Immunhistochemische Untersuchungen am formalinfixierten

3.2.17.1 Immunhistochemie nach der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode (ABC-Reaktion )

Die immunhistochemische Färbung der formalinfixierten Gewebeschnitte wurde mit modifizierten Demaskierungsmethoden in Analogie zum Protokoll des Herstellers des Vectastain® Elite® ABC Kits (Fa. Vector Laboratories, USA) durchgeführt. Das Prinzip dieses Systems beruht auf der hohen Bindungsaffinität des Glycoproteins Avidin mit dem Vitamin Biotin. Diese Affinität wird zur Detektion und Vernetzung der sekundären, mit Biotin gekoppelten Antikörper genutzt, indem nach Bindung des sekundären Antikörpers, Avidin DH mit biotinylierter Horseradish-Peroxidase (HRP) gemischt wird und mit dem biotinylierem Zweitantikörper Makromoleküle ausbildet.

Diese Komplexe werden durch Zugabe von Substrat durch enzymatische Farbreakti-on der HRP sichtbar gemacht.

Für die Entparaffinierung, De- und Rehydrierung, Waschschritte und Färbungen wurden jeweils neun Schnitte in Glaskörbchen einsortiert und in Glasküvetten gestellt. Diese wurden auf einem Kipp-Schüttler (Vibrax-VXR, Fa. Janke & Kunkel;

Stauffen) permanent in Bewegung gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösungen in den Küvetten sicherzustellen. Alle sich wiederholenden Schritte wurden in zuvor gewechselten Lösungen durchgeführt.

Zunächst wurden die Schnitte in einer Standküvette in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 65°C und 3x 5 min in Xylol entparaffiniert. Danach wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe je 2x 5 min in 100%, 96%, 90%, 80%, 70% Ethanol gewässert und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewa-schen. Die Demaskierung erfolgte, je nach zu detektierendem Antigen, unterschied-lich:

Keratin 6, Involucrin, Loricrin:

Die Schnitte wurden in eine Standküvette aus Plexiglas (Fa. Roth, Karlsruhe) gestellt und mit DAKO Retrieval Solution gefüllt. Diese wurde in einem kochenden Wasser-bad für 20 bis 30 min auf einer Herdplatte auf 95 bis 99°C erhitzt.

Material und Methoden 100

p53:

In der Mikrowelle wurde ein wassergefülltes Becherglas mit Siedesteinen vorgeheizt, die Schnitte ebenfalls in eine Standküvette aus Plexiglas gestellt und diese mit 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) gefüllt und schließlich 3x 10 min bei 750 W in der Mikrowelle gekocht. Verdampfter Citratpuffer wurde mit Aqua bidest aufgefüllt.

Alle Schnitte wurden bei Raumtemperatur 20 min abgekühlt und kurz in H2O ge-schwenkt und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5%Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Die endoge-ne Peroxidase wurde durch Inkubation in 3% H2O2/ Methanol für 15 min blockiert, die Schnitte erneut kurz in H2O getaucht und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Danach wurden die Hautschnitte auf dem Objektträger mit Hilfe eines PAP-Pens (Fa. Plano GmbH, Wetzlar) umfahren, damit aufpipettierte Lösun-gen auf den lieLösun-genden Objektträgern nicht abfließen konnten. Die Schnitte wurden

ann 20 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer blockiert in 10 ml 1x PBS (pH 7,4) gemischt mit 150 µl Konzentrat des Blocking Serums (normales

h-rungskästen ausgelegt mit wassergetränktem Filterpapier (Fa. Schleicher&Schuell,

Maus-Involucrin: 1:1000; Kanin-d

Ziegenserum, Bestandteil des ABC-Kits). Als feuchte Kammer wurden Diaaufbewa

Dassel) genutzt. Das verdünnte Ziegen-Serum wurde vorsichtig abgekippt und die Schnitte in der feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur mit dem 1.

Antikörper inkubiert. Die Verdünnungen wurden den Herstellerangaben entspre-chend übernommen und in 1x PBS/ 1%BSA angesetzt (Kaninchen polyklonal anti Maus-Keratin 6: 1:500; Kaninchen polyklonal anti

chen polyklonal anti Maus-Loricrin: 1:500 (alle Fa. Hiss Diagnostics, Freiburg);

Kaninchen monoklonal anti Maus-p53 (CM-5): 1:500 (Fa. Novocastra, GB)). Am nächsten Tag wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und in der feuchten Kammer für 30 min in 2. Antikörper (Ziege polyklonal anti Kaninchen, Bestandteil des ABC-Kits) gekoppelt an Biotin inkubiert. Die Verdün-nung wurde in 10 ml 1x PBS/ 1%BSA gemischt mit 150 µl Serumkonzentrat (Be-standteil des Kits) und 50 µl des 2. Antikörpers angesetzt und danach wieder 3x 5min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Danach folgte eine 30 minütige Inkubationszeit der Schnitte mit ABC-Reagent (Bestandteil des Kits) in der feuchten Kammer. Diese Lösung musste 30 min vor dem Gebrauch angesetzt werden, indem 100 µl Lösung A mit 100 µl Lösung B (Bestandteil des Kits) in 10 ml 1x PBS (pH 7,4)

Material und Methoden 101

gemischt wurden. Anschließend wurden die Schnitte wieder 3x 5 min in 1x PBS/

0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und 3 bis 5 min in 3,3´-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Gebrauchslösung als Substrat inkubiert, die enzymatische Reaktion wurde durch Eintauchen der Schnitte in 1x PBS abgestoppt. Danach wurden die Schnitte mehrmals in H2O gewaschen und 5 min in Hämalaun (p53) oder Hämatoxylin (Keratine) gegengefärbt. Die Schnitte wurden 1 min in Leitungswasser gebläut. Die mit Hämalaun gegengefärbten Schnitte wurden kurz in 250 ml 70%

Ethanol gemischt mit 3,5 ml 37% HCl fixiert und erneut 10 min in H2O gewaschen.

Danach folgte die Dehydrierung in der aufsteigenden Alkoholreihe jeweils 2x 30 sec 90%, 96% und 100% Ethanol und 3x 1 min in Xylol. Die Schnitte wurden unter dem Abzug getrocknet und in einem Tropfen Eukitt® (Fa. Kelo, Freiburg) mit

Stan-edeckt.

in

dard-Deckgläschen (20x 40mm²) eing

3.2.17.2 Immunhistochemie mit monoklonalen Mausantikörpern auf Mäuse-haut

Um p63 in der Mäusehaut nachzuweisen wurde ein Maus monoklonal anti p63 (4A4, Fa. Santa Cruz, USA) Antikörper verwendet. Um eine starke Hintergrundfärbung zu vermeiden, wurde der M.O.M.™ Immunodetection Kit (Fa. Vector Laboratories, USA) verwendet und dem Herstellerprotokoll entsprechend durchgeführt. Das Prinzip entspricht der in 3.2.16.1. beschriebenen Methode.

Die Schnitte werden wie in 3.2.16.1. deparaffiniert, rehydriert und in 0,01 M Citratpuf-fer analog zu p53 demaskiert, in 3% H2O2 blockiert und in 1xPBS / 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Die Blockierung der Schnitte unterscheidet sich von oben beschriebener Methode. Sie wurden für 1 h in einer feuchten Kammer in Gebrauchs-lösung der M.O.M ™Mouse Ig Blocking Reagent (Bestandteil des Kits) blockiert.

Dafür wurde 100 µl Konzentrat der speziellen Blockierungslösung in 2,5 ml 1x PBS (pH 7,4) verdünnt. Anschließend wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5%

Tween20 (pH 7,4) gewaschen und für 5 min mit M.O.M™Diluent, bestehend aus 600 µl M.O.M.™Protein Concentrate verdünnt in 7,5 ml 1x PBS (pH 7,4) benetzt, an-schließend vorsichtig abgekippt und der 1. Antikörper, Maus monoklonal anti p63 (4A4) (Fa. Santa Cruz, USA), in M.O.M™Diluent 1:500 verdünnt, auf die Schnitte

Material und Methoden 102

pipettiert. Die Inkubationszeit betrug 1 h. Anschließend wurden die Schnitte wieder 3x in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und für 20 min mit dem 2. Antikör-per (Bestandteil des Kits) inkubiert. Für die Verdünnung des 2. AntikörAntikör-pers wurden 10 µl des biotinylierten Antikörpers in 2,5 ml der zuvor angesetzten M.O.M™Diluent gemischt. Daraufhin wurden die Schnitte wieder 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und 5 min in Vectastain® Elite ABC Reagent inkubiert. Diese Reagenz wurde 30 min vor dem Gebrauch durch Mischung von 100 µl Lösung A und 00 µl Lösung B in 2,5 ml 1x PBS (pH 7,4) angesetzt. Die weitere Behandlung der Schnitte folgte dem in 3.2.16.1. beschriebenen Protokoll.

6.1. beschriebenen Proto-oll. Die Schnitte wurden anschließend 3x 5 min in 1x PBS (pH 7,4) gewaschen und für 10 min in der feuchten Kammer einem Trypsinverdau unterzogen. Die

Trypsin-ng 1A mit LösuTrypsin-ng 1B (Bestandteil

vorsichtig bgekippt und 100 µl des biotinylierten Maus anti BrdU Antikörpers (Lösung 4, Bestandteil des Kits) auf die Schnitte gegeben und für 1 h in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS (pH 7,4) gewaschen und mit 100 µl Straptavidin-Peroxidase (Lösung 5, Bestandteil des Kits) in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden sie erneut 3x gewaschen und DAB-Gebrauchslösung, bestehend aus 1 ml Reaktionsmix 1