AP1 -434 bis -431 GTCA (-)

TCF11 -434 bis -431 GTCA

Oct1 -431 bis -428 ATTT (-)

CEBPB -429 bis -426 TTGC (-)

YY-1 ca. -225 GAATGGCA

YY-1 ca. -205 ATAATGGGTC

AP1 ca. -195 GTCTGTCTCACG

NFAT ³) ca. -165 TAAAGGAAACTCTAA

1) -: Gegenstrang (Antisense-Strang). Konsensussequenzen sind unterstrichen.

2) Bereich von 155 bp, welcher bei Proteinbindungsstudien gefunden wurde (SOUTTO et al., 2002).

3) Keine weitere Angabe.

DNA-Varianten und deren Wirkung auf Merkmalswerte

Beim humanen IFN-γ sind mehrere DNA-Varianten bekannt (IWASAKI et al., 2001). In einigen Untersuchungen wurden DNA-Varianten in potenziell regulatorischen Bereichen des IFN-γ mit den Merkmalswerten der Individuen verglichen. Wie Tab. 11 zeigt, wurden bei (CA)n-Varianten Assoziationen mit der Genexpression sowie unterschiedlichen Krankheiten oder der Resistenz gegenüber Parasiten betrachtet.

Merkmalsausbildung bei IFN-γ-Knock-Out-Mäusen

Bei IFN-γ-Knock-Out-Mäusen fehlte eine Makrophagenaktivierung, so dass sich eine erhöhte Empfänglichkeit gegenüber Infektionen mit intrazellulären Erregern zeigte (DALTON et al. 1993). Ebenso haben diese Mäuse eine erniedrigte Stickstoffoxid-Produktion durch Makrophagen, einen reduzierten Serumspiegel an IgG2A- und IgG3-AK, eine verringerte Expression an Klasse-II-MHC-Molekülen auf Makrophagen und eine defiziente NK-Zellfunktion (KAMIJO et al. 1993).

Tab. 11: (CA)n-Varianten im Intron 1 des IFN-γ und deren Assoziation mit Merkmalswerten

Spezies Assoziation mit Merkmalswerten Literatur

Mensch Veränderte quantitative Genexpression PRAVICA et al. (1999) „ Graves’ Disease (Morbus Basedow),

mit Assoziation zu bestimmten Allelen

POCIOT et al. (1997);

SIEGMUND et al. (1998) „ Insulin-abhängiger Diabetes mellitus AWATA et al. (1994) „ Lung allocraft fibrosis (Fibrose des

Lungentransplantats)

AWAD et al. (1998) Schaf ¹) Resistenz gegen gastro-intestinale

Nematoden

COLTMAN et al. (2001)

1) Schafe der Rasse Soay.

3 Material und Methoden

Für die Untersuchungen wurden die in Abb. 11 aufgeführten Schritte durchgeführt.

Abb. 11: Ablaufschema der experimentellen Arbeiten 3.1 Informative Tiergruppen und Probenerfassung

In die experimentellen Arbeiten wurden 90 genetisch diverse Schweine sowie - bei einigen Rassen - deren Nachkommen aus verschiedenen Verpaarungen einbezogen (Tab. 12).

Auswahl der Gene und DNA-Bereiche Auswahl informativer Tiere

Probengewinnung

Isolierung genomischer DNA Primerdesign

PCR-Amplifikation

Isolierung der PCR-Produkte

Klonierung

Sequenzierung;

Sequenzvergleich

Analyse von Genotyp- und Allelfrequenzen RFLP-Darstellung

Tab. 12: Untersuchte Tiere

Zahl der Tiere Probenmaterial Herkunft (Rasse)

♀ ♂

Summe

Blut Sperma

Large White (LW) ¹) 10 6 16 + +

Piétrain (PI) ¹) 8 2 10 + +

Deutsche Landrasse (DL) ¹) 6 0 6 +

-Europ. Wildschwein (WS) ²) 6 0 6 +

-Meo ³) 6 0 6 +

-Tap Na ³) 6 0 6 +

-Muong Khuong ³) 6 0 6 +

-Meishan (ME) ⁴) 10 2 12 + +

F1-Tiere (PI x ME) ⁴) 9 4 13 +

-F1-Tiere (LW x ME) ⁴) 6 3 9 +

-Summe 73 17 90

1) Herdbuchtiere aus Baden-Württemberg.

2) Probenmaterial von Wildschweinen aus verschiedenen Regionen in Deutschland.

3) Stichproben der Rassen aus Nord-Vietnam.

4) Die Tiere wurden in der Versuchsstation „Unterer Lindenhof“ der Universität Hohenheim gehalten.

Im Dokument DNA-Varianten in Zytokin codierenden Genen beim Schwein (Seite 46-53)