Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg Abteilung für Tumorvirus-Charakterisierung
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Der Einfluss der humanen Papillomaviren HPV20 und HPV27 auf die Entstehung von Nicht-Melanom-Hautkrebs in Interaktion mit chronischer
UV-Bestrahlung –
Eine vergleichende Studie am HPV E6/E7-transgenen Mausmodell
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. vet. med.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Frauke Angelika Michel geb. Brand aus Heidelberg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. med. vet. Achim Gruber, Ph.D. (Cornell Univ.)
Univ.-Prof. Dr. Ethel-Michele de Villiers, D.Sc. (Univ. Pretoria)
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Achim Gruber, Ph.D. (Cornell Univ.)
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Georg Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 18. 11. 2004
Für Christian
und meine Familie
Vorab öffentlich präsentierte Teilergebnisse dieser Arbeit:
MICHEL, A. u. E-M. DE VILLIERS (2004):
Interaction of UV with HPV20 and HPV27 E6/E7 gene expression in trans- genic mice.
Posterpräsentation der 21st International Papillomavirus Conference 2004, Mexico City (Mexico); 22.- 26.02.04
Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:
MICHEL, A., A.D. GRUBER u. E-M. DE VILLIERS (2004):
Interaction of UV-light with human papillomavirus (HPV) 20 and HPV27 E6/E7 proteins in transgenic mice.
22nd Meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Olsztyn (Polen), 15.- 18.09.04
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis...I
1. Einleitung...1
2. Literaturübersicht ...3
2.1 Papillomaviren ...3
2.1.1 Taxonomische Einordnung...3
2.1.2 Medizinische Bedeutung der Papillomaviren...4
2.1.2.1 Humane Papillomaviren ... 4
2.1.2.2 Papillomaviren der Tiere... 8
2.1.3 Aufbau der Papillomaviren ...9
2.1.4 Virusproteine ...11
2.1.4.1 Das E1-Protein ... 11
2.1.4.2 Das E2-Protein ... 11
2.1.4.3 Das E4-Protein ... 12
2.1.4.4 Das E5-Protein ... 13
2.1.4.5 Das E6-Protein ... 14
2.1.4.6 Das E7- Protein ... 16
2.1.4.7 Die L1- und L2-Proteine ... 18
2.1.4.8 Die Long Control Region (LCR) oder Upper Regulatory Region (URR) ... 19
2.1.5 Die Replikation der Papillomaviren...20
2.1.6 HPV E6/E7-exprimierende transgene Tiermodelle ...22
2.2 Der Einfluss von UV-Strahlung auf die Entstehung von Nicht-Melanom- Hautkrebs ...23
2.3 Das p53-Protein in Interaktion mit UV-Strahlung ...24
2.3.1 Aufbau und Funktion ...24
2.3.1.1 Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur und DNA-Replikation... 25
2.3.1.2 Apoptose ... 26
2.3.2 p53-Mutationen in Nicht-Melanom-Hautkrebs ...27
2.3.3 Die p53-Proteinfamilie ...28
2.3.3.1 Das p63-Protein und seine Isomere ... 28
2.4 Keratinexpressionsmuster der Haut...30
2.4.1 Proliferationsmarker ...31
2.4.1.1 Keratin 6 ... 31
2.4.2 Differenzierungsmarker ...32
2.4.2.1 Involucrin ... 32
2.4.2.2 Loricrin... 33
2.4.2.3 HPV-Infektion und Keratinexpression... 34
3. Material und Methoden ...36
3.1 Material ...36
3.1.1 Spezielle Chemikalien und Zubehör ...36
3.1.2 Bakterienstämme...40
3.1.3 Zelllinien ...40
3.1.4 Plasmide...41
3.1.5 Medien und Antibiotika ...42
3.1.6 Biochemische Puffer und Lösungen ...43
3.1.7 Enzyme und Enzympuffer ...49
3.1.8 Größenmarker ...51
3.1.9 Oligonukleotide...52
3.1.10 Antikörper ...54
3.1.11 Kits ...55
3.1.12 Versuchstiere ...56
3.2 Methoden...56
3.2.1 Reinigung und Präzipitation von Nukleinsäuren ...56
3.2.1.1 Phenolextraktion... 56
3.2.1.2 Fällung von Nukleinsäuren ... 57
3.2.1.3 Reinigung von PCR-Produkten und Nukleinsäuren nach einer Restriktionsspaltung ... 57 3.2.1.4 Filtration und Dialyse von Nukleinsäuren für die Mikroinjektion 57
3.2.1.5 Konzentrationsbestimmung ... 58
3.2.2 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren...58
3.2.2.1 Agarose-Gelelektrophorese (DNA)... 58
3.2.2.2 RNA-Gele ... 59
3.2.2.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 59
3.2.2.4 Nachweis von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid... 59
3.2.2.5 Autoradiographie ... 60
3.2.3 Elution aus Agarosegelen...60
3.2.4 Modifikation von Nukleinsäuren...60
3.2.4.1 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen... 60
3.2.4.2 Entfernung des 5´-Phosphatrestes der Vektor-DNA... 61
3.2.4.3 Ligation... 61
3.2.5 Polymerase Kettenreaktion von DNA und cDNA...62
3.2.5.1 RNA-Extraktion... 62
3.2.5.2 cDNA Synthese (reverse Transkription) ... 63
3.2.5.3 Amplifikation der Ziel-DNA und cDNA ... 63
3.2.6 Transformation von Bakterien ...67
3.2.6.1 Hitzeschock ... 67
3.2.6.2 Elektroporation ... 67
3.2.7 Plasmidisolierung ...68
3.2.7.1 Schnellaufarbeitung... 68
3.2.7.2 Großaufarbeitung ... 69
3.2.8 Sequenzieren ...70
3.2.9 Herstellung der DNA-Konstrukte ...72
3.2.9.1 Aufbau der DNA-Konstrukte ... 72
3.2.9.2 Synthese und Klonierung der viralen DNA-Sequenzen ... 73
3.2.9.3 Synthese der Keratin 10-Promotor-Konstrukte... 77
3.2.9.4 Synthese der Keratin 14-Promotor-Konstrukte... 78
3.2.10 Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine aus E. coli...80
3.2.10.1 Klonierung der viralen Gensequenzen ... 81
3.2.10.2 Expression rekombinanter Proteine ... 81
3.2.10.3 Reinigung der Proteine mit der Nickel-NTA- Affinitätschromatographie... 82
3.2.11 Analyse der Proteine ...84
3.2.11.1 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) ... 84
3.2.11.2 Coomassie Blau-Färbung... 86
3.2.12 Produktion poly- und monoklonaler Antikörper...86
3.2.12.1 Immunisierung von Ratten und Kaninchen... 86
3.2.12.2 Präparation der Lymphozyten ... 87
3.2.12.3 Präparation der Myelomzellen... 87
3.2.12.4 Zellfusion ... 88
3.2.12.5 Selektion der Hybridomzellen... 88
3.2.12.6 Kultivierung der Hybridomzellen... 89
3.2.12.7 Einfrieren von Hybridomzellen... 89
3.2.13 Reinigung und Selektion der mono-und polyklonalen Antiseren ..90
3.2.13.1 Reinigung der polyklonalen Antiseren ... 90
3.2.13.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)... 91
3.2.13.3 Immunoblot (Western Blot)... 92
3.2.13.4 Indirekte Immunfluoreszenz am Gefrierschnitt ... 93
3.2.14 Herstellung und Behandlung der Versuchstiere ...93
3.2.14.1 Transgene Mäuse ... 93
3.2.14.2 UV-Bestrahlung der Versuchstiere ... 94
3.2.14.3 Narkose der Versuchstiere ... 96
3.2.14.4 Intraperitonäale Injektion von Bromodeoxyuridin (BrdU) ... 97
3.2.14.5 Entnahme der Mäusehaut ... 97
3.2.15 Kryokonservierung und Herstellung von Gewebesschnitten ...97
3.2.16 Formalinfixierung, Paraffineinbettung und Herstellung von Gewebeschnitten...98
3.2.17 Immunhistochemische Untersuchungen am formalinfixierten Gewebeschnitt...99
3.2.17.1 Immunhistochemie nach der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-
Methode (ABC-Reaktion ) ... 99
3.2.17.2 Immunhistochemie mit monoklonalen Mausantikörpern auf Mäusehaut... 101
3.2.18 BrdU-Immunhistochemie ...102
3.2.19 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung...103
3.2.20 Lichtmikroskopische Untersuchungen ...103
4. Ergebnisse...104
4.1 Nachweis von HPV20 E6/E7 und HPV27 E6/E7 in transgenen Mäusen ...104
4.1.1 Nachweis auf DNA-Ebene...104
4.1.1.1 Nachweis viraler RNA... 106
4.2 Synthese und Charakterisierung mono-und polyklonaler Antikörper gegen HPV20 E6, HPV20 E7, HPV27 E6 und HPV27 E7 ...107
4.2.1 Synthese und Charakterisierung der His-gekoppelten, viralen Proteine ...107
4.2.1.1 Expression der viralen Proteine... 107
4.2.1.2 Reinigung der exprimierten viralen Proteine mittels Nickel- Chelat-Affinitätschromatographie ... 108
4.2.2 Charakterisierung der mono-und polyklonalen Antikörper...111
4.2.2.1 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper ... 111
4.2.2.2 Charakterisierung der polyklonalen Antikörper... 112
4.2.3 Immunhistologischer Nachweis der viralen Proteine in transgener Mäusehaut...114
4.3 Ergebnisse der chronischen UV-Bestrahlung der Versuchstiere ...120
4.3.1 Histologische Veränderungen der Mäusehaut durch chronische UV-B-Bestrahlung...122
4.3.2 Vergleichende statistische Auswertung der erhaltenen Hauttumoren...134
4.4 Vergleichende immunhistologische Untersuchungen ...140
4.4.1 Proliferationanalyse der Epidermis ...140
4.4.1.1 Anzahl der Basalzellen ... 140
4.4.1.2 Bromodeoxyuridin (BrdU)-Inkorporation der Basalzellen... 142
4.4.2 Immunhistologische Untersuchung auf die Expression des Proliferationsmarkers Keratin 6 ...145
4.4.3 Immunhistologische Untersuchung auf die Expression der Differenzierungsmarker Involucrin und Loricrin ...152
4.4.3.1 Befunde der Involucrin-Expression... 152
4.4.3.2 Befunde der Loricrin-Expression ... 158
4.4.4 Immunhistologische Untersuchung auf die Expression des p53- Proteins ...164
4.4.5 Immunhistologische Untersuchung auf die Expression des p63- Proteins ...172
4.4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse ...177
4.4.6.1 Einfluss der viralen Proteine auf das Proliferationsverhalten der Epidermis ... 177
4.4.6.2 Einfluss der viralen Proteine auf die Expression der Differenzierungsmarker in der Epidermis ... 180
4.4.6.3 Einfluss der viralen Proteine auf die Expression der Transkriptionsfaktoren p53 und p63 ... 182
5. Diskussion ...184
6. Zusammenfassung ...201
7. Summary...204
8. Literaturverzeichnis ...207
9. Anhang...259
9.1 Sequenzkarten der Keratin 10-Promotor-Konstrukte ...259
9.2 Sequenzkarten der Keratin 14-Promotor-Konstrukte ...261
9.3 Zusammensetzung der zweiten Versuchsgruppe des UV- Experimentes ...265
10. Eidesstattliche Erklärung ...268 11. Danksagung...270
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin Abb. Abbildung AK Antikörper
AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat Aq. bidest doppelt destilliertes H2O
AS Aminosäure
BCC Basalzellkarzinom (Basal cell carcinoma) bp Basenpaar(e)
BSA Rinderserumalbumin
BPV Rinder-Papillomavirus (Bovine papillomavirus) C Cytosin
°C Grad Celsius
COPV Hunde-Papillomavirus (Canine oral papillomavirus) CRPV Hasen-Papillomavirus (Cottontail rabbit papillomavirus) DEPC Diethylpyrocarbonat
DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease ds doppelsträngig
E Early
E. coli Escherichia coli
EMCV Encephalomyocarditis Virus
et al. et alii (und andere) EtOH Ethanol
EV Epidermodysplasia verruciformis Fa. Firma
FCS fötales Kälberserum
x g Vielfaches der Erdbeschleunigung (9,81 m/sec²) G Guanin
ggr. geringgradig
GITC Guanidinisothiocyanat h Stunde(n)
hgr. hochgradig His Histidin
HPV Humane Papillomaviren
IgG Immunglobulin G
IPTG Isopropylthiogalactosid IRES internal ribosomal entry site
kb Kilobase(n)
L Late
LB Luria Bertani
MCS multiple cloning site mgr. mittelgradig min Minute
MOPS Morpholinpropansulfonsäure mRNA messenger (Boten-) Ribonukleinsäure
∆N deltaN, N-terminal verkürzte Isoform von p63
NMSC Nicht-Melanom-Hautkrebs (Non-Melanoma skin cancer) Nr. Nummer
OD optische Dichte
ORF offener Leserahmen (open reading frame)
ori Replikationsursprung der Papillomaviren (origin of replica- tion)
p.a. pro analysi
pA Polyadenylierungssignal PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS phosphate buffered saline
PCR Polymerasekettenreaktion
pH potentia Hydrogenii
RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm Umdrehungen pro Minute
RT Reverse Transkription
RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat ss einzelsträngig
SSC Plattenepithelkarzinom (Squamous cell carcinoma) SV40 Simian virus 40
T Thymin
TA Transaktivierung Tab. Tabelle
TBS Tris-buffered saline
TBST Tris-buffered saline/ Tween 20
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin U Unit(s)
URR upstream regulatory region UV ultraviolett
ü/N über Nacht
Vol Volumen
Einleitung 1
1. Einleitung
In den vergangenen Jahren hat sich die Anzahl der auftretenden Fälle von Nicht- Melanom-Hautkrebs drastisch erhöht. Mittlerweile zählt er weltweit zu der häufigsten Krebserkrankung der kaukasischen Bevölkerung. Die Sterblichkeitsrate ist gering, die Behandlung jedoch sehr kostenintensiv. Ätiologisch ist die Wirkung von UV- Strahlung unbestritten. In verschiedenen Studien wurde in Gewebeproben von Nicht- Melanom-Hautkrebs eine Gruppe kutaner, humaner Papillomaviren isoliert, die eine zusätzliche ätiologische Rolle in Interaktion mit UV-Strahlung vermuten lassen.
Mitglieder dieser Gruppe humaner Papillomaviren wurden zunächst in Gewebepro- ben von Nicht-Melanom-Hautkrebs aus sonnenexponierten Körperstellen von Pati- enten mit der seltenen, hereditären Erkrankung Epidermodysplasia verruciformis (EV) isoliert und als kutane EV-Typen bezeichnet. Diese EV-Typen wurden ebenfalls in Nicht-Melanom-Hautkrebs an sonnenexponierten Köperstellen immunsupprimier- ter Nierentransplantationspatienten in hohem Prozentsatz isoliert. Mittlerweile ist ihr Vorkommen in den klinisch selben Hautveränderungen auch für immunkompetente Patienten epidemiologisch bestätigt.
Papillomaviren sind mit gutartigen Hyperproliferationen wie Warzen, Papillomen, epithelialen Zysten und Keratoacanthomen in der Haut sowie gutartigen Wucherun- gen im Genitaltrakt, Condylomata acuminata, assoziiert. Für high-risk HPV-Typen dieser Virusfamilie ist eine Beteiligung an der Entstehung in über 90% aller Zervix- karzinome bestätigt und ebenfalls bei anderen Anogenital- und Kopf-Hals-Tumoren sehr wahrscheinlich.
Die Funktion der high-risk Typen wird maßgeblich durch die transformierenden Eigenschaften der viralen Onkoproteine E6 und E7 bestimmt. Im Gegensatz dazu ist für die kutanen Papillomaviren bisher wenig über ihre Wirkungsweise auf zellulärer Ebene und in Interaktion mit UV-Strahlung bekannt. Einige Virustypen der EV- Gruppe werden durch UV-Strahlung aktiviert und sind in der Lage, proapoptotische Proteine zu binden.
Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Rolle der viralen E6- und E7-Proteine eines Vertreters der mit Nicht-Melanom-Hautkrebs assoziierten EV-Typen (z.B. HPV20) in
Einleitung 2
Verbindung mit chronischer UV-B-Bestrahlung bei der Tumorentstehung genauer untersucht werden. Als Vergleich wurde der kutane Typ HPV27 herangezogen, der aus gutartigen Handwarzen isoliert wurde und nicht zur Gruppe der EV-Typen ge- hört.
Die möglicherweise unterschiedliche Fähigkeit der viralen E6- und E7-Proteine bei- der HPV-Typen, die entstandenen Tumoren zu malignen Läsionen zu transformieren, sollte weiterführend untersucht werden und funktionelle Unterschiede dargestellt werden.
Um dem komplexen System der Haut und dem Einfluss des Immunsystems gerecht zu werden, wurde ein transgenes Mausmodell generiert, das die viralen Proteine E6 und E7 in suprabasalen Anteilen der Epidermis unter Kontrolle des Keratin 10-Pro- motors exprimiert. Die Tiere wurden anschließend einer lokalen, chronischen UV-B- Bestrahlung unterzogen. Die Haut und Hauttumoren wurden weiterführend histolo- gisch und immunhistochemisch analysiert. Hinweise auf die unterschiedliche Wir- kungsweise der beiden kutanen HPV-Typen sollte anhand des Einfluss der viralen E6- und E7-Proteine auf die Expression verschiedener Zytokeratine und der des Tumorsuppressorproteins p53 und seines p53-Familienmitglieds, p63, näher unter- sucht werden.
Literaturübersicht 3
2. Literaturübersicht 2.1 Papillomaviren
2.1.1 Taxonomische Einordnung
Papillomaviren bilden die große und heterogene Virusfamilie der Papillomaviridae.
Sie gehören zur Gruppe der doppelsträngigen, unbehüllten, ikosaedrischen DNA- Viren. Sie infizieren Plattenepithel der Haut und Schleimhaut. Bisher sind 118 ver- schiedene Typen und weitere candHPV-Typen (PCR-generierte Papillomaviren) komplett sequenziert sowie 300 Fragmente isoliert, kloniert und teilweise sequenziert worden (bisher keine taxonomische Einordnung) (Übersicht DE VILLIERS et al., 2004). Spezifische Virustypen sind in Menschen, Primaten, Halbweltaffen, Huftieren, Raubtieren, Elefanten, Nagetieren, Vögeln, Meeressäugern und sogar Reptilien isoliert worden. In Abbildung 1 sind 96 humane und 22 Papillomaviren der Tiere in einem phylogenetischen Baum dargestellt. Die Einteilung in Genera orientiert sich an einer Sequenzhomologie von mindestens 50% und die Unterteilung in Species von 50% bis 60%. Virustypen werden anhand von Sequenzunterschieden im hochkon- servierten L1-Gen (Hauptstrukturprotein des Viruscapsids) von mindestens 10%
klassifiziert, Subtypen von 2% bis 10% und Varianten von maximal 2% (DE VILLIERS et al., 2004).
HPV20 wird gemeinsam mit anderen kutanen Papillomaviren der sogenannten Epidermodysplasia verruciformis (EV-) Gruppe dem Genus der Beta-Papillomaviren zugeordnet. HPV27 wird im Gegensatz dazu als kutaner Typ dem Genus der Alpha- Papillomaviren eingegliedert, der die große Gruppe der mukosalen bzw. genitalen Typen umfasst.
Literaturübersicht 4
Abbildung 1: phylogenetischer Stammbaum der Papillomavirusfamilie (DE VILLIERS et al., 2004)
2.1.2 Medizinische Bedeutung der Papillomaviren 2.1.2.1 Humane Papillomaviren
Mukosale/ Genitale Typen
Bereits Mitte der siebziger Jahre wurde ein Zusammenhang zwischen Papillomaviru- sinfektion und der Entstehung des Zervixkarzinoms postuliert (ZUR HAUSEN et al., 1974; MEISELS und FORTIN, 1976). 1995 wurden HPV16 und HPV18 von der WHO (World Health Organization) als auslösende Faktoren für die Entstehung von Gebär- mutterhalskrebs anerkannt (IARC, Lyon, 1995; WALBOOMERS et al., 1999). Welt- weit zählt dieser Tumor zu der zweithäufigsten, in Entwicklungsländern zu der häu- figsten Krebserkrankung der Frauen (FRANCO et al., 2003; ROHAN et al., 2003;
Literaturübersicht 5
WILSON et al., 2004). 90-98% aller invasiv wachsenden Zervixkarzinome enthalten Papillomavirus-DNA (MUNOZ et al., 2003; BOSCH und DE SANJOSE, 2003). Welt-
eit wird meistens HPV16 (46-68%), HPV18 (10-14%), HPV45 (2-8%) und HPV31
wird in 13 bis 15% der Fälle Papillomavirus-DNA de-
te MANN, 1994; MUNOZ et al., 2003). Die
G wird unterteil , 43, 44, 54,
61, 70, 72) und high-risk (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 73, 82) HPV- Typen (MUNOZ et al., 2003). Diese Unterteilun er Fähigkeit, Keratino- zyten zu transformieren. High-risk Typen sind mit invasiv wachsenden Zervixkarzi-
no n hrend low-risk Typen
gutartige, genitale Warzen, Condylomata acuminata, hervorrufen (zur HAUSEN,
20 e, genitale Läsionen der Zervix werden
an ale je nach Schweregrad klassifiziert in cervical intra- epithelial neoplasia (CIN) 1 bis 3. CIN3-Läsionen sind charakterisiert als Carcinoma in chließlich in invasiven Gebärmutterhalskrebs über.
w
(2-7%) in Läsionen nachgewiesen (CLIFFORD et al., 2003). Bei Frauen mit unauffäl- ligem zytologischen Befund
ktiert (DE VILLIERS et al., 1992; SCHIFF
ruppe der genitalen HPV-Typen t in low-risk (6, 11, 40, 42
g beruht auf d
men und anderen, anogenitalen Tumore assoziiert, wä
02; BJORGE et al., 2002). HPV-infiziert hand histologischer Merkm
situ und gehen s
Tabelle 1: Entwicklung „high-risk“ HPV-infizierter Läsionen zum invasiv wachsenden Zervix- karzinom (ZUR HAUSEN, 1996)
Genetische Modifikationen durch „high-risk“
HPV-Typen Klinischer Effekt
Induktion chromosomaler Instabilität Keine sichtbaren Veränderun- gen
Unterbrechung zellulärer Signalkaskaden, die mit
viralen Onkogenen interagieren „Low grade“ CIN Integration der viralen DNA und teilweise Deregula-
tion der E6/E7 Onkoproteinsynthese „High grade“ CIN
Unterbrechung zellulärer Signalkaskaden unter parakriner Kontrolle, welche die Transkription der viralen Onkogene unterdrückt
Carcinoma in situ
Verlust der immunologischen Kontrolle über HPV- modifizierte Zellen
Invasiv wachsende Tumoren
Literaturübersicht 6
Von der primären Infektion bis zum tatsächlichen Ausbruch der Krebserkrankung bis 30 Jahre. Die maligne Transformation der immortalisierten Zellen
Entstehung von NMSC, der ebenfalls an sonnenexponierten Stellen auftritt. In 75%
liegen meist 20
wird durch Co-Faktoren unterstützt wie Immunsuppression (KIVIAT et al., 1993; HO et al., 1994; PALEFSKY, 1994, PALEFSKY, 2000), genetische Prädisposition (STEENBERGEN et al., 2004; HORNG et al., 2004), orale Kontrazeptiva (ARBEIT et al., 1996; DE VILLIERS, 2003; SCHIFFMAN und CASTLE, 2003), die Anzahl der Sexualpartner (KARLSSON et al., 1995; FRANCESCHI et al., 2002; WINER et al., 2003) und Tabakkonsum (HARRIS et al., 2004).
In verschiedenen, epidemiologischen Studien wurde in 34% der untersuchten Fälle eine Beteiligung von Papillomaviren an der Entstehung von Kopf-Hals-Karzinomen festgestellt. 59% der Tumoren der Mundhöhle, 43% des Pharynx, 42% der Tonsillen und 34% des Larynx wurden positiv auf HPV getestet. Auch hier wurde hauptsäch- lich HPV16 isoliert (MC KAIG et al., 1998; SISK et al., 2000; HERRERO et al., 2003, LI et al., 2004; DE VILLIERS et al., 2004).
Kutane Typen
Die kutanen Papillomaviren stellen eine sehr große und heterogene Gruppe inner- halb der Familie der Papillomaviridae. Sie infizieren über Mikroläsionen das verhorn- te Plattenepithel der Haut und induzieren die Bildung vielgestaltiger Warzen (Verru- cae vulgaris, Verrucae plantares, Verrucae planae juveniles). Einzelne Virustypen können spezifischen Veränderungen zugeordnet werden (Übersicht ZUR HAUSEN, 1996; DE VILLIERS, 1998). Generalisierte Warzenbildung tritt bei der seltenen here- ditären Erkrankung Epidermodysplasia verruciformis (EV) auf. Diese Erkrankung beruht auf nonsense-Mutationen in zwei Genen auf Chromosom 2 und 17, die eine verringerte, zelluläre Immunität bewirken (RAMOZ et al., 2000; RAMOZ et al., 2002).
In 30 bis 50% der Fälle entarten diese Warzen an sonnenexponierten Körperstellen in Nicht-Melanom-Hautkrebs (NMSC). In den Warzen und den malignen Läsionen wurden immer wieder ähnliche, kutane Papillomaviren detektiert (ORTH et al., 1977;
ORTH et al., 1979), die schließlich als EV-Typen bezeichnet wurden und heute dem Genus der Beta-Papillomaviren zugeordnet werden (DE VILLIERS et al., 2004).
Immunsupprimierte Patienten leiden nach Organtransplantationen häufig an der
Literaturübersicht 7
der untersuchten Fälle konnten hier ebenfalls Typen der EV-Gruppe isoliert werden (SHAMANIN et al., 1996, MEYER et al., 2003; STOCKFLETH et al., 2004). Epide-
004). Auffallend ist die Bandbreite der isolierten HPV-Typen, die sich auch in
g mit UV-Strahlung und Veränderungen des Immunsystems ist erst teilweise eklärt. Funktionelle Untersuchungen des viralen Promotors in Interaktion mit Zytoki- nen wie Il-17 und IFNγ, die auch bei Psoriasispatienten erhöht sind, haben eine
ng V-Typen im Gegensatz zu anderen kutanen
al., 1999) und mehrere EV-Typen sind in der Lage, die proapoptotischen Eigen- miologische Daten zeigen auch bei immunkompetenten Patienten mit NMSC und Vorstufen wie Aktinische Keratose eine Verbindung zu HPV-Typen der EV-Gruppe (DE VILLIERS et al., 1997; PFISTER et al., 2003; MASINI et al., 2003; HARWOOD et al., 2
gesunder, unveränderter Haut weltweit in 40% bis 70% der untersuchten Fälle isolie- ren lässt. Eine Korrelation zwischen einzelnen Typen und spezifischen Veränderun- gen ist deshalb bisher nicht möglich. (FORSLUND et al., 1999; ANTONSSON et al., 2003). Schon aus der Haut von Babys werden eine Fülle von kutanen und auch mukosalen HPV-Typen ohne direkte klinische Folgen isoliert. Man geht deshalb von einer Rolle der Papillomaviren als Kommensalen der Haut aus, die in Interaktion mit UV-Strahlung und/ oder Immunsuppression zur Entartung in NMSC führen (JENSON et al., 2001; HARWOOD und PROBY, 2002; ANTONSSON et al., 2003; AUBIN et al., 2003; FORSLUND et al., 2003).
Die besondere Rolle des Immunsystems bestätigt sich in der hohen Inzidenz von HPV-DNA in Psoriasispatienten (Kinder: 38,5%, Erwachsene: 35,7%) im Vergleich zur gesunden Haut (6,7-10,1%) (MAHE et al., 2003, MAJEWSKI und JABLONSKA, 2003).
Die Funktionsweise der EV-Typen hinsichtlich der Entstehung von NMSC in Zusam- menhan
g
Aktivieru der Promotorregion in E
HPV-Typen gezeigt (RUHLAND und DE VILLIERS, 2001). Psoriasispatienten stellen deshalb ein ideales Replikationsmilieu für Papillomaviren dar (DE VILLIERS, 2001).
Dies erklärt den erhöhten Antikörpertiter gegen virale Proteine der EV-Typen in der Haut dieser Patienten (MAJEWSKI und JABLONSKA, 1995). Analog zu den Zytoki- nen ist die Aktivierung des viralen Promotors durch UV-Bestrahlung sehr differenziert (DE VILLIERS et al., 1999). Einzelne HPV-Typen besitzen für das UV-induzierte Tumorsuppressorprotein p53 eine p53-binding site im viralen Promotor (PURDIE et
Literaturübersicht 8
schaften des p53-induzierten Proteins Bak auszuschalten (JACKSON und STOREY, 2000).
2.1.2.2 Papillomaviren der Tiere
In der Familie der Papillomaviridae bilden die Papillomaviren der Tiere eine große Gruppe. In papillomatösen und fibropapillomatösen Veränderungen nahezu jeder Spezies wurden wirtsspezifische Papillomaviren isoliert, in Primaten, Halbweltaffen, Huftieren, Raubtieren, Vögeln, Elefanten, Meeressäugern, Reptilien und in Nagetie- ren mit Ausnahme der Labormäuse. Sie werden den Genera der Delta- bis Pi-Papil- lomaviren zugeordnet und haben für die Papillomavirusforschung eine große Be- deutung. Anfang des letzten Jahrhunderts konnten die tumorigenen Eigenschaften des Cottontail Rabbit Papillomavirus (CRPV) durch Infektionsversuche in Verbindung mit Chemikalien und durch einen Wirtswechsel dargestellt werden (SHOPE, 1933).
Viele Papillomaviren der Tiere zeichnen sich durch abweichende Anordnung und Anzahl der offenen Leseraster (open reading frames, ORFs) aus. Papillomaviren der Vögel besitzen kein E6 und E7 (TACHEZY et al., 2002), die der Hirsche, Rentiere und der Elche besitzen einen kurzen, zusätzlichen ORF, E9, mit transformierendem Potential (ERIKSSON et al., 1994), die der Feliden zeichnen sich durch eine sehr
S et al., 2004) und E5-Proteine verschiedener Rinder-Papillomaviren
illomavirus), große URR mit einer Länge über 1200 bp aus (SUNDBERG et al., 2000; DE VILLIER
(Bovine Papillomavirus, BPV) und das E8-Protein von BPV4 besitzen transformie- rende Eigenschaften (O´BRIEN et al., 2001). Grundsätzlich scheinen die einzelnen ORFs der Tierviren unterschiedlich zu denen der humanen Papillomaviren zu funktionieren, was sich medizinisch in der Bildung von Fibropapillomen äußert (NARECHANIA et al., 2004). Die Papillomaviren der Tiere werden heute genutzt, um im Wirtstier den genauen Replikationszyklus zu studieren und Vakzinierungsversu- che durchzuführen. Beliebte Modelle sind das COPV (Canine Oral Pap
das CRPV (Cottontail Rabbit Papillomavirus) und das ROPV (Rabbit Oral Papilloma- virus) (BREITBURD et al., 1997; NICHOLLS et al., 1999; NICHOLLS und STANLEY, 2000; PEH et al., 2002).
Literaturübersicht 9
Besondere medizinische und wirtschaftliche Bedeutung haben die Rinder-Papilloma- viren.
In Rindern werden durch BPV-Infektionen, Hautwarzen (BPV1 und 2), Papillomatose und Tumorbildung des oberen Gastrointestinaltraktes (BPV4) und Papillomatose der
n (JARRETT et al., 1978; CAMPO et al., 1992).
esondere Bedeutung erfahren die Rinder-Papillomaviren durch einen Wirtswechsel in Pferde, Esel und Maultiere. Hier führen Infektionen mit BPV1 und BPV2 zur Bil-
e und COOK, 1951). Dieser lokal invasiv wach-
hr möglich ist. Eine Streuung in andere Organe ist möglich, ebenso wie die maligne Entartung in Platten- epithelkarzinome, die meist eine Euthanasie der Tiere notwendig macht (NICHOLLS und STANLEY, 1999).
2.1.3 Aufbau der Papillomaviren
Papillomaviren sind 55 nm groß und besitzen die Form eines Icosaeders, die aus 72 Capsomeren gebildet wird. Die Virionen enthalten ein ringförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül von 6800 bis 8400 Basenpaaren (bp) Länge, das einen G/C-Gehalt von 40 bis 60% enthält. In ausgereiften Virionen ist die virale DNA mit den Histonpro- teinen H2a, H2b, H3 und H4 der Wirtszelle zu einem Chromatin-ähnlichen Komplex
ufbau, der hier am Beispiel von BPV1 dargestellt ist.
Zitzen, des Euters (BPV1, 5 und 6) und des Penis (BPV1) sowie Blasenkrebs (BPV1 und 2) hervorgerufen (CAMPO, 2002). Blasenkrebs und die Krebserkrankungen des oberen Gastrointestinaltraktes sind auf eine Virusinfektion in Verbindung mit chroni- scher Immunsuppression und chemische Karzinogenese durch die Aufnahme von Adlerfarn zurückzuführe
B
dung d s Equinen Sarcoids (OLSON
sende fibroblastische Hauttumor ist die häufigste Hauterkrankung der Pferde und zeichnet sich nach Entfernung durch eine hohe Rezidivrate und Therapieresistenz aus. Eine Transkription der frühen (early, E) und späten (late, L) Gene konnte im Equinen Sarcoid nachgewiesen werden, aber es wurden bisher nie komplette Viren isoliert (NASIR und REID, 1999; CHAMBERS et al., 2003).
COPV induziert Papillomatose des Mund- und Rachenraumes, die so stark ausge- prägt sein kann, dass eine Nahrungsaufnahme nicht me
assoziiert. Die DNA aller Papillomavirustypen besitzt einen grundsätzlich ähnlichen A
Literaturübersicht 10
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Genoms der Papillomaviren am Beispiel von BPV1 (VAN REGENMORTEL et al., 2000)
Nur ein Strang der viralen DNA wird transkribiert und codiert acht bis zehn offene eseraster (ORF), sie werden in sogenannte frühe (E) und späte (L) ORFs eingeteilt.
Diese Einteilung erfolgte in Analogie zur Synthese während des viralen Replikations- en für regulatorische Proteine, die an der Virusreplikation,
nach Virustyp, an der malignen Transformation der L
zyklus. E1 bis E10 codier der viralen Persistenz und, je
Wirtszelle beteiligt sind. Die humanen Papillomaviren besitzen im Gegensatz zu vielen Papillomaviren der Tiere meist keine ORFs für E3, E8, E9 und E10 (Übersicht DE VILLIERS et al., 2004). L1- und L2-Proteine bilden das Viruscapsid. Zwischen den ORFs der E- und L-Proteine liegt ein wenig konservierter, nichtkodierender Bereich, der als long control region (LCR) oder upstream regulatory region (URR) bezeichnet wird. Die URR enthält den Ursprung der viralen Replikation (origin of replication, ori), den E6/E7-Promotor und mehrere Bindungsstellen für E2 und eine für E1 sowie eine sogenannte enhancer- und silencer-Region. Hier binden verschie- dene zelluläre Transkriptionsfaktoren.
Literaturübersicht 11
2.1.4 Virusproteine 2.1.4.1 Das E1-Protein
Das E1-Protein umfasst bei den Papillomaviren den größten ORF und ist sowohl bei den mucosalen, als auch den kutanen Typen hochkonserviert (CHOW und BROKER, 1994). Es zeigt eine große Ähnlichkeit zum SV40 large T antigen (SEO et al., 1993).
Das E1-Protein ist essentiell notwendig für die virale Replikation (CHOW und BROKER, 1994). Eine Unterbrechung des E1-ORF unterbindet sowohl die transien- te, als auch die stabile, virale Replikation (GROFF und LANCASTER, 1986;
RABSON e
t al., 1986). Das E1-Protein ist im Zellkern lokalisiert und wird sowohl am -, als auch am C-terminalen Ende phosphoryliert (THORNER et al., 1988;
SANTUCCI et al., 1990), bindet und hydrolisiert ATP (SUN et al., 1990; SEO et al., en enzymatische Funktionen
onservierte Regionen; sie N
1993) und besitzt als einziges Protein der Papillomavir
als ATPase und Helicase (YANG et al., 1993, SEO et al., 1993). Die E1-Helicase ist für die Replikation der viralen, doppelsträngigen DNA in Interaktion mit zellulären Faktoren verantwortlich. Die DNA-Replikation wird von der URR gesteuert, indem monomeres E1 Dimere bildet, die sich zu Hexameren assoziieren und über eine spezifische, 18 Nukleotide umfassende, palindromähnliche Sequenz im origin of replication (ori) binden (HOLT et al., 1994; ENEMARK et al., 2000; AUSTER und JOSHUA-TOR, 2004). Dieser Prozess wird in vivo durch das E2-Protein katalysiert (MOHR et al., 1990; BERG und STENLUND, 1997). In Interaktion mit E2, der DNA- Polymerase α (BONNE-ANDREA et al., 1995) und der Hauptuntereinheit des DNA- Einzelstrang-bindenden Proteins, replication protein A (RPA) (LOO und MELENDY, 2004) löst E1 mit der viralen DNA verbundene Histone, entwindet die überspiralisier- te Konformation und induziert die Synthese viraler Genomkopien (van WILSON et al., 2002).
2.1.4.2 Das E2-Protein
Das E2-Protein fungiert als sequenzspezifischer Transaktivator oder -repressor der Transkription und ist Co-Faktor der viralen DNA-Replikation. Die E2-Bindungs-stellen innerhalb der URR sind in allen Papillomaviren stark k
Literaturübersicht 12
variieren aber in ihrer Anzahl (O´CONNOR et al., 1995). Der E2-ORF codiert drei nukleäre Proteine, das gesamte E2-Protein fungiert als transkriptioneller Transakti- vator (E2TA), katalysiert die Bindung von E1 an die URR (MOHR et al., 1990; SEO et al., 1993b; CHOW und BROKER, 1994) und aktiviert verschiedene virale Promotoren über sogenannte E2 responsive enhancer elements (E2RE). Zwei weitere E2-Pro-
ine sind um das N-terminale Ende verkürzt. Sie unterdrücken E2TA Eigenschaften durch kompetetive Hemmung an DNA-Bindungsstellen oder durch Bildung von
werden deshalb als E2 transkriptional repressors
xprimiert und liegt als Dimer vor OORBAR et al., 1989). Läsionen kutaner Typen zeigen eine Expression in den basalen Anteilen des verhornten Plattenepithels, während genitale Läsionen durch ekennzeichnet sind. Mit Zunahme des Malignitätsgra- te
Heterodimeren mit E2TA. Sie
(E2TR) bezeichnet und regulieren so die Virusreplikation (LAMBERT, 1991). Im N- terminus ist die Transactivation Domain (TAD) von E2 lokalisiert, ihre Funktionalität ist notwendig für die Virusreplikation (CHIANG et al., 1992), den durch E2-induzier- ten Zellzyklusarrest in der G1/S-Phase (GOODWIN et al., 1998) und die Rekrutierung des TATA binding protein (TBP) und des Transkriptionsfaktors TFIIB (YAO et al., 1998) an die TATA box der URR. E2 reguliert so direkt die E6-Transkription (HOU et al., 2000). AMF-1 interagiert mit der TAD des E2-Proteins von BPV1 und unterstützt die E2-gesteuerte Transkription (BREIDING et al., 1997).
Die E2-Proteine einiger Papillomaviren besitzen in ihrem C-Terminus einen Bereich, der mit dem bZIP-Motiv von C/EBPβ interagiert. C/EBP ist eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die während der Regulation der Keratinozytendifferenzierung rekrutiert werden und möglicherweise auch durch E2 beeinflusst werden (HADASCHIK et al., 2003).
2.1.4.3 Das E4-Protein
Der ORF des E4-Proteins einiger Papillomaviren besitzt kein Startcodon, so dass E4 als Bestandteil eines E1/ E4-Fusionsproteins exprimiert wird. Dieses Fusionsprotein ist in HPV-infiziertem Epithel zytoplasmatisch e
(D
eine suprabasale Expression g
des der Läsionen sinkt der Gehalt an E1/ E4-Fusionsprotein (EGAWA et al., 2000;
NICHOLLS et al., 2001; MIDDLETON et al., 2003). Das E1/ E4-Fusionsprotein ist mit
Literaturübersicht 13
Keratinfilamenten des cornified cellular envelope (CCE) und Keratin18 assoziiert (DOORBAR et al., 1991; ROGEL-GAILLARD et al., 1993, BRYAN und BROWN, 2000; WANG et al., 2004). Ein N-terminales Leucin-reiches Motiv im HPV16 E1/ E4- Fusionsprotein ruft einen Keratinkollaps hervor (ROBERTS et al., 1997), indem der Keratintransport zwischen der löslichen in der unlöslichen Phase unterbunden wird (WANG et al., 2004). Außerdem arretiert es den Zellzyklus in der G2-Phase (DAVY et al., 2002) und bindet über eine DEAD-box-protein (DBP)-Bindungsstelle im C- terminus DBP (DOORBAR et al., 2000). Das Fusionsprotein von HPV16 induziert Apoptose, indem es Mitochondrien von den Mikrotubuli löst und am Zellkern lokali- siert (RAJ et al., 2004). Für COPV ist ein funktionelles E4-Protein für eine vollständi- ge Virusreplikation notwendig (PEH et al., 2004).
2.1.4.4 Das E5-Protein
Das E5-Protein besitzt onkogene Eigenschaften, die zunächst für BPV1 näher untersucht wurden (BERGMAN et al., 1988). In BPV1 codiert der ORF für E5 ein E5A- und E5B-Gen. Das E5A-Protein besitzt transformierende Eigenschaften in Fibroblasten, die durch E5B reguliert werden (WLAZLO et al., 2003). Genitale Typen
eceptor (EGFR), der biochemische Kaskaden auslöst, die zur berexpression von Protoonkogenen führen und das Zellwachstum stimulieren.
Zusätzlich unterbindet E5 die Expression des Tumorsuppressorgens p21Waf1/Cip und ntrolle aus (TSAI und CHEN, 2003). Die transformie- besitzen nur ein E5-Protein, das ähnlich wirksam ist. Es ist ein hydrophobes, memb- rangebundenes Protein, das mit dem endoplasmatischen Retikulum, nukleären Membranen und, im Gegensatz zu BPV1 E5, perinuklär, statt cis-medial, am Golgi- apparat assoziiert ist (GIESWEIN et al., 2003). Es oligomerisiert über hydrophobe Regionen und bindet an die 16kD große, pore-forming protein-Komponente der vakuolären ATPase (CONRAD et al., 1993). Diese Bindung aktiviert den Epidermal Growth Factor R
Ü
schaltet damit die Zellzyklusko
rende Wirkung von E5 wird zusätzlich verstärkt durch Komplexbildung mit und der Aktivierung des Platelet-derived Growth Factor beta Receptor (PDGFbetaR) (NAPPI et al., 2002). Das E5-Protein reguliert die Antigenpräsentation der infizierten Zellen, indem der Transport des Major Histocompatibility Complex1 (MHC1) an die Zellober-
Literaturübersicht 14
fläche verhindert wird. MHC1 verbleibt im Golgiapparat. Zusätzlich wird der Anteil an schweren MHC1- und RNA-Ketten reduziert (ASHRAFI et al. 2002).
Kutane HPV-Typen, die dem Genus der Beta-Papillomaviren angehören, besitzen kein ORF für E5 (DE VILLIERS et al., 2004). Für HPV2, als Vertreter der kutanen Typen des Genus der Alpha-Papillomaviren, konnte ein E5-Protein identifiziert werden. Dieses E5-Protein zeigt in vitro Eigenschaften der genitalen Typen wie Verringerung der Expression von MHC1-Molekülen an der Plasmamembran und Modulierung der EGF-gesteuerten Aktivierung der erk1/2 MAP Kinase (CARTIN und ALONSO, 2003).
2.1.4.5 Das E6-Protein
Das E6-Protein ist ungefähr 160 Aminosäuren groß und enthält vier C-X-X-C Motive, die zwei Zinkfinger-Bindungsmotive ausbilden (GROSSMAN und LAIMINS, 1989).
E6-Proteine der high-risk Typen werden im Gegensatz zu low-risk-Typen über nuclear localization signals (NLS) im Zellkern akkumuliert (TAO et al., 2003). Daraus resultieren Unterschiede in der Interaktion mit Transkriptionsfaktoren und anderen zellulären Proteinen. Das E6-Protein der high-risk HPV-Typen fungiert als Onkopro- tein, es immortalisiert primäre Mammazellen (HAWLEY-NELSON et al., 1989; BAND et al., 1993; DALAL et al., 1996; GAO et al., 2001), ist maßgeblich notwendig für die maligne Transformation der Keratinozyten (VON KNEBEL DOEBERITZ et al., 1992, 1993; VON KNEBEL DOEBERITZ et al., 1994). HPV16 E6 induziert im transgenen Tiermodell maligne Tumoren (SONG et al., 1999; SONG et al., 2000). In vitro ist der maligne Phänotyp auch bei Typen der EV-Gruppe vom E6-Protein abhängig (HI- RAIWA et al., 1993).
Das onkogene Potential einiger E6-Proteine wird maßgeblich durch seine Interaktion mit dem Tumorsuppressorprotein p53 bestimmt. High-risk Typen, HPV16 und 18 (WERNESS et al., 1990) sowie einige low-risk und kutane HPV-Typen binden an p53 (ELBEL et al., 1997). High-risk HPV E6-Proteine binden jedoch nicht nur an die C- terminale Bindungsstelle sondern auch an der zentralen DNA-Bindungsdomäne des p53 Proteins (LI und COFFINO, 1996). High-risk E6-Proteine degradieren p53 (SCHEFFNER et al., 1990; CROOK et al., 1991), indem E6 an die Ubiquitin-Protein
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Ligase E6-associated protein (E6-AP) bindet und mit p53 interagiert. Durch Ubiquitin- konjugierende Enzyme (UbcH5, UbcH7 oder UbcH8) wird p53 polyubiquitiniert und
(ZIMMERMANN et al., 1999; PATEL et al., 1999), den Interferon regulato- factor3 (IRF3) (RONCO et al., 1998) und c-Myc (GROSS-MESILATY, 1998). Die vielfältigen Aktivitäten von E6 sind nicht nur auf den Zellkern beschränkt. Es kann als schließlich dem proteosomalen Abbau zugeführt (SCHEFFNER et al., 1993;
SCHEFFNER, 1998). Dadurch ist die Zellzykluskontrolle am G1/S- und G2/M- Checkpoint unterbrochen, genetische Veränderungen werden nicht repariert und führen zur malignen Transformation der high-risk HPV-infizierten Zellen (MANTOVANI und BANKS, 2001; FEHRMANN und LAIMINS, 2003). Kutane und low-risk Typen initiieren keinen proteosomalen Abbau von p53 (STEGER und PFISTER, 1992; Übersicht DE VILLIERS, 1998). Sie degradieren jedoch ebenso wie high-risk E6 Proteine das p53-induzierte, proapoptotische Protein Bak (THOMAS und BANKS,1999; JACKSON et al., 2000). Einige kutane Typen verhindern so nach UV- Bestrahlung die Induktion der Apoptose (JACKSON und STOREY, 2000).
E6-Proteine der high-risk HPVs können indirekt Telomerase aktivieren und unkontrol- lierte Proliferation unterstützen (KLINGELHUTZ et al., 1996), indem E6 den Promotor der human telomerase reverse transcriptase (hTert) aktiviert, die eine katalytische Untereinheit der Telomerase codiert (GEWIN und GALLOWAY, 2001). Neben der Degradierung von p53 ist diese Funktion wichtig zur Induktion genomischer Instabili- tät in HPV-infizierten Zellen (DUENSING und MÜNGER, 2004).
Im C-Terminus des E6-Proteins befindet sich ein PDZ-ligand motif. High-risk HPV E6-Proteine interagieren über dieses Ligandenmotiv mit dem menschlichen Homolog des Drosophila discs large (hDlg) Tumorsuppressorproteins (KIYONO et al., 1997;
LEE et al., 1997), mit dem menschlichen Homolog Drosophila Scribble (hScrib) (NAKAGAWA und HUIBREGTSE, 2000), mit dem Multi-PDZ-containing protein (MUPPI1) (LEE et al., 2000) und mit der Membrane-associated guanylate kinase (MAGI1) (GLAUNSINGER et al., 2000). E6 degradiert diese Proteine (NAKAGAWA und HUIBREGTSE, 2000; LEE et al., 1997; GLAUNSINGER et al., 2000), manifes- tiert so seine transformierenden Eigenschaften in vitro (KIYONO et al., 1997;
WATSON et al., 2003) und fördert epitheliale Hyperplasie in vivo (NGYUEN, 2003).
Außerdem bindet E6 weitere Transkriptionsfaktoren und Coaktivatoren wie p300/CBP
ry
Literaturübersicht 16
Regulator der Signaltransduktion fungieren, indem es mit dem Calcium-bindenden
it Rb als auch für die transktriptionelle Kofaktorfunktion
on des E7-Proteins ist seine Bindung an Mitglieder der Retinoblastoma (Rb-) Tumorrepressorfamilie p110Rb, p107 und Protein Erc55 (CHEN et al., 1995), dem vermeintlichen GAP-Protein, E6TP (GAO et al., 1999; GAO et al., 2001; SINGH et al., 2003), mit dem Adhäsionsprotein Paxillin interagiert (TONG und HOWLEY, 1997) und durch Bindung an Tumor Nekrosefaktor (TNF) R1 die TNF-induzierte Apoptose verhindert (FILIPPOVA et al., 2002). E6- Proteine der low- und high-risk Typen interagieren mit TRIP-Br1, das die transkriptio- nelle Integration des E2F/DP1/Rb-Pathways und die antagonistisch dazu ausgerichte- te Unterdrückung der Cyclin abhängigen Kinase p16INK4 steuert. E6 degradiert TRIP-Br1 nicht, so dass der Zellzyklus promovierende Transkriptionsfaktor E2F/DP1
sowohl für E7 in Interaktion m
von E6 als Ziel dient (GUPTA et al., 2003). HPV16 E6 unterdrückt außerdem die Expression einiger Strukturproteine des cornified cellular envelope und moduliert Cox1 und Nag-1, zwei Gene, die in Entzündungsreaktionen involviert sind (DUFFY et al., 2003).
2.1.4.6 Das E7-Protein
Das E7-Protein besitzt eine Länge von ca. 100 Aminosäuren. Im N-terminus sind die Regionen CR1HD (CH-1) und CR2HD (CH-2) lokalisiert, die den konservierten Regionen 1 und 2 des Adenovirus E1 (AdE1)-Proteins und dem SV40 large T antigen der Polyomaviren ähneln (PHELPS et al., 1988). Das C-terminale Ende ist durch zwei Zinkfingerbindungsdomänen gekennzeichnet, die zwei C-X-X-C Motive enthalten und dimerisieren können (BARBOSA et al., 1989; PHELPS et al., 1992).
Die C-terminale Zinkfingerbindungsdomäne ist für die funktionelle und strukturelle Einheit des E7-Proteins notwendig und ähnelt strukturellen Domänen im E6-Protein (MAVROMATIS et al., 1997).
Das E7-Protein besitzt alleine und in Kombination mit dem E6-Protein transformie- rende Eigenschaften in verschiedenen Zellarten (PHELPS et al., 1988; MÜNGER et al., 1989) und induziert durch Expression unter Kontrolle des Keratin 14-Promotors epitheliale Tumoren im transgenen Mausmodell (HERBER et al., 1996).
Von herausragender Bedeutung für die Funkti
Literaturübersicht 17
p130 (DYSON et al., 1989; DYSON et al., 1992). Die Rb-Proteine steuern den Zellzyklus in der G1/S-Phase. Rb ist hypophosphoryliert und bindet so Mitglieder der E2F/DP Transkriptionsfaktorenfamilie (kurz E2F). Von dem Übergang aus der G1- in die S-Phase des Zellzyklus wird Rb phosphoryliert, löst E2F und gibt dadurch Promotoren für die Transkription der DNA-Polymerase α und Thymidinkinase frei, die
7-Proteine der high-risk Typen ist so im Gegensatz zu E7-
TRONG und RAMON,
ieren centrosome duplication errors (CDE)
7-Proteine der high- und low-risk Typen interagieren über die CH-1 Domäne mit dem transkriptionellen Koaktivator p300 und heben die durch p300-gesteuerte
(BERNAT et al., 2003).
für die DNA-Synthese notwendig sind. E7 sichert so die virale Proteinsynthese (CHELLAPAN et al., 1991). Für die maligne Transformation ist die Bindung an Rb nicht ausreichend (CICCOLINI et al., 1994; SCHMITT et al., 1994; MÜNGER et al., 2001, CALDEIRA et al., 2003; YAMASHITI et al., 1993). E7 bindet und aktiviert die subunit4 (S4) ATPase des 26S Proteasom über das C-terminale Zinkfingerbin- dungsmotiv. Für E
Proteinen der low-risk Typen ein gezielter Abbau von Rb durch das 26S Proteasom möglich (BOYER et al., 1996; BEREZUTSKAYA und BAGCHI, 1997;
BEREZTSKAYA et al., 1997; JONES et al., 1997a; ARMS 1997).
Außerdem können E7-Proteine der high-risk Typen die unterdrückende Wirkung der Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren (CKIs) p21 und p27 außer Kraft setzen und die Zellzykluspromotion verstärken (JONES et al., 1997b; ZERFASS-THOME et al., 1996). Zusätzlich findet man E7 im Komplex mit CyclinE und CyclinA (MC INTYRE et al., 1996; ARROYO et al., 1993).
High-risk HPV E7-Proteine induz
(DUENSING und MÜNGER, 2003a). Ursache dafür ist die E7-induzierte Umpro- grammierung des Zellzyklus, indem die Kinase Cyclin/ CyclinE dependent kinase (cdk) 2 unterdrückt wird. E6 unterstützt E7, indem es die kritischen Zellzyklus- Schnittstellen unterbricht (DUENSING und COFFINO, 2003; DUENSING und MÜNGER, 2003b).
E
Transaktivierungsfunktion von E2 auf
E7 nimmt direkt Einfluss auf die Steuerung der Immunantwort. Es interagiert mit p48 (BARNARD und McMILLAN, 1999) und bindet und inaktiviert den durch IFNγ- induzierten Transkriptionsfaktor IRF-1, der wiederum die Expression von IFNβ
Literaturübersicht 18
steuert (PARK et al., 2000). Die Beseitigung von IRF-1 wird zusätzlich unterstützt durch die Bindung von E7 an die Histon-Deacetylase Mi2ß (BREHM et al., 1999), den Transkriptionsfaktor MPP2 (LUSCHER-FIRZLAFF et al., 1999) und den AP-1- Komplex. (ANTIMORE et al., 1996).
Zusätzlich bindet E7 das TATA box binding protein (TBP) (MASSIMI et al., 1997) und das zum Drosophila Tumorsuppressorprotein Tid56 homologe Wirtszellprotein hTid-1 (SCHILLING et al., 1998). High-risk E7-Proteine binden außerdem Pyruvatkinase M2 und sichern so wahrscheinlich den erhöhten Energiebedarf der transformierten Zellen (ZWERSCHKE et al., 1999).
2.1.4.7 Die L1- und L2-Proteine
Das Capsid des humanen Papillomavirus besteht aus 360 Kopien des Haupt- Membranproteins L1. Das substöchiometrische Verhältnis von L1 zu L2 in gereinig- ten L1/ L2-Komplexen beträgt 5:1. Die L1-Proteine sind als 72 Pentamere um 12 L2- Moleküle angeordnet. Über stark hydrophobe Bindungen assoziieren beide zu virus- like particles (VLP) (FINNEN et al., 2003). Beide Proteine sind im Zytoplasma angereichert. Die Bildung des Viruscapsid ist nur im Kern möglich. L2 rekrutiert L1 in den Zellkern, ein genauer Weg ist noch nicht nachgewiesen. Eine vermutete Assozi- ation mit ND-10 (nuclear-domain 10) hat sich nicht bestätigt (BECKER et al., 2004).
L1 gelangt über den Kap beta2-gesteuerten Signalweg in den Zellkern (NELSON et al., 2002). Für HPV11 und HPV16 ist eine Komplexierung der L2-Proteine mit den zellulären Proteinen PATZ, PLNP und PMSP in spezifischen Kerndomänen der Zelle nachgewiesen (GORNEMANN et al., 2002).
Beide Capsidproteine werden für die Entwicklung von Impfstoffen gegen high-risk Papillomaviren genutzt. Die ersten prophylaktischen und therapeutischen Vakzinie- rungsversuche wurden im Tiermodell mit den L1- und L2-Proteinen von BPV2, CRPV und COPV erfolgreich durchgeführt (JARRETT et al., 1991; BREITBURD et al., 1995;
SUZICH et al., 1995). Parallel wurden Vakzine gegen humane Papillomaviren etabliert und weiterentwickelt. Neben den Strukturproteinen werden dabei auch frühe, virale Proteine verwendet. Als Kombination zu Fusionsproteinen oder chimeric virus-like particles (CVLP) kann so eine humorale und zelluläre Immunantwort
Literaturübersicht 19
stimuliert werden (MÜLLER et al., 1997; BREITBURD und COURSAGET, 1999;
MICHEL et al., 2002). Ergebnisse klinischer Studien zeigen, dass eine Impfung die Infektionsrate mit high-risk HPV Typen reduziert (KOUTSKY et al., 2002;
BRANDSMA et al., 2004; HALLEZ et al., 2004; SMYTH et al., 2004). Eine L2- Peptidimmunsisierung hat im Tierversuch Kreuzimmunität gegen verschiedene, genitale HPV Typen induziert und scheint eine Möglichkeit zu sein, gegen Mischin- fektionen zu vakzinieren (EMBERS et al., 2004).
2.1.4.8 Die Long Control Region (LCR) oder Upper Regulatory Region (URR) Die URR umfasst den Bereich zwischen den frühen und späten ORFs und fungiert als viraler Promotor, der die Expression viraler Gene und zellulärer Transkriptionsfak- toren über cis-regulatorische Elemente steuert. Am 5´-Ende befindet sich das Polyadenylierungssignal für die Strukturproteine L1 und L2. Die URR der einzelnen Virustypen ist durch eine unterschiedliche Anzahl an E2-Protein-Bindungsstellen gekennzeichnet und enthält eine E1-Protein-Bindungsstelle, die den Ursprung der Replikation (ori) darstellt. Am 3´-Ende ist eine TATA box im E6/E7-Promotor lokali- siert (SMITS et al., 1993). Der zentrale Bereich der URR umfasst eine, von silencer- Segmenten eingeschlossene, enhancer-Region, an die zahlreiche Transkriptionsfak- toren binden. Hier befindet sich ein epithelspezifischer enhancer (CID et al., 1993;
VANCE et al., 1999), dessen Aktivität in genitalen, high- und low-risk Typen deutlich stärker ausgeprägt ist, als in kutanen Typen (SAILAJA et al., 1999). In diesem Bereich bindet der epitheliale Faktor Epoc1/Skn-1a, der die virale Transkription in den suprabasalen Anteilen des Plattenepithels in Abhängigkeit vom Zustand der Differenzierung steuert (YUKAWA et al., 1996). Die Aktivität der URR ist von der Funktionalität der AP-1-Bindungsstellen und der Zusammensetzung des AP-1- Komplexes abhängig (THIERRY et al., 1992; RÖSL et al., 1997). Während der Differenzierung ändert sich diese von c-fos/JunD- in JunB/JunD-Heterodimere (SEN et al., 2004). Durch Bindung der Transkriptionsfaktoren AP-1 und Sp1 an cis-
gulatorische Elemente wird der E6/E7-Promotor reguliert (BUTZ und HOPPE-SEYLER, 1993). Außerdem interagieren mit dem zentralen URR-Segment die Transkriptionsfaktoren NF1 und Oct-1 (CHONG et al., 1991; ZHAO et al., 1997), re
Literaturübersicht 20
KRF-1 (MACK und LAIMINS, 1991), TEF2 (ISHIJI et al., 1992) und beinhaltet einen
rung wechselt die Transkription von E1 und E2 zum distalen Promotor der URR, der dieser Autoregulation nicht unterworfen ist. Eine unkontrollierte E1- und E2- Progesteron- und Glucocorticoidrezeptor (CHAN et al., 1990). Für HPV16 konnte innerhalb der URR ein HPV-Interferon responsive element (HIRE) 1 identifiziert werden (ARANY et al., 2004). Der Transkriptionsfaktor YY-1 nimmt eine Sonderstel- lung ein, da er den viralen Promotor sowohl aktivieren als auch unterdrücken kann (BAUKNECHT et al., 1992, KANAYA et al., 1997; PAJUNK et al., 1997). In einigen kutanen HPV-Typen wurden in der URR UV-responsive elements (URE) identifiziert.
Die einzelnen Typen wurden durch UV-Strahlung sowohl aktiviert als auch inhibiert.
Diese Reaktion zeigte sich abhängig vom p53 Status des Zellsystems. Eine direkte Interaktion über p53-binding sites wurde nicht für alle untersuchten Typen bestätigt (PURDIE et al., 1999; DE VILLIERS et al., 1999; RUHLAND und DE VILLIERS, 2001).
2.1.5 Die Replikation der Papillomaviren
Humane Papillomaviren replizieren in differenzierendem Gewebe und infizieren epitheliale Zellen über Mikroläsionen der Haut, bzw. Schleimhaut, im Stratum basale des Plattenepithels (STUBENRAUCH und LAIMINS, 1999). Als möglicher Oberflä- chenrezeptor gilt Heparin-Sulfat (JOYCE et al., 1999; GIROGLOU et al., 2001). Nach Infektion der Zelle werden early viral proteins E1 und E2 transkribiert. Sie bilden im proximalen Promotor der URR, ori, einen multimeren Komplex, der in die zelluläre DNA-Synthese eingreift und zelluläre Transkriptionsfaktoren rekrutiert. Zunächst werden 50 bis 100 extrachromosomal vorliegende, virale Genomkopien gebildet, die sich während der Zellteilung auf die beiden Tochterzellen verteilen und entweder als Virusreservoir in den basalen Epithelschichten über Jahre verweilen oder mit diffe- renzierenden Tochterzellen suprabasal aufsteigen (MOHR et al., 1990; USTAV et al., 1991; YANG et al., 1991; SEO et al., 1993a; SEDMAN und STENLUND, 1995). Für diese transiente Replikation des Virus ist die Transkription der E1- und E2-Proteine ausreichend und wird durch autoregulierende Expression des E2-Proteins gesteuert (DEL VECCHIO et al., 1992; STUBENRAUCH et al., 1998). Während der Differenzie-
Literaturübersicht 21
Produktion beginnt und induziert die Transkription der E6- und E7-Proteine, die durch Blockade des Zellzyklusarrests in der G1/S- und G2/M-Phase, die Bindung an
elluläre Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressorproteine, die Voraussetzungen oduktive Virusinfektion schaf -risk Typen infizierten, malignen Läsionen ist die virale DNA in das Wirtsgenom meist im ORF des E1- und E2- Proteins integriert. Dadurch sind die Le hen und die Autoregulation der viralen DNA-Synthese vollständig unterbunden (DEL VECCHIO et al., 1992).
Die virale DNA wird schließlich in den s ile bis zu 1000 Kopien pro Zelle vermehrt und die late viral proteins, E1/ E4, E5, L1 un as E1/
E4-Protein interagiert mit zellulären St n Zellver- band des Plattenepithels, das E5-Protein schwächt die wirtszellgesteuerte T-Zell Immunantwort und die L1- und L2-Proteine bilden das Viruscapsid. Im Stratum granulosum werden die infektiösen Virionen schließlich sy nd über sich abschilfernde Zellen des Stratum corneum an das umgebende Gewebe freigesetzt.
zierte Zelle
z
für eine pr ft. In mit high
seraster unterbroc
uprabasalen Ante n
d L2, exprimiert. D löst den straffe rukturproteinen und
nthetisiert u
Normale Zelle HPV-infi
Keratin-gefüllte, aus-
DNA-Synthese und Zellteilung der basalen Stamm- zellen
Infek Multikopi differenzierte Zellen
n virale DNA- ation
tio Stamm
egenom, Expression der frühen, viralen Gene
Abbildung stellung der differenzierungsabhängigen Funktionen in normalen und mit
fizie lz NR
Akkumulierung der Keratohyalingranula
Virale Capsidsynthese Induktion des
Promotors der späte Synthese hoch-
molekularer Keratine Gene, Replik
n der basalen zellen,
3: Dar
HPV-in rten Epithe ellen (STUBE AUCH und LAIMINS, 1999)
Literaturübersicht 22
2.1.6 HPV E6/E7-exprimierende transgene Tiermodelle
Transgene Mäuse, die E6- und E HPV Typen unter der
rolle nd lu en, zeigen, dass die
P o ensc l
Tabelle 2: Übersicht über E6/E7-exprimi le r
7-Proteine von high-risk Kont
beiden
viraler u roteine onk
starker, zel gene Eig
lärer Promotoren exprimier haften besitzen (ECKERT et a
erende transgene Mausmodel
., 2000).
Maus Promoto Expression Phänotyp Referenz
MMTV-
16 Mouse y
repeat
Hoden g in 17-100% KONDOH et al.,
HPV E6/E7
Mammar tumor virus long terminal
Seminomentstehun
der Fälle nach 10 Monaten;
Entwicklung aus transgenen Keimbahnzellen
1991
Actin- 16
humaner ß- Gehirn ARBEIT et al.,
HPV
E6/E7 Actin- Promotor
Auftreten von neuroepithelialen Tumoren bei 71% der Tiere;
Tumorbildung nach 2,5 Monaten 1993 αA-
HPV16 crystallin- r
ln lokal invasive, wenig
% en SCCs
1993;
E6/E7 ,
muriner αA- Promoto
Linse der
Augen; Haut Mikroophtalmie; Katarakte; 13%
entwicke
differenzierte Linsentumoren;
Unterdrückung der Differenzie- rung der Linsenfaserzellen;
epidermale Hyperplasie, bis 20 der Tiere entwickeln an diesen Lokalisation
GRIEP et al., LAMBERT et al.
1993
K14
HPV16 humaner
Keratin 14- basal in allen
Platten- Hyperplasie, Papillomatose und Dysplasie an vielen epidermalen,
Monaten
ARBEIT et al., 1994; HURLIN E6/E7 Promotor epithelien mukosalen und epithelialen
Lokalisationen; SCCs nach 12 et al., 1995 K10
HPV16 E6/E7
boviner Keratin 10- Promotor
suprabasale Expression in Epidermis
erhöhte Proliferationsrate der basalen und suprabasalen Keratinozyten, Papillomabildung nach 14 Monaten
AUEWARAKUL et al., 1994;
K6 HPV16 E6/E7
boviner Keratin 6- Promotor
suprabasale Expression in Epidermis
Epidermale Dysplasie, Hyper- keratose und fokale Para- keratose; Magentumoren nach 8 bis 11 Monaten ausgehend von neuroendokrinen, enterochrom- affinen Zellen
SEARLE et al., 1994
K1 HPV18 E6/E7
humaner Keratin1 Promotor
basale und suprabasale Expression in Epidermis
nach 12 Monaten Bildung von Papillomen, Keratinexpressions- muster entspricht der Hyperproli- feration
GREENHALGH et al., 1994
HPV18
E6/E7 HPV18
URR Genitalien Vesikula seminales und Glandula präputialis sind vergrößert, Bildung von Zervixtumoren in 22% bis 93% aller transgenen Weibchen
COMERFORD et al., 1995
Literaturübersicht 23
2.2 Der Einfluss von UV-Strahlung auf die Entstehung von Nicht-Melanom- Hautkrebs
Hautkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen der Kaukasischen Bevölke- ng. In den USA treten jährlich bis zu eine Million neue Fälle auf. Die häufigsten
en Photoprodukte wie Pyrimidindimere zwischen
nt. Man unterscheidet zwei verschie- ene Formen der NER, aktiv transkribierte Gene werden schnell über die transcripti- on-coupled repair (TCR) repariert, Veränderungen in anderen Bereichen des Ge- ru
Hautkrebsarten an sonnenexponierten Stellen sind das Basalzellkarzinom, das Plattenepithelkarzinom und das maligne kutane Melanom (GLOSTER und BRODLAND, 1996; DE GRUIJL et al., 2001). Die UV-Strahlung des Sonnenlichtes setzt sich zusammen aus UV-A (320 bis 400nm), UV-B (280 bis 320nm) und UV-C (200 bis 280nm). UV-B-Strahlung ist maßgeblich an der Entstehung von Hautkrebs beteiligt. Sie wird in der Haut absorbiert, produziert Erytheme, Verbrennungen (CLEAVER und CROWLEY, 2002; RITTIE und FISHER, 2002) und induziert eine Fülle von Genen, die eine Funktion in Zellzykluskontrolle, DNA-Reparatur, Protein- synthese und -degradierung sowie RNA-Metabolisierung haben (KOCH-PAIZ et al., 2004). UV-A gelangt in Schichten der Dermis und induziert hauptsächlich Faltenbil- dung und Hautalterung durch Bildung von reactive oxygen species (ROS). UV-A wirkt auf die Entstehung von Hautkrebs additiv zu UV-B und ist erst in hohen Dosen eigenständig kanzerogen wirksam (STRICKLAND, 1986 und DE GRUIJL, 2002a;
PERSSON et al., 2002).
UV-Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 245 bis 290 nm wird in der Haut von organischen Molekülen mit konjugierten Doppelbindungen, wie DNA und Proteine, die Tryptophan oder Tyrosin enthalten, absorbiert (DE GRUIJL et al., 2001). In der DNA entstehen die klassisch
angrenzenden Cytosinresten (C und T, C und C) oder (6-4)Pyrimidin-Pyrimidon- Photoprodukte (TC und CC). Tandem-Pyrimidin-Regionen innerhalb der DNA sind für die Bildung von Photoprodukten prädestiniert (TORNALETT und PFEIFER, 2002).
Photoprodukte werden innerhalb von wenigen Stunden nach UV-Bestrahlung mit Hilfe der nucleotide excision repair (NER) entfer
d
Literaturübersicht 24
noms langsamer über die global genome repair (GGR). Die Reparaturkomplexe werden stabilisiert und wirken als Excisions-Endonucleasen, die den Defekt entfer-
n olymerase δ, proliferating nuclear antigen (PCNA),
iebung
wischen DNA-Reparatur, DNA -Replikation und UV- nen u d mit Hilfe der DNA-P
single stranded binding protein und DNA-Ligase, DNA neu synthetisieren und einfügen (SANCAR, 1994; CLEAVER und CROWLEY, 2002). Bei unvollständiger DNA-Reparatur entstehen sogenannte UV signature-Mutationen mit Versch
der Basenfolge von C zu T und CC zu TT (MATSUMARU und ANANTHASWAMY, 2002; ICHIHASHI et al., 2003).
UV-induzierte Mutationen werden als initiales Ereignis für die Entstehung von Hautkrebs betrachtet. Grundsätzlich ist für die maligne Transformation aber die Unterstützung durch stimulierte Proto-Onkogene oder weitere Mutationen in Tumor- suppressorgenen bzw. Genen, die das Zellwachstum regulieren, notwendig (MATSUMARA und ANANTHASWAMY, 2002).
2.3 Das p53-Protein in Interaktion mit UV-Strahlung 2.3.1 Aufbau und Funktion
Eine besondere Schnittstelle z
Mutagenese stellt das p53-Protein dar, das die Entstehung von UV-B-induziertem Hautkrebs maßgeblich beeinflusst (McGREGOR, 1999; DE GRUIJL, 2002b).
p53 ist ein Transkriptionsfaktor, der in nahezu 50% aller Tumoren genetisch modifi- ziert ist (HAINAUT et al., 1998; MARTIN et al., 2002; SLEE et al., 2004). Das p53- Gen ist auf Chromosom 17 (17p13) lokalisiert, besitzt 11 Introns und codiert 395 Aminosäuren (LANE, 1992). Es fungiert als zentrale Schaltstelle in der Zellzyklusre- gulation, Induktion der Apoptose, DNA-Replikation und -Reparatur, spielt eine Rolle in der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und der Zellalterung. Eine Vielzahl an Faktoren, zellulärer Stress, genotoxische Substanzen (UV-Strahlung, γ- Strahlung, zytotoxische Chemikalien), metabolische Veränderungen, Onkogene, Wachstumsfaktoren und Zytokine induzieren seine Expression. Das p53-Protein bindet DNA, RNA und Proteine, wird acetyliert, glycosyliert und phosphoryliert. Es wird über die Interaktion mit dem MDM2-Protein autoregulativ in phosphorylierter
Literaturübersicht 25
Form ubiquitiniert und degradiert (WU et al., 1993; HAUPT et al., 1997; PRIVES und HALL, 1999).
Das p53-Protein enthält drei große Domänen, denen bestimmte Funktionen zuge- rdnet werden können: eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine zentrale DNA-Bindungsstelle und das C-terminale Ende, das die Oligomerisations-Domäne gieren mit dem
teinen wie HPV E6 ausgeschaltet (Über-
2.3.1.1 Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur und DNA-Replikation
A wird über p53 der Zellzyklus in der G1-Phase arretiert, um
04).
o
und die Kernlokalisationssignale enthält. MDM2 und p300/CBP intera
N-Terminus und induzieren dadurch p53-Modifikationen wie Acetylierung und Ubiquitinierung im C-Terminus (VOUSDEN und LU, 2002). Im N-Terminus befinden sich außerdem mehrere Phosphorylierungsstellen und eine für die DNA-abhängige Proteinkinase, die an der Reparatur von DNA beteiligt ist. Der C-Terminus wird durch cdk2-Kinase, Proteinkinase C und Kaseinkinase II phosphoryliert (LANE, 1994). p53 bindet an zahlreiche zelluläre Proteine, die oben aufgeführte Funktionen bewirken und wird durch Interaktion mit viralen Pro
sicht: PRIVES und HALL, 1999). p53 bindet DNA über spezifische p53 binding sites als Tetramer und stimuliert so eine Fülle nachgeschalteter Gene, die im Rahmen dieser Arbeit nicht näher beschrieben sind (JEFFREY et al., 1995, Übersicht: SLEE et al., 2004; NORBURY und ZHIVOTOVSKY, 2004). Hier werden nur die nach UV- Bestrahlung induzierten Hauptmechanismen des p53-Proteins näher betrachtet.
Infolge der zerstörten DN
die geschädigte DNA zu reparieren, bevor die Zelle in die S-Phase übergeht. p53 induziert die Expression von p21WAF1/CIP1, die den cdk-Cyclin-Komplex inaktiviert.
Dies geschieht durch Fusion von p21 mit PCNA und cdk2/ CyclinA oder E. Dieser Komplex akkumuliert hypophosphoryliertes Rb und verhindert die Freisetzung von E2F, das notwendig für Induktion der S-Phase ist (HARPER et al., 1993;
EL-DEIRY et al., 1993; HOFSETH, 20
Mehrere growth arrest and DNA-damage inducible genes (GADD) wurden isoliert.
Eine besondere Rolle spielt GADD45, das durch p53 induziert wird. Es interagiert mit p21WAF1/CIP1 und PCNA (VAIRAPANDI et al., 1996), fördert in vitro die nucleotide excision repair (NER) (CLEAVER und CROWLEY, 2002) und ist über die Interaktion
