Entnahme der Mäusehaut

Einzelstationen versorgte, dem Tier zusätzlich Sauerstoff zugeführt.

3.2.14.4 Intraperitonäale Injektion von Bromodeoxyuridin (BrdU)

Um die DNA-Syntheserate der Versuchstiere zu bestimmen, wurde ihnen 2 h vor der Probenentnahme 50 mg/ kg 5´-Bromo-2´-deoxyuridine (BrdU), gelöst in 1x PBS i.p.

injiziert und immunhistochemisch (3.2.18.1.) detektiert. BrdU ist ein Thymidinanalo-gon, dass, im Überangebot appliziert, während der DNA-Synthese an Stelle von Thymidin in die zelluläre DNA integriert wird.

3.2.14.5 Entnahme der Mäusehaut

Zur Probenentnahme wurden die Tier durch Genickbruch getötet und mit vier Kanülen an den Gliedmaßenenden auf einen Präparationsblock aufg

B

entfernt und auf ein Filterpapier (Fa. Schleicher&Schuell, Dassel) aufgezogen.

3 D

Isopentan be dann

Hautproben wurden sofort in beschriftete Aluminiumfolie eingepackt, auf Trockeneis g

Die Kryo-G

heim) hergestellt. Das Gerät wurde auf -28°C gek S

liegend, au d

g

verwendet oder in -80°C gelagert

Material und Methoden 98

3.2.16 Formalinfixierung, Paraffineinbettung und Herstellung von Gewebe-schnitten

Ein Teil der entnommenen, auf Filterpapier aufgezogenen Hautproben wurde in 20 stitut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt.

getrocknet und bei RT aufbewahrt.

ml 4%igem Formalin fixiert. Die formalinfixierten Gewebeschnitte wurden am In

Die fixierten Proben wurden zunächst mit einem Skalpell zugeschnitten, in Gewebe-kapseln gelegt und in einen Automat zur Paraffineinbettung (Citadell1000, Fa.

Shandon, Frankfurt) eingehängt. Hier erfolgte die Entwässerung in einer aufsteigen-den Alkoholreihe und Paraffineinbettung (Tabelle 14). Die fixierten Hautproben wurden schließlich in Blechkapseln in flüssiges Paraffin eingegossen und die erkalte-ten Blöcke bei 4°C gelagert. Von diesen Blöcken wurden von Mitarbeitern des Pathologischen Instituts auf einem Schlittenmikrotom (Fa. Mikrom, Heidelberg) 4 µm dicke Schnitte angefertigt, die in einem Wasserbad bei 40°C gestreckt und auf Superfrost Plus™ Objektträger aufgezogen wurden. Die Schnitte wurden in einem Trockenschrank für 1 h bei 65°C

Tabelle 15: Ablauf der automatisierten Entwässerung und Paraffineinbettung der Gewebschnit-te

Reagenz Verweildauer

10%iges Formalin

1h

Leitungswasser 45min

70% Ethanol 45min

80% Ethanol 45min

96% Ethanol 45min, 2x

Isopropanol 1h

Essigsäure-n-Butylester 1h, 2x

Paraffin, Paraplast Plus (Fa. Shandon) 1h bei 60°C, 2x

Material und Methoden 99

3.2.17 Immunhistochemische Untersuchungen am formalinfixierten Gewebe-schnitt

3.2.17.1 Immunhistochemie nach der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode (ABC-Reaktion )

Die immunhistochemische Färbung der formalinfixierten Gewebeschnitte wurde mit modifizierten Demaskierungsmethoden in Analogie zum Protokoll des Herstellers des Vectastain® Elite® ABC Kits (Fa. Vector Laboratories, USA) durchgeführt. Das Prinzip dieses Systems beruht auf der hohen Bindungsaffinität des Glycoproteins Avidin mit dem Vitamin Biotin. Diese Affinität wird zur Detektion und Vernetzung der sekundären, mit Biotin gekoppelten Antikörper genutzt, indem nach Bindung des sekundären Antikörpers, Avidin DH mit biotinylierter Horseradish-Peroxidase (HRP) gemischt wird und mit dem biotinylierem Zweitantikörper Makromoleküle ausbildet.

Diese Komplexe werden durch Zugabe von Substrat durch enzymatische Farbreakti-on der HRP sichtbar gemacht.

Für die Entparaffinierung, De- und Rehydrierung, Waschschritte und Färbungen wurden jeweils neun Schnitte in Glaskörbchen einsortiert und in Glasküvetten gestellt. Diese wurden auf einem Kipp-Schüttler (Vibrax-VXR, Fa. Janke & Kunkel;

Stauffen) permanent in Bewegung gehalten, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösungen in den Küvetten sicherzustellen. Alle sich wiederholenden Schritte wurden in zuvor gewechselten Lösungen durchgeführt.

Zunächst wurden die Schnitte in einer Standküvette in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 65°C und 3x 5 min in Xylol entparaffiniert. Danach wurden die Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe je 2x 5 min in 100%, 96%, 90%, 80%, 70% Ethanol gewässert und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewa-schen. Die Demaskierung erfolgte, je nach zu detektierendem Antigen, unterschied-lich:

Keratin 6, Involucrin, Loricrin:

Die Schnitte wurden in eine Standküvette aus Plexiglas (Fa. Roth, Karlsruhe) gestellt und mit DAKO Retrieval Solution gefüllt. Diese wurde in einem kochenden Wasser-bad für 20 bis 30 min auf einer Herdplatte auf 95 bis 99°C erhitzt.

Material und Methoden 100

p53:

In der Mikrowelle wurde ein wassergefülltes Becherglas mit Siedesteinen vorgeheizt, die Schnitte ebenfalls in eine Standküvette aus Plexiglas gestellt und diese mit 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) gefüllt und schließlich 3x 10 min bei 750 W in der Mikrowelle gekocht. Verdampfter Citratpuffer wurde mit Aqua bidest aufgefüllt.

Alle Schnitte wurden bei Raumtemperatur 20 min abgekühlt und kurz in H2O ge-schwenkt und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5%Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Die endoge-ne Peroxidase wurde durch Inkubation in 3% H2O2/ Methanol für 15 min blockiert, die Schnitte erneut kurz in H2O getaucht und 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Danach wurden die Hautschnitte auf dem Objektträger mit Hilfe eines PAP-Pens (Fa. Plano GmbH, Wetzlar) umfahren, damit aufpipettierte Lösun-gen auf den lieLösun-genden Objektträgern nicht abfließen konnten. Die Schnitte wurden

ann 20 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer blockiert in 10 ml 1x PBS (pH 7,4) gemischt mit 150 µl Konzentrat des Blocking Serums (normales

h-rungskästen ausgelegt mit wassergetränktem Filterpapier (Fa. Schleicher&Schuell,

Maus-Involucrin: 1:1000; Kanin-d

Ziegenserum, Bestandteil des ABC-Kits). Als feuchte Kammer wurden Diaaufbewa

Dassel) genutzt. Das verdünnte Ziegen-Serum wurde vorsichtig abgekippt und die Schnitte in der feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur mit dem 1.

Antikörper inkubiert. Die Verdünnungen wurden den Herstellerangaben entspre-chend übernommen und in 1x PBS/ 1%BSA angesetzt (Kaninchen polyklonal anti Maus-Keratin 6: 1:500; Kaninchen polyklonal anti

chen polyklonal anti Maus-Loricrin: 1:500 (alle Fa. Hiss Diagnostics, Freiburg);

Kaninchen monoklonal anti Maus-p53 (CM-5): 1:500 (Fa. Novocastra, GB)). Am nächsten Tag wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und in der feuchten Kammer für 30 min in 2. Antikörper (Ziege polyklonal anti Kaninchen, Bestandteil des ABC-Kits) gekoppelt an Biotin inkubiert. Die Verdün-nung wurde in 10 ml 1x PBS/ 1%BSA gemischt mit 150 µl Serumkonzentrat (Be-standteil des Kits) und 50 µl des 2. Antikörpers angesetzt und danach wieder 3x 5min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Danach folgte eine 30 minütige Inkubationszeit der Schnitte mit ABC-Reagent (Bestandteil des Kits) in der feuchten Kammer. Diese Lösung musste 30 min vor dem Gebrauch angesetzt werden, indem 100 µl Lösung A mit 100 µl Lösung B (Bestandteil des Kits) in 10 ml 1x PBS (pH 7,4)

Material und Methoden 101

gemischt wurden. Anschließend wurden die Schnitte wieder 3x 5 min in 1x PBS/

0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und 3 bis 5 min in 3,3´-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Gebrauchslösung als Substrat inkubiert, die enzymatische Reaktion wurde durch Eintauchen der Schnitte in 1x PBS abgestoppt. Danach wurden die Schnitte mehrmals in H2O gewaschen und 5 min in Hämalaun (p53) oder Hämatoxylin (Keratine) gegengefärbt. Die Schnitte wurden 1 min in Leitungswasser gebläut. Die mit Hämalaun gegengefärbten Schnitte wurden kurz in 250 ml 70%

Ethanol gemischt mit 3,5 ml 37% HCl fixiert und erneut 10 min in H2O gewaschen.

Danach folgte die Dehydrierung in der aufsteigenden Alkoholreihe jeweils 2x 30 sec 90%, 96% und 100% Ethanol und 3x 1 min in Xylol. Die Schnitte wurden unter dem Abzug getrocknet und in einem Tropfen Eukitt® (Fa. Kelo, Freiburg) mit

Stan-edeckt.

in

dard-Deckgläschen (20x 40mm²) eing

3.2.17.2 Immunhistochemie mit monoklonalen Mausantikörpern auf Mäuse-haut

Um p63 in der Mäusehaut nachzuweisen wurde ein Maus monoklonal anti p63 (4A4, Fa. Santa Cruz, USA) Antikörper verwendet. Um eine starke Hintergrundfärbung zu vermeiden, wurde der M.O.M.™ Immunodetection Kit (Fa. Vector Laboratories, USA) verwendet und dem Herstellerprotokoll entsprechend durchgeführt. Das Prinzip entspricht der in 3.2.16.1. beschriebenen Methode.

Die Schnitte werden wie in 3.2.16.1. deparaffiniert, rehydriert und in 0,01 M Citratpuf-fer analog zu p53 demaskiert, in 3% H2O2 blockiert und in 1xPBS / 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen. Die Blockierung der Schnitte unterscheidet sich von oben beschriebener Methode. Sie wurden für 1 h in einer feuchten Kammer in Gebrauchs-lösung der M.O.M ™Mouse Ig Blocking Reagent (Bestandteil des Kits) blockiert.

Dafür wurde 100 µl Konzentrat der speziellen Blockierungslösung in 2,5 ml 1x PBS (pH 7,4) verdünnt. Anschließend wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5%

Tween20 (pH 7,4) gewaschen und für 5 min mit M.O.M™Diluent, bestehend aus 600 µl M.O.M.™Protein Concentrate verdünnt in 7,5 ml 1x PBS (pH 7,4) benetzt, an-schließend vorsichtig abgekippt und der 1. Antikörper, Maus monoklonal anti p63 (4A4) (Fa. Santa Cruz, USA), in M.O.M™Diluent 1:500 verdünnt, auf die Schnitte

Material und Methoden 102

pipettiert. Die Inkubationszeit betrug 1 h. Anschließend wurden die Schnitte wieder 3x in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und für 20 min mit dem 2. Antikör-per (Bestandteil des Kits) inkubiert. Für die Verdünnung des 2. AntikörAntikör-pers wurden 10 µl des biotinylierten Antikörpers in 2,5 ml der zuvor angesetzten M.O.M™Diluent gemischt. Daraufhin wurden die Schnitte wieder 3x 5 min in 1x PBS/ 0,5% Tween20 (pH 7,4) gewaschen und 5 min in Vectastain® Elite ABC Reagent inkubiert. Diese Reagenz wurde 30 min vor dem Gebrauch durch Mischung von 100 µl Lösung A und 00 µl Lösung B in 2,5 ml 1x PBS (pH 7,4) angesetzt. Die weitere Behandlung der Schnitte folgte dem in 3.2.16.1. beschriebenen Protokoll.

6.1. beschriebenen Proto-oll. Die Schnitte wurden anschließend 3x 5 min in 1x PBS (pH 7,4) gewaschen und für 10 min in der feuchten Kammer einem Trypsinverdau unterzogen. Die

Trypsin-ng 1A mit LösuTrypsin-ng 1B (Bestandteil

vorsichtig bgekippt und 100 µl des biotinylierten Maus anti BrdU Antikörpers (Lösung 4, Bestandteil des Kits) auf die Schnitte gegeben und für 1 h in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte 3x 5 min in 1x PBS (pH 7,4) gewaschen und mit 100 µl Straptavidin-Peroxidase (Lösung 5, Bestandteil des Kits) in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden sie erneut 3x gewaschen und DAB-Gebrauchslösung, bestehend aus 1 ml Reaktionsmix 1

3.2.18 BrdU-Immunhistochemie

Diese immunhistochemische Färbung der Gewebschnitte wurde mit dem BrdU Immunohistochemistry System (Fa. Oncogene™, USA) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Voraussetzung war eine Markierung des Gewebes, die in Kapitel 3.2.13.4. beschrieben ist.

Die Deparaffinierung und Rehydrierung und Blockierung der endogenen Peroxidase in 3% H2O2/ Methanol erfolgte entsprechend dem in 3.2.1

k

Gebrauchslösung wurde durch Mischung von Lösu

des Kits) im Verhältnis 1:3 je nach Anzahl der Schnitte im benötigten Volumen angesetzt. Anschließend wurden die Schnitte 2 min in H2O gewaschen und in der feuchten Kammer für 30 min in 100 µl Lösung 2 (Bestandteil des Kits) denaturiert.

Die Schnitte wurden daraufhin wieder 3x 5 min in 1x PBS (pH 7,4) gewaschen und in 100 µl Lösung 3 (Bestandteil des Kits) blockiert, diese nach 10 min

a

Material und Methoden 103

6A (Bestandteil des Kits) gemischt mit 40 µl DAB-Konzentrat (Bestandteil des Kits) f die Schnitte gegeben und danach mehrmals in H2O gewaschen.

Kits)

h Mitarbeiter des stituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochchule Hannover durchgeführt. Die

teigenden Alkoholreihe von 100% Ethanol bis dest gestellt und 15 min in

m Binokular-Universalmikroskop (Axioplan; Fa. Carl Zeiss, Oberko-chen) bei 100-, 200- und 400-facher Vergrößerung. Die Ergebnisse wurden

fotogra-n Perfectiofotogra-n 2400, Fa. Epsofotogra-n).

für 2 bis 5 min au

Die Schnitte wurden mit jeweils 100 µl Hämatoxylin (Lösung 7, Bestandteil des für 5 min gegengefärbt, 30 sec in 1x PBS pH 7,4 gestellt bis sich die Färbung von violett nach blau verfärbte und dann mehrmals in H2O gewaschen. Die Dehydrierung und das Einbetten der Gewebeschnitte erfolgte analog zu dem in 3.2.16.1. beschrie-benen Protkoll.

3.2.19 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

Die HE-Färbung der formalinfixierten Schnitte wurde ebenfalls durc In

Schnitte wurden in Xylol und einer abs

70% Ethanol entparaffiniert und rehydriert, in Aqua bi

Hämalaun nach Mayer inkubiert. Danach 10 min in Leitungswasser gewaschen, 1 min in 1%iges Eosin mit 1Tropfen Eisessig/ Küvette gestellt, in Aqua bidest gespült und in einer aufsteigenden Alkoholreihe von 70% Ethanol bis 100% Ethanol entwäs-sert, in Xylol inkubiert und mit Corbit-Balsam eingedeckt.

3.2.20 Lichtmikroskopische Untersuchungen

Die histologische und immunhistochemische Auswertung der Gewebeschnitte erfolgte mit eine

phisch (Photomikroskopaufsatz Axiophot; Fa. Carl Zeiss, Oberkochen) dokumentiert und bei 1200 dpi digital eingescannt (Epso

Ergebnisse 104

4. Ergebnisse

eis auf DNA-Ebene

Die transgenen Founder und ihre Nachkommen wurden durch Amplifizierung der jeweiligen E6-IRES-E7-Konstruktkassette (HPV20, Primer: M20 E6 for und M20 E7 rev; HPV27, Primer: M27 E6 for und M27 E7 rev) mit Hilfe der PCR identifiziert.

Jeweils 100 ng Gesamt-DNA, isoliert aus Schwanzspitzenbiopsien, wurden als Template in die PCR eingesetzt. So wurden 144 transgene K10 HPV20-Mäuse und 209 transgene K10 HPV27-Mäuse von insgesamt 912 Mäusen identifiziert. Die Ergebnisse der PCR der HPV27 E6/E7-transgenen Founder ist beispielhaft in Abb.

11 dargestellt.

4.1 Nachweis von HPV20 E6/E7 und HPV27 E6/E7 in transgenen Mäusen Mit der DNA der einzelnen Konstrukte wurden, wie in 3.2.14.1 beschrieben, transge-ne Mäuse hergestellt. Als Mauslinie wurden haarlose, immunkompetente SKH-hr1, albino-Mäuse verwendet (Charles River Deutschland, Sulzfeld).

Aus Zeitgründen konnten im Rahmen dieser Arbeit die vergleichende Studie der Keratin 10- und Keratin 14-transgenen Mäuse nicht erfüllt werden. Deshalb beziehen sich alle weiterhin dargestellten Ergebnisse auf transgene Mäuse, die die viralen Proteine unter der Kontrolle des Keratin 10-Promotors exprimieren.

4.1.1 Nachw

Identifizierung der transgenen Mäuse

Ergebnisse 105

Abbildung 11: PCR-Nachweis von HPV27-E6-IRES-E7 aus Schwanzspitzenbiopsien der Foundertiere 603, 605, 606 (Positiv-Kontrolle: 1/Kopie Plasmid DNA pPOLYIII-Keratin 10-HPV27 E6-IRES-E7-pA; Negativ-Kontrolle: Aq. bidest)

Ergebnisse 106

4.1.1.1 Nachweis viraler RNA

Pro Konstrukt wurden jeweils drei exprimierende, transgene Mauslinien als Founder-tiere benötigt. Die Selektion erfolgte anhand der Überprüfung der Transkription von integrierter, viraler DNA in RNA. Aus der Rückenhaut der F1-Generation von in der PCR positiv getesteten Mäusen wurde RNA isoliert und nach reverser Transkription in DNA umgeschrieben. Die gleichen Mengen DNA aus einer RT-Reaktion wurden in eine PCR eingesetzt und die amplifizierten Mengen verglichen wie in Abb. 12 beispielhaft dargestellt. Als genomischer Standard wurde GAPDH amplifiziert. Als Foundertiere für K10 HPV27 E6-IRES-E7 wurden die Tiere 603 (w), 605 (m) und 606 (w) ausgewählt und für K10 HPV20 E6-IRES-E7 die Foundertiere 7001 (m), 7013 (m) und 889 (w).

HPV20E6 (497bp)

HPV20E7 (308bp)

GAPDH (460bp)

Negati

Marker F1 v F1 v

F1 v Wildtyp Marker

v-KoPositiv-Kontrolle on f 701 on f 701

on f 701

ntrolle 1 35

Abbildung 12: RT-PCR-Nachweis von HPV20 E6 und E7 aus der Gesamt-RNA der Mäusehaut verschiedener transgener K10 HPV20-Mäuse (Positiv-Kontrolle: 1/Kopie Plasmid-DNA von pPOLYIII-Keratin 10-HPV20 E6-IRES-E7pA, Negativ-Kontrolle: RT-Reaktion ohne RNA)

Ergebnisse 107

4.2 Synthese und Charakterisierung mono-und polyklonaler Antikörper gegen HPV20 E6, HPV20 E7, HPV27 E6 und HPV27 E7

Um die Expression der viralen Gene in der transgenen Mäusehaut nachweisen zu önnen, wurden monoklonale Antikörper in der Ratte und parallel polyklonale Antikörper gegen HPV20 E6 und E7 sowie HPV27 E6 und E7 im Kaninchen

herge-der viralen Gensequenzen in den Expressionsvektor pQcHis .2.10.1) wurde die Proteinexpression der einzelnen Klone (HPV20 E6: Klon 3;

HPV20 E7: Klon 27; HPV27 E6: Klon 5; HPV27 E7: Klon 24) durch Zugabe von IPTG induziert (3.2.10.2). Die Proteinexpression wurde in SDS-Polyacrylamidgel-elektrophoresen (SDS-PAGE) nach Coomassie-Färbung überprüft und in Western Blots durch Detektion gebundenen Anti-His-Antikörpers dargestellt (Abb.13).

k

stellt. Die Immunisierung der Tiere erfolgte mit synthetisierten, His-gekoppelten, viralen Proteinen.

4.2.1 Synthese und Charakterisierung der His-gekoppelten, viralen Proteine 4.2.1.1 Expression der viralen Proteine

Nach der Ligation (3

Abbildung 13: a) Coomassie-Färbung und b) dazugehöriger Western-Blot der Induktionskultur zur Proteinexpression von HPV27 E7. Pro Spur wurden jeweils 15 µl Bakterienkultur in 4x Probenpuffer 5 min bei 95°C gekocht und auf ein 18%iges SDS-PAGE-Gel geladen. Western Blot: 1. AK: Maus monoklonal anti His-tag 1:1; 2. AK: Ziege polyklonal anti Maus IgG alkalische Phosphatase 1:2500

Ergebnisse 108

Die Größe der detektierten Proteine stimmte nahezu mit den kalkulierten Werten überein (HPV20 E6: 17,36 kD; HPV20 E7: 11,89 kD; HPV27 E6: 16,7 kD; HPV27 E7:

10,96 kD) und ist als Coomassiefärbung des SDS-PAGE in Abb. 14 dargestellt.

HPV20 E7 stellte sich geringfügig größer dar, HPV20 E6 und die E7-Proteine beider HPV-Typen bildeten zusätzlich möglicherweise Dimere bzw. Trimere (pers. Kommu-nikation Prof. Zentgraf).

Abbildung 14: Vergleichende Darstellung der exprimierten viralen Proteine. Coomassie-Färbung eines 18%igen SDS-PAGE-Gels. HPV27 E6 (16,7 kD), HPV27 E7 (10,96 kD) mit möglicherweise gebildetem Trimer, HPV20 E6 (17,36 kD) mit möglicherweise gebildetem Dimer, und HPV20 E7 (11,89 kD) mit möglicherweise gebildetem Trimer.

4.2.1.2 Reinigung der exprimierten viralen Proteine mittels Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie

Das Lysat der induzierten Bakterienkulturen der einzelnen Klone, die jeweils ein virales Protein exprimierten, wurde durch eine Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt (3.2.10.3).

Das chromatographische Profil von HPV20 E6 und HPV27 E6 zeigte einen sehr ausgeprägten Peak durch Elution mit Puffer E. Entsprechend hoch war die produzier-te Proproduzier-teinmenge der Bakproduzier-terienkultur mit 12 mg für HPV27 E6 und 4,8 mg für HPV20

Ergebnisse 109

E6. Die Elution von HPV27 E7 zeigte verglichen dazu einen sehr kleinen Peak durch die Puffer E. Insgesamt ergaben sich aus 2 l Bakterienkultur nur 1,63 mg Protein.

Die eluierten

iäre Strukturen der Proteine verschiebt sich ufig das Löslichkeitsverhalten von pH 4,5 in den basischen Bereich. Dieser

mg Protein isoliert. In HPV20 E7 zeigte einen mittleren Peak durch Elution mit Puffer E.

HPV20 E7-Proteine mussten wegen nicht ausreichender Reinheit erneut über eine Ni-NTA-Säulenchromatographie gereinigt werden. Sie wurden zusätzlich mit einem Puffer D2 (pH 5,3) gewaschen. Durch tert

hä

Verdacht bestätigte sich nicht und so wurden schließlich 1,28

Abb. 15 ist das Elutionsprofil der Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie der Ex-pressionskultur von HPV27 E6 beispielhaft dargestellt.

Abbildung 15: Darstellung des Elutionsprofils der Nickel-Chelat-Affinitätschromatographie der Expressionskultur von HPV27 E6. Das Elutionspr

mit den Pufferlösungen B bis F ofil zeigt die einzelnen Gipfel, die nach Elution erhalten wurden. HPV27 E6 eluierte mit der Pufferlösung E, die übrigen Ausschläge des Profils repräsentieren die Elution unspezifisch gebundener Proteine.

Ergebnisse 110

Die eluierten Proteinfraktionen wurden vergleichend in SDS-Polyacrylamid-gelelektrophoresen aufgetrennt, die Homogenität durch eine Coomassie-Färbung überprüft und durch Detektion gebundenen Anti-His-Antikörpers im Western Blot verifiziert (Abb. 16).

Abbildung 16: a) Coomassie-Färbung und b) dazugehöriger Western-Blot einzelner Proteinfrak-tionen, die aus der Ni-NTA-Affinitätschromatographie der Expressionskultur von HPV27 E6 eluiert wurden. Das Lysat der Bakiterienkultur wurde zum Vergleich ebenfalls aufgetragen.

Western Blot: 1. Antikörper: Maus monoklonal anti His, 2. Antikörper: Ziege polyklonal anti Maus IgG alkalische Phosphatase 1:2500

Ergebnisse 111

4.2.2 Charakterisierung der mono-und polyklonalen Antikörper

Mit den gereinigten Proteinen HPV20 E6, HPV20 E7, HPV27 E6 und HPV27 E7 wurde jeweils eine Ratte immunisiert, antikörperproduzierende B-Zellen geerntet und aufgearbeitet, wie in 3.2.12 beschrieben.

4.2.2.1 Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Die Mediumüberstände makroskopisch sichtbarer Hybridomzellklone wurden zu-nächst im ELISA getestet. Als Positivkontrollen wurden die Rattenseren der entspre-chend immunisierten Tiere in einer Verdünnung von 1:100 in 1x PBS eingesetzt und zusätzlich mit den Extinktionswerten von 1x PBS als Negativkontrolle verglichen. Die Extinktionswerte der einzelnen Positivkontrollen waren sehr unterschiedlich. Das

ert von 0.8. Der Grenzwert der Extinktionen für die weiterführende Kultivierung der ybridome betrug 1,0. Für HPV20 E6 ergaben sich so insgesamt 30

Hybridom-ELISA positiv-getesteten Hybridomüberstände wurde im treifen-Western-Blot überprüft. Dazu wurden die gereinigten Proteine von HPV20 E6, HPV20 E7, HPV27 E6 und HPV27 E7 auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und die jeweiligen Hybridomüberstände als 1. Antikörper verwendet. In Abb. 17 ist

etestet und teilweise in der Immunhistochemischen Untersuchung am Gefrierschnitt er Epidermis ausprobiert.

Rattenserum von HPV20 E7 zeigte die stärkste Extinktion mit einem Wert von 1.7, HPV20 E6 von 1.140, HPV27 E7 von 1.033 und HPV27 E6 etwas geringer mit einem W

H

zellklone, für HPV20 E7 insgesamt 45, für HPV27 E6 25 und für HPV27 E7 insge-samt 39.

Die Spezifität der im S

diese Überprüfung für einige Hybridomüberstände von HPV20 E7 im Streifen-Western-Blot dargestellt. Insgesamt wurden 5 der 30 Hybridome von HPV20 E6, 36 der 45 von HPV20 E7, 3 der 25 HPV27 E6 und 8 der 39 von HPV27 E6 positiv g

d

Ergebnisse 112

Abbildung 17: Beispiel für das Austesten der unverdünnten Hybridomüberstände von HPV20 E7 im Streifen-Western-Blot. 1. Antikörper sind die verschiedenen Hybridomüberstände, 2.

Antikörper: Kaninchen polyklonal anti Ratte IgG 1:5000. Die Nummerierung der Klone ent-spricht den Klonnummern in der 96-Loch Platte. Der Strich markiert das obere Ende der Membran und ermöglicht eine korrekte Orientierung. Zusätzlich ist der in Ponceau S schwach gefärbte Markerstreifen dargestellt, der eine deutliche Bande bei 10 kD und zusätzlich einen Anschnitt der Bande aus dem präparativen Gel zeigt.

nung in einem 4.2.2.2 Charakterisierung der polyklonalen Antikörper

Die polyklonalen Kaninchenseren der „kleinen“, „großen“ und „finalen“ Blutung der Tiere wurden über eine SepharoseA-Agarose (3.2.13.1.) ebenfalls chroma-tographisch aufgereinigt und die Immunglobuline der Klasse IgG mit Glycin-Puffer (pH 3,9) eluiert.

Die Qualität und Quantität der einzelnen Eluate wurden nach Auftren

SDS-PAGE und einer der Coomassie-Färbung überprüft (Abb. 18). Die optische Dichte der neutralisierten Eluate wurde bei einer Absorption von 280nm gegen den

Ergebnisse 113

Elutionspuffer gemessen. Die Quantität der Immunglobulin-Fraktionen wurde nach Ermittlung des F/P-Quotienten (C= A280nm/1,2) bestimmt.

Abbildung 18: Vergleichende Darstellung der aufgereinigten, polyklonalen Kaninchenseren gegen HPV20E6, HPV20E7, HPV27E6 und HPV27E7. Es wurden jeweils 1µg Serumprotein (IgG-Fraktion) im 18%igen SDS-PAGE aufgetrennt.

Die Sensitivität der Kaninchenseren wurde in Verdünnungsreihen im Streifen-Western-Blot überprüft wie in Abb. 19 beispielhaft für HPV20 E6 dargestellt. Die aufgereinigten Proteine wurden alle bis zu einer Verdünnung der Kaninchenseren von 1:10000 detektiert.

Ergebnisse 114

Abbildung 19: Verdünnungsreihe des polyklonalen Kaninchenserums gegen HPV20 E6 im Streifen-Western-Blot. Aufgereinigtes HPV20 E6-Protein wurde auf einem präparativen 18%igen SDS-PAGE aufgetrennt und das gereinigte ,polyklonale Kaninchenserum gegen HPV20 E6 als 1. Antikörper in verschiedenen Verdünnungen e tzt. 2. Antikörper: Ziege polyklonal anti Kaninchen IgG alkalische Phosphatase 1:2500.Als Negativ-Kontrolle wurden verschiedene

4.2.3 Immunhistologischer Nachweis der viralen Proteine in transgener Mäusehaut

Sowohl die monoklonalen Ratten-Antikörper als auch polyklonales Kaninchenserum wurde in der immunhistologischen Untersuchung am Gefrierschnitt der transgenen Mäusehaut eingesetzt. Das Gewebe wurde während des UV-Experimentes in der 7.,

Sowohl die monoklonalen Ratten-Antikörper als auch polyklonales Kaninchenserum wurde in der immunhistologischen Untersuchung am Gefrierschnitt der transgenen Mäusehaut eingesetzt. Das Gewebe wurde während des UV-Experimentes in der 7.,

Im Dokument Der Einfluss der humanen Papillomaviren HPV20 und HPV27 auf die Entstehung von Nicht-Melanom-Hautkrebs in Interaktion mit chronischer UV-Bestrahlung (Seite 113-0)