photo-induzierten Abspaltung chemischer Schutzgruppen in oberflächengebundenen
molekularen Monoschichten
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Katja Drexler
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Chemie
Tag der mündlichen Prüfung: 12. Oktober 2016 1. Referent: Prof. Dr. U. E. Steiner
2. Referent: Prof. Dr. P. Leiderer
© Katja Drexler und Prof. Dr. Ulrich E. Steiner Alle Rechte vorbehalten
Ergebnisse aus dieser Arbeit wurden bereits publiziert in
K. Drexler, J. Smirnova, M. Galetskaya, S. Voss, M. Fonin, J. Boneberg, U. Rüdiger, P.
Leiderer, U. E. Steiner. X-ray Photoelectron Spectroscopy- and Surface Plasmon Resonance- Detected Photo Release of Photolabile Protecting Groups from Nucleoside Self-Assembled Monolayers on Gold Surfaces. Langmuir 2009, 25, 10794–10801.
K. Drexler, J. Smirnova, M. Galetskaya, N. Schweizer, G. Gauglitz, U. E. Steiner. Optical Detection of Photorelease Kinetics on Gold and Glass Surfaces Using Streptavidin-Coupled Biotinylated Photolabile Protecting Groups for Nucleosides. Chem.Phys.Chem. 2017, 18, 2890-2898.
und bei Tagungen vorgestellt
K. Gebauer. SPR and RIfS-Detected Photokinetics on Surfaces. Vortrag bei "Minisympo- sium Photochemie-Optische Spektroskopie-Sensorik", 27. 3.-31. 3. 2006, Riezlern (Klein- walsertal), Österreich.
K. Drexler, S. Voss, J. Smirnova, J. Boneberg, P. Leiderer, U. Rüdiger, U. E. Steiner.
Photokinetics of photolabile protecting groups on gold surfaces studied by XPS and SPR.
Poster bei CECP 2008 "Central European Conference on Photochemistry", 10.2.-14.2.
2008, Bad Hofgastein, Österreich (mit Posterpreis ausgezeichnet).
dessen Bearbeitung hatte, seine stete Unterstützung bei auftretenden Problemen, seine engagierte Betreuung, die hilfreichen und fruchtbaren Diskussionen, die mein Verständnis für die physikalische Chemie deutlich verbesserten, seine Hilfe mit den Kooperationspart- nern des Projekts sowie seine Geduld, sein Verständnis und seine Unterstützung bei der sich hingezogenen Bearbeitung der Dissertation. Er lehrte mich alles zu hinterfragen und lieber einen Blindtest mehr durchzuführen, um die gewonnenen Ergebnisse abzusichern, was einen signifikanten Einfluss auf meine Entwicklung als Wissenschaftlerin hatte.
Herrn Prof. Dr. Paul Leiderer danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens, für seine Hilfe und Unterstützung mit dem SPR-Aufbau, für die hilfreichen Diskussionen und für die Nutzung der Bedampfungsanlage.
Frau Prof. Dr. Karin Hauser danke ich für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes.
Herrn Prof. Dr. Johannes Boneberg und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die Hilfe rund um die SPR, insbesondere für seine tatkräftige Unterstützung bei der Optimierung des SPR-Aufbaus, durch die hochauflösende Messungen erst möglich wurden, für die hilfrei- chen und lehrreichen Diskussionen und für die Leihgabe einiger Geräte und Bauteile für SPR.
Herrn Prof. Dr. Günter Gauglitz von der Universität Tübingen und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die Möglichkeit der RIfS-Messung meiner Substanzen an deren Anlage, für die herzliche Aufnahme und für die Hilfe und Unterstützung bei den Messungen und der Optimierung der RIfS-Apparatur für photochemische Zwecke. Dabei möchte ich mich ins- besondere ganz herzlich bei Dr. Nina Schweizer bedanken, ohne deren Hilfe in der kurzen Zeit keine so guten Ergebnisse entstanden wären. Außerdem bedanke ich mich bei ihr für die nette und freundschaftliche Betreuung während meines Aufenthalts.
Herrn Prof. Dr. Ulrich Rüdiger danke ich für die Möglichkeit der XPS-Messung meiner Substanzen in seiner Arbeitsgruppe, insbesondere dabei Dr. Sönke Voss für seine Hilfe und Unterstützung bei den Messungen.
und die freundschaftliche Atmosphäre bedanken, insbesondere bei Marina Galetskaya und Julia Smirnova für die Synthese aller oberflächenaktiven Verbindungen, die in dieser Arbeit untersucht wurden. Weiterhin möchte ich Marina und Julia, sowie Jeannette Hafner für ihre Freundschaft und die netten Gespräche danken.
Geeta Charubala möchte ich für lehrreiche und unterhaltsame Gespräche und ihre Freundschaft sowie für ihre Unterstützung und Hilfe bei den HPLC-Messungen danken.
Bei Ina Seuffert möchte ich mich für ihre Hilfe bei biologischen Fragen und die Leihgabe einiger Geräte bedanken. Weiterhin danke ich Jan Müller für den gegenseitigen Erfah- rungsaustausch zum Umgang mit oberflächengebundenen molekularen Monoschichten.
Stefanie Müller, André Seeliger, Andrea Victora, Stefan Ambrus, Jessica Pape, Thomas Haas und Sylvia Hagmayer danke ich für ihre Freundschaft und die gemeinsame Zeit, die für den nötigen Ausgleich im stressigen Alltag während Studium und Promotion sorgte.
Bei meinen Eltern möchte ich mich ganz herzlich für ihre Unterstützung während des gesamten Studiums und besonders für ihre Hilfe in schwierigen Zeiten bedanken.
Außerdem danke ich meinem Vater für die Konstruktion und Anfertigung einer Reihe von Bauteilen für RIfS und SPR ohne die, die Messungen nicht möglich gewesen wären.
Ganz besonders danke ich Matthias für seine Liebe und Unterstützung während der langen Reise bis zum Ende der Promotion. In schwierigen Zeiten warst du mein Licht in der Dunkelheit. Vor allem aber dein unerschütterlicher Glaube an mich, als ich ihn selbst schon verloren hatte. Dafür danke ich dir von ganzem Herzen.
Abschließend möchte ich noch allen danken, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben und hier nicht namentlich erwähnt wurden.
"All great achievements require time."
-Maya Angelou
für Matthias
und für meine Eltern
1. Einleitung 1 1.1. Aufbau, Funktionsweise und Herstellung von DNA-Chips 1
1.2. Photolabile Schutzgruppen 4
1.3. Markierungsfreie Detektionsmethoden 8
1.4. Mögliche Verfahren zur Signalverstärkung 16
1.5. Aufgabenstellung 19
2. Messmethoden 21
2.1. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 21
2.1.1. Grundlagen 21
2.1.2. Entwicklung der SPR-Apparatur 25
2.2. Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) 30
2.3. Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) 33
2.3.1. Grundlagen 33
2.3.2. Modifizierung der RIfS-Anlage 35
2.3.3. Oberflächenmodifizierung der Transducer-Chips 39
3. Moleküldesign 45
4. Photokinetische SPR-Messungen an NPPOC- und I-NPPOC-Monoschichten 49
4.1. Einleitung 49
4.2. Kalibrierung des SPR-Signals 50
4.3. Blindtests 54
4.4. SPR-detektierte wellenlängenabhängige Photokinetik 57
4.5. Messung der Photokinetik mittels XPS 78
4.6. SPR-Messungen an verdünnten Monoschichten 89
4.7. SPR-Messung der Photokinetik mit unterschiedlicher Basenzugabe 92
4.8. Absorptionsmessungen auf dünnen Goldfilmen 97
5.1. Einleitung 104
5.2. Photokinetik von Bt-NPPOC-T-SH-SAMs 106
5.2.1. Photokinetik eines Streptavidin-Bt-NPPOC-T-SH-SAMs 110 5.2.2. Photokinetik eines verdünnten Streptavidin-Bt-NPPOC-T-SH-SAMs 112 5.2.3. Photokinetik in schwach basischem Puffer (pH 8) 114 5.3. Photokinetik von Streptavidin-2Bt-, 3Bt- und 4Bt-NPPOC-T-SH-SAMs 116 6. Photokinetische RIfS-Messungen an biotinylierten photolabilen Monoschichten 127
6.1. Einleitung 127
6.2. Vorexperimente 129
6.3. Photokinetik eines Bt-NPPOC-NH-SAMs 132
6.3.1. Absorptionsmessungen in Lösung 132
6.3.2. RIfS-Messung an der Glasoberfläche 134
6.4. Photokinetik von Streptavidin-Bt-NPPOC-NH-SAMs 135
6.5. Messung der Photokinetik von Bt-NPPOC-NH-SAMs mit SPR 142
6.5.1. Einleitung 142
6.5.2. Photokinetik eines Bt-NPPOC-NH-SAMs 143
6.5.3. Photokinetik von Streptavidin-Bt-NPPOC-NH-SAMs 145
7. Zusammenfassung 150
8. Experimenteller Teil 162
8.1. Liste der verwendeten Verbindungen 162
8.2. Versuchs- und Messbedingungen 163
8.2.1. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 164
8.2.2. Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) 168
8.2.3. Absorptionsmessung auf dünnen Goldfilmen (UV-Vis) 169 8.2.4. Reflektometrische Inteferenzspektroskopie (RIfS) 171
9. Literatur 174
A Absorbanz
BE Bindungsenergie
Bt-NPPOC-NH2 6-aminohexyl-2-(2-nitro-4-((2-(2-(2-(5-(2-oxo-hexahydro-1H- thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethoxy)ethoxy)ethyl) carbamoyl)phenyl)propylcarbonat
Bt-NPPOC-T-SH 6-mercaptohexyl(2R,3R,5R)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihy- dropyrimidin-1(2H)-yl)-2-(((2-(2-nitro-4-((2-(2-(2-(5-(2-oxo- hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethoxy) ethoxy)ethyl)carbamoyl)phenyl)propoxy)carbonyloxy)methyl)- tetrahydrofuran-3-yl succinat
2Bt-NPPOC-T-SH 2-(2-(2-(5-(2-oxo-hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl) pentanoyloxy)ethoxy)ethoxy)ethyl-4-(1-((((2R,3R,5R)-3-(4-(6- mercaptohexyloxy)-4-oxobutanoyloxy)-5-(5-methyl-2,4-dioxo- 3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-2-yl)methoxy) carbonyloxy)propan-2-yl)-3-nitrobenzoat
3Bt-NPPOC-T-SH 6-mercaptohexyl(2R,3R,5R)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihy- dropyrimidin-1(2H)-yl)-2-(((2-(2-nitrophenyl)-5-oxo-5-(2-(2-(2- (5-(2-oxo-hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanami- do)ethoxy)ethoxy)ethylamino)pentyloxy)carbonyloxy)methyl)- tetrahydrofuran-3-yl succinat
4Bt-NPPOC-T-SH 6-mercaptohexyl(2R,3R,5R)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihy- dropyrimidin-1(2H)-yl)-2-(((2-(2-nitrophenyl)-8-(5-(2-oxo-he- xahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)octylo- xy)carbonyloxy)methyl)-tetrahydrofuran-3-yl succinat COOH-PEG-COOH Dicarboxypolyethylenglykol
DFT Dichtefunktionaltheorie
DIC Diisopropylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
DMT-T-SH (2R,3S,5R)-2-((bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)methyl)- 5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)tetra- hydrofuran-3-yl (6-mercaptohexyl) succinate
GOPTS 3-Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan
HOMO Highest Occupied Molecular Orbital
HRXPS High Resolution X-ray Photoelectron Spectroscopy I-Bn-SH 6-(4-Iodobenzyloxy)hexan-1-thiol
I-NPPOC-T-SH 5’-O-[2-(5-iodo-2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]-3’-O-[3-(6- mercaptohexyloxycarbonyl)propanoylthymidin
LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital
NHS N-Hydroxysuccinimid
NPPOC-T-SH 5’-O-[2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl]-3’O-[3-(6-mercapto- hexyloxycarbonyl)-propanoyl]thymidin
PEG Polyethylenglykol
PBS Phosphate Buffered Saline
RIfS Reflectometric Interference Spectroscopy
SAM Self Assembled Monolayer
SPR Surface Plasmon Resonance (Oberflächenplasmonenresonanz) STM Scanning Tunneling Microscope (Rastertunnelmikroskop)
UV ultraviolett
XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy (Röntgenphotoelektronen- spektroskopie)
1. Einleitung
1.1. Aufbau, Funktionsweise und Herstellung von DNA-Chips
In der Molekularbiologie und der medizinischen Forschung hat die Sequenzierung von DNA- Fragmenten und kompletten Genomen eine grosse Bedeutung erlangt. So wurde im Rahmen des Human-Genom-Projekts und des darauf folgenden 1000-Genom-Projekts die komplette Erbgutinformation von mehr als 1000 unterschiedlichen Menschen ermittelt und der For- schungsgemeinschaft zur Verfügung gestellt.[1, 2] Die verschiedenen Methoden zur DNA-Se- quenzierung beruhen zumeist auf dem Prinzip, dass die DNA-Ketten in Fragmente bzw. Oli- gonukleotide unterschiedlicher Länge aufgespalten und analysiert werden. Anschliessend werden die erhaltenen Daten der Fragmente computerunterstützt zu einem Komplettdatensatz zusammengesetzt. Durch diese Herangehensweise reduziert sich die Problemstellung darauf, einen möglichst hohen Durchsatz bei der Sequenzierung der DNA-Fragmente zu erreichen.
Eine Möglichkeit dafür ist ein hoher Grad der Parallelisierung der Analysen. Dies hat zu der Entwicklung der DNA-Chip-Technologie (engl. DNA microarrays) geführt.[3-5]
Ursprünglich entwickelte sich diese Methode aus der schon vorher verbreiteten Southern- Blot-Analyse, welche auf der Fragmentierung der zu untersuchenden DNA, Spaltung in Ein- zelstränge und anschliessender Gelelektrophorese zur Separation nach Grösse basiert. Das Trennmuster kann danach auf einer Membranoberfläche (Nitrocellulose oder Nylon) fixiert werden. Anschliessend werden die aufgetrennten und immobilisierten DNA-Oligonukleotide mit entsprechenden Gensonden, meist RNA-Einzelsträngen bekannter Sequenz, identifiziert.
Dabei nutzt man die selektive Hybridisierung von RNA/DNA passender komplementärer Ba- sensequenz nach Watson-Crick aus (siehe Abbildung 1.1).[6]
Abbildung 1.1: Prinzip der Watson-Crick-Basenpaarung. Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwi- schen Adenin/Thymin und Guanin/Cytosin (R- Zucker-Phosphat-Stränge mit weiteren Basen).
Durch die hohe Spezifität der Basenpaarung kann schon ein einziges nicht zusammen passen- des Paar die Bindungsaffinität der Oligonukleotidstränge stark beeinflussen und damit die Bindung schwächen oder verhindern.
Bei DNA-Chips wird grundsätzlich ein vergleichbares Prinzip angewendet. Anstatt die Gen- sonden zu einer Matrix, welche die Oligonukleotid-Fragmente enthält, hinzuzugeben, werden stattdessen die Gensonden - also einsträngige RNA- oder DNA-Fragmente bekannter Sequenz - auf einer festen Oberfläche immobilisiert (siehe Abbildung 1.2). Jede definierte Gensonde bildet dabei einen einzelnen Spot auf dem DNA-Chip, und mit geeigneten Techniken lässt sich eine sehr hohe Spotdichte (mehrere 10000 Spots/cm²) erreichen.[4] Die zu untersuchenden Oligonukleotid-Fragmente, welche im Allgemeinen 20 - 30 Basenpaare umfassen, werden bei der DNA-Chip-Methode zuvor mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und anschliessend auf den DNA-Chip gegeben. Nach der selektiven Hybridisierung mit der entsprechenden Gensonde wird der Chip fluoreszenzspektrometrisch ausgelesen und die Fluoreszenzintensität der einzelnen Spots ausgewertet. Da die Sequenz der Gensonden pro Spot bekannt ist, kann dadurch auf die Sequenz der zu untersuchenden Fragmente zurückgeschlossen werden. DNA- Chips bieten daher einen hohen Grad an Parallelisierung.[7-14]
erfolgreicher Lesevorgang
Verankerung auf der Oberfläche
passt zur Sonde passt
nicht zur Sonde Sonde
Abbildung 1.2: Aufbau und Funktionsweise eines DNA-Chips.[15]
Wenn zwei unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe (gewöhnlich Cy3 und Cy5) verwendet werden, können zwei verschiedene fluoreszenzgelabelte Proben gleichzeitig auf einem Chip untersucht und verglichen werden. Dabei erhält man für unterschiedliche Anteile homologer Genbruchstücke in den beiden Proben Spots, in welchen eine Markierungsfarbe (z.B. rot oder grün) dominiert und bei gleichen Anteilen die Mischfarbe (z.B. gelb). Wenn in der Probe keine zur Chipbelegung passende komplementäre Sequenz vorliegt, wird keine Farbe in dem
zugehörigen Spot angezeigt (siehe Abbildung 1.2). Auf diese Weise erhält man Informationen über die Unterschiede in der Expression der Gene zwischen den beiden Proben. DNA-Chips können neben der Genexpressionsanalyse auch zur Untersuchung von Mutationen und Poly- morphismen einzelner Basen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) in bekannten Gen- sequenzen verwendet werden.[4, 16]
Ein wichtiger Aspekt der DNA-Chips ist deren Herstellung, an die besondere Anforderungen gestellt sind: eine möglichst hohe Spotdichte zu erreichen, bei gleichzeitig spezifischer Se- quenz der in den Spots angebundenen einzelsträngigen Gensonden. Grundsätzlich existieren zwei unterschiedliche Ansätze bei der Herstellung von DNA-Chips: die Anbindung vorsyn- thetisierter kompletter Oligonukleotid- bzw. DNA-Stränge[17], oder der sukzessive Aufbau dieser Stränge Nukleotid für Nukleotid auf der Oberfläche. Neben Methoden welche auf Mi- cro-Printing oder Micro-Fluidik-Techniken basieren, bietet vor allem der photolithographi- sche Ansatz unter Verwendung von photolabilen Schutzgruppen die Möglichkeit, sehr hohe Spotdichten auf DNA-Chips zu erreichen.[4, 18, 19]
Den ersten Schritt beim photolithographischen Aufbau bildet die Funktionalisierung der Oberfläche, hierbei werden meist Spacer mit endständigen OH-Gruppen auf dem Substrat verankert (siehe Abbildung 1.3). Die freien funktionellen Gruppen werden mit einer geeigne- ten photolabilen Schutzgruppe versehen, und dann werden im ersten photolithographischen Schritt mittels Lochmaske oder Mikrospiegeln definierte Teile des Chips belichtet und damit örtlich selektiv die photolabilen Schutzgruppen abgespalten.
Abbildung 1.3: Photolithographische Herstellung von DNA-Chips.[20]
Substrat
Substrat Maske
Maske Licht
Licht
Wiederholung der Schritte
Photolabile Schutzgruppe A, T, C, G Nukleotide
Entschützung Koppeln
Entschützen Koppeln
Nach diesem Schritt sind nun einzelne Bereiche des DNA-Chips weiterhin geschützt, wäh- rend in anderen Bereichen die freien OH-Gruppen vorliegen. Wenn nun das Substrat mit einem photolabil geschützten und Phosphoramidit-aktivierten Nukleotid umgesetzt wird, rea- giert dieses mit den freien OH-Gruppen auf der Oberfläche unter Abspaltung von Diisopro- pylamin (Phosphoramiditmethode mit NPPOC-Schutzgruppe siehe Kapitel 2.3.3 Abbildung 2.19). Die resultierende Phosphitgruppe, über die das Nukleotid an den Spacer gekoppelt ist, kann in einem zweiten Schritt zum Phosphat oxidiert werden. Je nachdem ob das 3'- oder das 5'-Ende des Nukleotids die Phosphoramidit-Gruppe trägt kann man die Anbindung (und damit die Richtung von welcher Seite der Oligonukleotidstrang aufgebaut wird) steuern.[21, 22]
Nun können wiederum andere Teile des DNA-Chips photolithographisch belichtet werden, und über analoge Prozesse sukzessiv mit den weiteren drei Nukleotiden funktionalisiert wer- den. Man erhält so nach vier dieser Zyklen ein Substrat, bei dem die Oberfläche je nach Spot eine der vier Basen trägt. Da alle diese Basen nun wiederum photolabil geschützt sind, kann man in vier weiteren Zyklen bei jedem Spot eine weitere Base hinzufügen. Insgesamt benötigt man 4 ∙ n Zyklen um einen Chip mit 4n Spots unterschiedlicher Oligonukleotidsequenz herzu- stellen. Bei einer üblichen Stranglänge von 25 Nukleotiden ergäbe dies bereits rein rechne- risch 1.15 ∙ 1015 Kombinationsmöglichkeiten. Damit erhält man also mit vergleichsweise we- nigen Syntheseschritten eine Vielzahl verschiedener Oligonukleotide auf dem Chip.[20, 23]
1.2. Photolabile Schutzgruppen
Eine entscheidende Rolle während des oben beschriebenen photolithographischen Prozesses kommt der verwendeten photolabilen Schutzgruppe zu, an die besondere Anforderungen ge- stellt sind. Einerseits sollte die photochemische Entschützung möglichst quantitativ erfolgen, da sonst Fehler in der Oligonukleotidsequenz entstehen können, andererseits soll sie auch möglichst rasch erfolgen, um den Syntheseprozess ökonomisch zu gestalten. Die Schutzgrup- pe sollte also eine möglichst hohe Lichtempfindlichkeit besitzen. Diese lässt sich durch das Produkt ε × quantifizieren, wobei ε dem molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten und
der Quantenausbeute der photochemischen Abspaltung entspricht. Zudem sollten Neben- reaktionen nur in geringstem Maße stattfinden, denn diese könnten beispielsweise dazu füh- ren, dass die entsprechende OH-Funktion am Ende des Oligonukleotidstrangs nicht frei wird, sondern irreversibel blockiert bleibt.
Die am häufigsten verwendeten photolabilen Schutzgruppen für den DNA-Chip-Aufbau ba- sieren auf einer von drei Grundklassen (siehe Tabelle 1): o-Nitrobenzyloxycarbonyl-Derivate
(ONBOC), (2-Nitrophenyl)ethyloxycarbonyl-Derivate (z.B. NPPOC) und Dimethoxybenzoin- carbonat-Derivate (DMBOC).[24-26] Unter den Schutzgruppen des DMBOC-Typs wird vor allem MeNPOC ((α-Methyl-2-nitropiperonyl)oxycarbonyl) vielfach angewendet.[27] Pfleiderer und Mitarbeiter veröffentlichten 1997 erstmals Arbeiten zu NPPOC (2-(2-Nitrophenyl)propo- xycarbonyl) als prominentestem Vertreter der zweiten Kategorie photolabiler Schutzgrup- pen.[28-30] Ein herausragender Vorteil der NPPOC-Schutzgruppe ist die Bildung von relativ unreaktiven o-Nitrostyrol-Verbindungen als Abspaltungsprodukten (siehe Abbildung 1.5) - im Vergleich zu den weitaus reaktiveren o-Nitrosobenzaldehyd-Derivaten, welche bei der photo- chemischen Spaltung von ONBOC-basierenden Verbindungen entstehen.
Struktur
ONBOC MeNPOC NPPOC DMBOC
×
[M-1cm-1] 300 300 95 < 200
Tabelle 1: übliche photolabile Schutzgruppen für die Herstellung von DNA-Chips und deren × Werte.[24, 25]
In Tabelle 1 sind die Werte für ε × der wichtigsten photolabilen Schutzgruppen dargestellt.
Untersuchungen haben gezeigt, dass die weithin verwendete MeNPOC-Schutzgruppe eine vergleichsweise niedrige Quantenausbeute der photochemischen Abspaltung aufweist, aber durch einen hohen molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten kann dennoch eine gute Lichtempfindlichkeit erreicht werden.[27] Bei NPPOC hingegen verhält es sich umgekehrt: die Quantenausbeute der photochemischen Abspaltung ist hoch, der Absorptionskoeffizient dage- gen deutlich geringer. Um die Gesamt-Lichtempfindlichkeit von NPPOC zu erhöhen, wurden umfangreiche Versuche zur Strukturoptimierung durchgeführt, wie beispielsweise durch Deri- vatisierung am aromatischen Ring.[28] Es zeigte sich jedoch, dass damit erreichte erhöhte Ab- sorptionskoeffizienten mit einer Verringerung der Quantenausbeute der photochemischen Ab- spaltung einhergehen.
Eine weitere Möglichkeit, die Lichtempfindlichkeit einer photochemischen Reaktion zu erhö- hen, ist die Sensibilisierung durch Anwesenheit einer geeigneten Sensibilisatorverbindung. Im
Allgemeinen handelt es sich dabei um ein Molekül, welches einen sehr hohen Absorptionsko- effizienten besitzt, und die bei der Anregung aufgenommene Energie strahlungslos an die photolabile Schutzgruppe weitergeben kann. Indem die photochemische Anregung im Sensi- bilisator stattfindet, umgeht man die Notwendigkeit, dass die Schutzgruppe selbst einen hohen Absorptionskoeffizienten besitzen muss.
In unserer Arbeitsgruppe wurden ausführliche Arbeiten zur Sensibilisierung der NPPOC-Ab- spaltung durchgeführt.[24, 31, 32] Zunächst wurde die Möglichkeit der intermolekularen Sensibi- lisierung untersucht. Dabei stellte sich Thioxanthon als geeigneter Triplett-Sensibilisator he- raus: die photochemische Spaltung von in Lösung befindlichem NPPOC-Thymidin war in Anwesenheit von Thioxanthon bis zu 5 mal schneller (siehe Abbildung 1.4).
Abbildung 1.4: Kinetik der direkten und der mit Thioxanthon sensibilisierten photochemischen Spaltung von NPPOC geschütztem Thymidin.[32]
Es zeigte sich zudem, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der intermolekularen Sensibilisierung darin besteht, dass das angeregte Sensibilisatormolekül während seiner Trip- lett-Lebensdauer per Diffusion auf ein Schutzgruppenmolekül treffen muss, um eine Energie- übertragung zu ermöglichen. Bei der Sensibilisierung von oberflächengebundenen photolabi- len Schutzgruppen, wie es bei der DNA-Chip-Synthese der Fall ist, müssen die angeregten Sensibilisatormoleküle sich deswegen bereits sehr nahe an der Oberfläche befinden, um über- haupt innerhalb der Triplett-Lebensdauer die Oberfläche erreichen zu können. Auf diesen Ar- beiten aufbauend, wurde daher eine Reihe von NPPOC-Derivaten mit kovalent verknüpftem Thioxanthon-Rest entwickelt, und deren photochemische Eigenschaften in Lösung und auf der Chipoberfläche untersucht.[24, 33-36]
Relative Absorbanz
t [s]
direkt
sensibilisiert
Sämtliche Arbeiten zur Verbesserung der Eigenschaften photolabiler Schutzgruppen setzen ein Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen voraus. Im Bezug auf NPPOC wurden von Walbert et al. ausführliche Untersuchungen zur Aufklärung der möglichen Reaktionswe- ge durchgeführt.[37, 38] Abbildung 1.5 zeigt den dabei nachgewiesenen Mechanismus. Der ein- leitende Reaktionsschritt ist die Absorption von Lichtenergie über einen nπ*-Übergang und Entstehung des angeregten Singulett-Zustands. Dieser kann entweder durch Interne Konver- sion (Internal conversion, IC) in den Grundzustand übergehen, oder es findet ein Inter System Crossing (ISC) zum Triplett-Zustand statt. Anschließend wird durch eine schnelle intramole- kulare Wasserstoffübertragung ein Triplett-Biradikal gebildet, welches durch Relaxation und ISC in das Acinitro-Zwischenprodukt übergeht.
Abbildung 1.5: Mechanismus der photochemischen Abspaltung der NPPOC-Schutzgruppe.[38]
Abhängig vom pH-Wert des Reaktionsmediums sind nun zwei unterschiedliche Wege offen.
Bei hohem pH-Wert kann die Acinitro-Form ein Proton abgeben und eine Eliminierung des Restes RO- erfolgen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die zu schützende OH-Gruppe über eine -OC(O)O- Brücke (d.h. als Carbonat, vgl. Tabelle 1) mit der OH-Funktion der photolabi-
len Schutzgruppe zu verbinden. Das austretende -O2COR- Anion zerfällt dann schnell in CO2
und das Alkoholatanion. Als Nebenprodukt entsteht ein Styrolderivat, welches im Allgemei- nen die weiterführenden Reaktionen nicht stört.
Unter sauren Bedingungen erfolgt jedoch keine Deprotonierung des Acinitro-Zwischenpro- dukts. Statt dessen findet eine intramolekulare Zyklisierung mit nachfolgender Zykloreversion zu einem Nitroso-Derivat statt. In diesem Reaktionsendpunkt ist die geschütze Alkoxy-Funk- tion immer noch gebunden, bzw. irreversibel geschützt. Es zeigt sich also, dass die Verwen- dung von NPPOC unter sauren Bedingungen zu unerwünschten Nebenreaktionen führen kann. Während der DNA-Chip-Synthese würde dies zum Abbruch des entsprechenden Oligo- nukleotidstrangs und damit zu einem Fehler auf der Oberfläche führen.
Aufgrund des komplexen Mechanismus, welcher der photochemischen Abspaltung von Schutzgruppen zugrunde liegt, und einer Vielzahl weiterer Faktoren, welche den Aufbau von DNA-Chips beeinflussen können, ist es von grossem Interesse, die Synthese der Oligonukleo- tide auf der Oberfläche beobachten, bzw. kontrollieren zu können.
Die bisherige Methode zur Kontrolle der Abspaltung während des Prozesses verläuft über die Markierung der frei gewordenen Alkoholfunktionen mit einem Fluoreszenzfarbstoff. Durch Auslesen der Fluoreszenz auf dem Chip in einem entsprechenden Fluoreszenzspektrometer, einem Chip-Reader, kann dann darauf zurückgeschlossen werden, ob die photochemische Ab- spaltung vollständig, bzw. über den ganzen Chip hinweg homogen war. Der grosse Nachteil dieser Technik ist jedoch, dass der Chip nach der Kontrolle nicht mehr verwendet werden kann, da sämtliche Oligonukleotidstränge mit dem Fluoreszenzmarker permanent blockiert sind.
1.3. Markierungsfreie Detektionsmethoden
Neben der Detektion durch Fluoreszenzmarkierung, die zuvor erwähnt wurde, können Reak- tionen an Oberflächen auch über verschiedene optische Methoden verfolgt werden, die ohne eine strukturelle Veränderung der zu untersuchenden Moleküle durch Anknüpfen einer che- mischen, radioaktiven oder fluoreszenten Markergruppe, sogenanntes Labeln, auskommen. In der chemischen und biochemischen Sensorik werden Methoden wie Interferometrie, Grating Coupler, Resonant Mirror, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Ellipsometrie und Reflek- tometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) verwendet.[39-43] Man bestimmt bei diesen opti- schen Methoden die Änderungen im effektiven Brechungsindex an der Sensoroberfläche und kann damit auf Änderungen in der Dicke adsorbierter Schichten zurückschliessen. Sie finden
Anwendung zur direkten Echtzeit-Untersuchung einer Vielzahl unterschiedlicher chemischer und biochemischer Wechselwirkungen mit an der Sensoroberfläche immobilisierten Molekü- len wie beispielsweise Protein-Ligand-Wechselwirkungen, Protein-Protein-Wechselwirkun- gen oder Oligonukleotidhybridisierungen. Eine weit verbreitete Methode ist die Oberflächen- plasmonenresonanz (SPR), da für einige Standardanwendungen entsprechende Geräte kom- merziell erhältlich sind und für diese Zwecke optimiert wurden. Eine typische Anordnung nach Kretschmann (siehe Kapitel 2.1) ist in Abbildung 1.6 a dargestellt.
Abbildung 1.6: a) Anordnung nach Kretschmann zur Anregung von Oberflächenplasmonen. b) Reflektivität ge- gen Einfallswinkel des Messlichts, im Resonanzfall tritt ein ausgeprägtes Minimum in der Signalkurve auf.[44]
Dieser Aufbau hat sich in den letzten Jahren etabliert und wird derzeit meistens für SPR-Mes- sungen verwendet. Dabei wird die Grundfläche eines Prismas mit einem etwa 50 nm dicken Metallfilm (meist Gold oder Silber) beschichtet. Parallel polarisiertes Licht wird an der Grundseite des Prismas totalreflektiert. Bei einem bestimmten Einfallswinkel werden in der Metallschicht Oberflächenplasmonen über das evaneszente Feld angeregt, wenn eine be- stimmte Resonanzbedingung erfüllt wird. Diese hängt vom Brechungsindex des an den Me- tallfilm angrenzenden Mediums ab.
Wenn das reflektierte Licht über einen Detektor gemessen wird, kann im Resonanzfall eine Schwächung des totalreflektierten Lichtstrahls festgestellt werden. Beim Resonanzwinkel tritt dann ein Minimum in der Signalkurve auf (siehe Abbildung 1.6 b). Änderungen an der Ober- flächenschicht wie beispielsweise durch Adsorption von Molekülen führen zu einer Änderung des Brechungsindexes in der dielektrischen Schicht und bewirken damit eine Verschiebung des Resonanzwinkels. Diese Verschiebung verhält sich proportional zur Änderung in der Schichtdicke des Dielektrikums.[44-46]
Das evaneszente Feld klingt etwa auf der Strecke einer halben Wellenlänge des Messlichts ex- ponentiell in die dielektrische Schicht ab, so dass bei Verwendung von rotem Licht die Ein- dringtiefe nur wenige 100 nm beträgt und Oberflächenmessungen auf diesen Bereich begrenzt
a b
sind.[41] Obwohl das elektromagnetische Feld der Oberflächenplasmonen evaneszent in den Metallfilm und die dielektrische Schicht abklingt, liegt es überwiegend im Dielektrikum vor, da es im Metall stärker gedämpft wird.[39, 42]
Anstelle eines Prismas kann man für SPR-Messungen auch ein Beugungsgitter (Grating Coupler) verwenden, welches mit einer dünnen Goldschicht (50 - 200 nm) bedampft wurde.
Man beleuchtet das Gitter von der Rückseite und detektiert das reflektierte Licht. Die Anre- gung eines Oberflächenplasmons wird dann ebenso durch Messung des Reflexionsminimums bei fester Einstrahlungswellenlänge bei einem bestimmten Einfallswinkel festgestellt. Durch Adsorption von Molekülen an der Gitteroberfläche ändert sich der Brechungsindex, was zu einer Verschiebung des Einfallswinkels führt.[43] Durch Kombination des Gitters mit einem Substrat und einer Deckschicht, die die Gitterlücken auffüllt, erhält man einen Wellenleiter (siehe Abbildung 1.7). Dazu sollte der effektive Brechungsindex des Gitters größer als der des Substrates oder der Deckschicht sein.[39]
Abbildung 1.7: schematischer Aufbau eines Resonant Grating Waveguides.[39]
Polarisiertes Licht mit einer bestimmmten Wellenlängenbandbreite wird von der Substratseite eingestrahlt, welches gebeugt wird und in den Wellenleiter einkoppelt. Ein Detektor zeichnet dann die Wellenlänge des reflektierten Lichts auf, bei der Resonanz auftritt. Man kann wie bei SPR die Anbindung von kleinen Molekülen bis zu Proteinen verfolgen, vor allem wird es aber zur Beobachtung der Massenumlagerung von Proteinen und Organellen in lebenden Zellen nach der Behandlung mit Testsubstanzen genutzt.[47, 48] Die erhaltenen Ergebnisse können eine wichtige Rolle in der Wirkstoffforschung spielen. Nachteilig für diese Messtechnik ist je- doch die geringe Eindringtiefe (wenige 100 nm) der evaneszenten Welle der Biosensoren, da
Diffracted Light Incident Light
Evanescent Wave
Biological Layer Cover Layer Grating Waveguide Substrate Layer
Detector Resonant Grating Waveguide
aufgrund der Größe von Zellen (mehrere µm) die Ergebnisse nur für bestimmte Bereiche aus- sagekräftig sind.
Eine SPR ähnliche Methode ist der Resonant Mirror (siehe Abbildung 1.8). Dabei wird anstel- le eines Metallfilms ein Prisma mit einer dielektrischen Schicht von niedrigem Brechungsin- dex und dann mit einer zweiten Schicht von hohem Brechungsindex belegt. Damit erhält man eine Wellenleiterstruktur, in die das Licht nach Passieren des Prismas über die dielektrische Schicht mit niedrigem Brechungsindex eingekoppelt werden kann. Dadurch ist im Vergleich zu SPR eine höhere Empfindlichkeit durch schärfere Resonanzpeaks möglich, die Verschie- bung im Resonanzwinkel ist jedoch deutlich geringer (weniger als die Hälfte).[43] Änderungen an der Sensoroberfläche verschieben den Winkel, bei dem das eingestrahlte Licht mit den Re- sonanzmoden in Phase ist und eine starke Reflexion am Detektor gemessen werden kann.
Diese Methode wurde benutzt, um verschiedene molekulare Wechselwirkungen mit Makro- molekülen zu beobachten, hat aber heute kommerziell keine Bedeutung mehr.[39]
Abbildung 1.8: schematischer Aufbau eines Resonant Mirrors.[39]
Interferometrische Sensoren werden in zwei verschiedenen Anordnungen verwendet. Beim differentiellen Interferometer werden parallel polarisiertes Licht (TM = transversal magne- tisch) und senkrecht polarisiertes Licht (TE = transversal elektrisch) parallel in einen Wellen- leiter eingekoppelt (siehe Abbildung 1.9 a). Änderungen im Brechungsindex an der Sensor- oberfläche durch Adsorption von Molekülen bewirken Phasenänderungen bei dem eingekop- pelten Licht. Der Phasenunterschied zwischen p- und s-polarisiertem Licht wird gemessen. Er verhält sich proportional zur Adsorption an der Sensoroberfläche.[43]
Beim Mach-Zehnder-Interferometer wird Licht in einen Wellenleiter eingekoppelt, welches in zwei Kanäle aufgeteilt wird (siehe Abbildung 1.9 b). Einer dient als Referenz, an der Oberflä-
che des Anderen können Moleküle adsorbiert werden, was eine Änderung im Brechungsindex des Dielektrikums und damit innerhalb des Bereichs des evaneszenten Feldes einen Phasenun- terschied zwischen den beiden Teilstrahlen zur Folge hat. Nach der Rekombination der Teil- strahlen kann ein charakteristisches Interferenzmuster abhängig von der Änderung an der Sen- soroberfläche gemessen werden.[40, 43]
Abbildung 1.9: a) Differentielles Interferometer. b) Mach-Zehnder-Interferometer. c) Ellipsometrie.[40]
Bei der Ellipsometrie wird das unterschiedliche Reflexionsverhalten von senkrecht und pa- rallel polarisiertem Licht an dünnen Filmen genutzt (siehe Abbildung 1.9 c). Sie weisen ein unterschiedliches Reflexionsvermögen und unterschiedliche Phasenunterschiede auf, wenn sie an Mono- oder Multischichten abhängig von deren Brechungsindex oder deren Dicke reflek- tiert werden. Daher kann man mit dieser Methode die optischen Eigenschaften wie Bre- chungsindex und Dicke einer adsorbierten Schicht bestimmen. Die Methode ist sehr empfind- lich und lässt auch Messungen von dünnen Schichten zu, die mit weniger als einer Monolage bedeckt sind. Sie findet deshalb sehr häufig Anwendung zur Messung der optischen Eigen- schaften dünner adsorbierter Filme.[40, 43]
Die reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) beruht auf der Mehrfachreflexion von Licht an dünnen transparenten Schichten (siehe Abbildung 1.10).
Abbildung 1.10: Prinzip der RIfS-Detektion. Die beiden linken Abbildungen zeigen die Überlagerung der re- flektierten Lichtstrahlen während der Anbindung von Molekülen an die Sensoroberfläche. Rechts ist die entspre- chende Änderung im charakteristischen Interferenzspektrum und die sich ergebende Bindungskurve darge- stellt.[49]
a b c
Das Licht wird an den Phasengrenzen teilweise reflektiert und transmittiert, wobei die reflek- tierten Teilstrahlen miteinander interferieren und ein charakteristisches Interferenzspektrum ergeben. Änderungen an der Sensoroberfläche durch Adsorption von Molekülen verschieben das Interferenzspektrum. Die Verschiebung ist proportional der Änderung in der optischen Schichtdicke, welche sich aus dem Produkt aus dem Brechungsindex n der adsorbierten Schicht und der physikalischen Schichtdicke d ergibt. Wenn man ein Extremum des Interfe- renzspektrums beobachtet, kann man Adsorptions- oder Bindungsvorgänge von Molekülen an der Oberfläche zeitaufgelöst verfolgen.[40, 49, 50]
Bildung von molekularen Monoschichten auf der Sensoroberfläche
Für diese unterschiedlichen optischen Detektionsmethoden werden Substrate mit Metall- oder Glasoberflächen verwendet. Oftmals ist es nicht günstig die Sensoroberfläche mit den zu un- tersuchenden biologischen Makromolekülen direkt zu belegen. Daher werden die Oberflächen zunächst funktionalisiert, um die Anbindung der Makromoleküle zu ermöglichen und um un- spezifische Anbindungen zu reduzieren. Die Sensoroberflächen können auf diese Weise für die Anforderungen der jeweiligen Untersuchungen individuell angepasst werden.[22, 39] Auf Metalloberflächen wie Gold oder Silber bilden sich durch spontane Adsorption aus verdünn- ten Lösungen geordnete und orientierte monomolekulare Schichten sogenannte selbstorgani- sierende Monoschichten oder SAMs (self-assembled monolayers). Häufig werden für die Bil- dung von SAMs Thiole, Disulfide und Sulfide wegen ihrer starken Adsorption an Metallober- flächen verwendet [51] (siehe Abbildung 1.11).[52]
Abbildung 1.11: Schema der Bildung eines Thiol-SAMs mit funktionellen Gruppen (Kreise) als Endgruppen auf einem Goldsubstrat.[52]
Diese oberflächenaktiven Endgruppen ordnen sich an der Goldoberfläche an und leiten den Selbstorganisationsprozess der Monoschicht durch Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen
ein. Danach richten sich die Spacergruppen, meist Alkylketten, aus und ordnen sich parallel an. Über endständige funktionelle Gruppen können Biomoleküle wie Oligonukleotide oder Proteine an den SAM gebunden werden. Es findet eine schnelle, diffusionskontrollierte Ad- sorption der Thiole statt, gefolgt von einer langsamen Organisation der Spacergruppen und der Bildung einer kristallinen Monoschicht. Van der Waals-Kräfte zwischen den Methylen- gruppen der Alkylkette sind für die Orientierung und die Stabilität der Monoschicht verant- wortlich.[51-53]
Porter et al.[54] zeigten, dass langkettige Alkylthiole (n 9) dicht gepackte, kristalline Mono- schichten bilden, wobei die komplett ausgestreckten Alkylketten um 20 - 30° zur Oberfläche geneigt sind. Alkylthiole mit kürzeren Ketten hingegen weisen weniger geordnete, labilere Monoschichten auf.[51, 54] Dies wurde auch durch Untersuchungen von D. A. Hutt und G. J.
Leggett zur Photostabilität von Alkylthiol-SAMs unterschiedlicher Kettenlänge deutlich.[55]
Die Bestrahlung der Oberfläche mit UV-Licht bewirkte bei kurzkettigen SAMs (n 8) eine schnelle Photooxidation aufgrund der stärker ungeordneten Monoschichten, während bei dicht gepackten langkettigen Monoschichten (n 12) die Photooxidation viel langsamer ablief und mit steigender Kettenlänge n abnahm.
Oft werden auch gemischte SAMs verwendet, wobei die Monoschicht mit einem kurzkettigen Alkylthiol wie Mercaptohexanol "verdünnt" wird (siehe Abbildung 1.12 a und b).
Abbildung 1.12: a) Reiner SAM von Thiol-derivatisierter einzelsträngiger DNA. b) Gemischter SAM von Thiol-derivatisierter einzelsträngiger DNA und Mercaptohexanol. c) Multischichten über Affinitätsreaktion von Biotin-Streptavidin. Gemischter SAM mit biotinyliertem Thiol verbessert die Verfügbarkeit von oberflächenge- bundenem Streptavidin für biotinylierte Biomoleküle.[51]
a
b
c Glas
Gold gemischter Thiol-SAM
Streptavidin
Probe DNA Target DNA Fluoreszenzlabel
Man kann auf diese Weise die Dichte der reaktiven Gruppen an der Substratoberfläche kon- trollieren und es tritt weniger sterische Hinderung auf, wenn voluminöse Moleküle wie Pro- teine oder DNA mit der Monoschicht in Wechselwirkung gebracht werden.[51, 56] Unspezifi- sche Wechselwirkungen von Proteinen mit immobilisierten SAMs können durch Oligoethy- lenoxid-Gruppen im Alkylthiol-Spacer reduziert werden.[57] Durch die Verwendung von bioti- nylierten Thiolen kann man mit Streptavidin unter Ausnutzung der starken Biotin-Streptavi- din-Bindung (siehe Kapitel 1.4) Multischichten aufbauen (siehe Abbildung 1.12 c), die sich für eine Vielzahl verschiedener Untersuchungen nutzen lassen.
Die Oberfläche von Substraten mit endständigen Hydroxylgruppen wie Glas kann mittels Si- lanisierung für die Immobilisierung von Biomolekülen chemisch modifiziert werden. Es bil- den sich selbstorganisierende Silanmonoschichten, deren Beschaffenheit von der chemischen Struktur der verwendeten Silanverbindung und der Dichte der Silanolgruppen an der Oberflä- che abhängt. Zunächst werden die Silane bei Anwesenheit von Wasser an der Oberfläche zu Silantriolen hydrolisiert, die sich dann durch Physisorption über Wasserstoffbrücken an die Substratoberfläche anlagern (siehe Abbildung 1.13).
Abbildung 1.13: Schema der Silanisierung einer Glasoberfläche.[51]
Diese reagieren mit den freien Hydroxylgruppen an der Oberfläche nach einem SN2 Mecha- nismus in einer Kondensationsreaktion. Aufgrund der Reaktivität der nicht reagierten Silanol- gruppen tritt eine Quervernetzung der Moleküle auf, die zur Stabilität der Monoschicht bei- trägt.[51] Über funktionelle Endgruppen können die Probenmoleküle dann mit der Mono- schicht reagieren und deren Anlagerung oder Wechselwirkungen mit anderen Targetmolekü- len kann mit einer geeigneten Detektionsmethode verfolgt werden. Meist werden jedoch zu- sätzlich Spacermoleküle über die Endgruppen des Silans eingeführt, um die Oberfläche für die jeweiligen Untersuchungszwecke zu optimieren.[22]
1.4. Mögliche Verfahren zur Signalverstärkung
Die in Kapitel 1.3 beschriebenen markierungsfreien Detektionsmethoden basieren grundsätz- lich auf der Messung der Änderung der Schichtdicke von dünnen oberflächengebundenen Schichten. Unter Umständen könnte es möglich sein, dass bei der Untersuchung kleiner Mole- küle die Sensitivität der Messmethode nicht ausreicht, um verlässliche Signale aufzuzeichnen.
Eine Signalverstärkung durch eine Modifizierung der Probenmoleküle mit geeigneten Anker- gruppen könnte in diesem Fall die Detektion des Signals verbessern. Diese Gruppen sollten sich leicht an das Probenmolekül chemisch anknüpfen lassen und sollten nicht, insbesondere bei Biomolekülen, deren Funktion einschränken oder blockieren. Dafür könnten sich große, voluminöse Moleküle wie beispielsweise Dendrimere (siehe Abbildung 1.14) eignen, die über einen Linker an die Probenmoleküle angeknüpft werden können.
Abbildung 1.14: Spezielles homofunktionelles Crosslinker-Dendrimer. Ein Kernmolekül wird durch verschiede- ne Reaktionsschritte zu einem Dendrimer erweitert.[51]
Aufgrund der vielen verzweigten Endgruppen wurden sie bisher zur Funktionalisierung von Substratoberflächen verwendet, um eine höhere Beladungsdichte mit Probenmolekülen und eine leichtere Wechselwirkung mit Biomolekülen durch die Distanz zur festen Oberfläche zu erreichen. Zudem wurden auch fluoreszenzgelabelte Dendrimere aufgrund der größeren An- zahl an lokalisierten Farbstoffgruppen zur Erhöhung der Sensitivität genutzt.[58, 59] Weiterhin wurden zur Signalverstärkung Latexpartikel, kolloidales Gold und Liposome verwendet. Häu- fig wurden Goldnanopartikel, die an Biomoleküle wie DNA oder Antikörper gebunden wur- den, zur Steigerung der Empfindlichkeit von SPR-Messungen eingesetzt.[60-65] Organoplatin- verbindungen fanden ebenso erfolgreich Anwendung als Label bei der Untersuchung von
Kern
Kette
Dendrimer
Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen mittels SPR und trugen zur Signalverstärkung bei Kohlenhydraten mit niedriger Molmasse bei.[66]
Eine andere Möglichkeit die Empfindlichkeit von SPR-Messungen zu erhöhen, ist die Kombi- nation mit Fluoreszenzmessungen, was zur Entwicklung der surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) führte. Dabei werden Targetmoleküle mit Fluoreszenzfarb- stoffen gelabelt, die durch das elektromagnetische Feld der Oberflächenplasmonen angeregt werden. Das sich ergebende Fluoreszenzsignal wird neben dem SPR-Signal detektiert und steigert durch die höhere Empfindlichkeit der Fluoreszenz die Sensitivität der Messung für kleine Moleküle. Ein großer Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass Quenchen der Fluores- zenz in der Nähe der Goldoberfläche. Daher werden für diese Messungen modifizierte Sub- stratoberflächen verwendet, die die Distanz zwischen Gold und Fluorophor erhöhen. Oft wer- den dafür Polymere wie Polyethylenglykol oder Dextran oder Proteine wie Streptavidin (siehe Abbildung 1.15) auf die Oberfläche gebracht über die Probenmoleküle angebunden werden können.[67-70]
Abbildung 1.15: links: asymmetrische Einheit von Streptavidin mit gebundenem Biotin. rechts: Streptavidin mit 4 gebundenen Molekülen Biotin.[71]
Wie schon in Kapitel 1.3 erwähnt, wird Streptavidin, wegen seiner starken Bindung mit Bio- tin und der Fähigkeit vier Biotinmoleküle zu binden, häufig zur Bildung von Multischichten auf Substratoberflächen verwendet. Aufgrund seiner Größe wird es unter anderem auch zur Signalverstärkung bei SPR-Messungen mit biotinylierten Probenmolekülen genutzt.[64] Dabei wurde ein Komplex aus einem biotinyliertem Protein und Streptavidin gebildet, um die Em-
pfindlichkeit des SPR-Signals bei der Adsorption eines biotinylierten Antikörpers zu erhöhen.
Aufgrund seiner Eigenschaften und hohen Stabilität eignet sich Streptavidin für viele ver- schiedene molekularbiologische Untersuchungen. Bei Streptavidin handelt es sich um ein te- trameres Protein (~ 60000 Dalton), das aus den Bakterien Streptomyces avidinii isoliert wer- den kann (siehe Abbildung 1.15). Jedes Monomer kann ein Molekül Biotin spezifisch und mit sehr hoher Affinitätskonstante (Ka ~ 1015 M-1) binden. Dabei handelt es sich um eine der stärksten bekannten nicht-kovalenten Proteinbindungen. Die Untereinheiten von Streptavidin weisen eine acht-strängige antiparallele -Barrelstruktur auf, wobei der erste und der letzte - Strang aneinander angrenzen und über Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Biotin bindet in der Bindungstasche am Ende des Streptavidin--Barrels.
Die Wechselwirkungen von Biotin mit den Aminosäureresten von Streptavidin sind in Abbildung 1.16 dargestellt.
Abbildung 1.16: Wechselwirkungen von Biotin mit Streptavidin in der Bindungstasche.[71]
Es handelt sich dabei hauptsächlich um Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals Wechselwirkungen, die für die sehr starke Biotin-Streptavidin-Bindung verantwortlich sind und sie nahezu irreversibel machen. Im Vergleich zum verwandten Glykoprotein Avidin, wel- ches aus Eiweiß gewonnen wird und Biotin ebenso stark binden kann, tritt bei Streptavidin weniger unspezifisches Bindungsverhalten auf.[72-77] Daher wird für die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen an Oberflächen bevorzugt Streptavidin verwendet. Es ist wichtig, dass die eingesetzten Proteine spezifisch an die Oberfläche binden, d.h. nur mit oberflächen-
gebundenen Sonden wechselwirken, um fehlerhafte oder falsch-positive Messungen zu ver- meiden und um die gebundene Menge an Protein besser quantifizieren zu können.
1.5. Aufgabenstellung
Die Qualität von DNA-Chips, die durch lichtgesteuerte in situ Synthese hergestellt wurden, hängt entscheidend von der Effizienz der verwendeten photolabilen Schutzgruppen ab. Bisher wurde, wie schon in Kapitel 1.2 erwähnt, zur Kontrolle der photolithographischen Herstellung der DNA-Chips die Synthese unterbrochen, die endständigen photolabilen Schutzgruppen ab- gespalten und die dadurch entschützten 5’-OH-Gruppen mit einem Fluoreszenzfarbstoff mar- kiert. Dieser Träger konnte dann in einem Chip-Reader ausgelesen und die Homogenität der Oberfläche anhand der Helligkeit der Farbspots ausgewertet werden. Der Nachteil dieser Me- thode besteht darin, dass nach der Auswertung des Chips die Synthese nicht wieder fortge- setzt werden kann, da sich der Farbstoff nicht mehr entfernen lässt. Außerdem kann man den Fertigungsprozess damit nur stichprobenartig kontrollieren.
Wünschenswert wäre eine Methode, die eine Kontrolle während der Synthesezyklen sozusa- gen „online“ erlaubt. Dazu könnten markierungsfreie Detektionsmethoden wie SPR und RIfS geeignet sein, da bei diesen die Verfolgung von Schichtdickenänderungen auf Oberflächen in situ möglich ist. Die einzelnen Syntheseschritte und das Wachsen der Oligonukleotidketten könnte dann direkt über die Änderung in der Schichtdicke beobachtet werden. Dies könnte die Fertigung der DNA-Chips erheblich verbessern und erleichtern. Obwohl bei der großtechni- schen Herstellung sicherlich weiterhin aus Zeitgründen auch mit diesen Methoden nur stich- probenartig kontrolliert werden würde, könnte es für Optimierungsprozesse hilfreich sein. Da- her ist es von Interesse, die Photokinetik der Entschützung der Oberfläche unter den Herstel- lungsbedingungen der Chips zu untersuchen, um die Effizienz der Schutzgruppen verbessern zu können.
Ein Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau einer SPR-Anlage und deren Optimierung, um die Photokinetik der Abspaltung der schon bekannten NPPOC-Schutzgruppe von zunächst einem oberflächengebundenen Nukleotid in gutem Signal-Rausch-Verhältnis verfolgen zu können. Zur Kontrolle der Ergebnisse, bzw. der Interpretation der Signale, sollten parallel XPS-Messungen herangezogen werden. Bei nicht ausreichend aufgelösten Signalen sollte auch auf eine Modifizierung der photolabilen Schutzgruppe zurückgegriffen werden, bei- spielsweise durch Verwendung der Biotin-Streptavidin-Bindung, um eine effektive Ver-
größerung der Schutzgruppe und damit eine Signalverstärkung zu erreichen. Modifizierungen dieser Art wurden bei photolabilen Schutzgruppen bisher noch nicht durchgeführt, so dass nicht bekannt ist, ob die Verknüpfung mit einem voluminösem Rest zu einer Beeinträchtigung der Effizienz der Schutzgruppe führt. Zusätzlich zu den SPR-Untersuchungen auf Goldober- flächen sollte versucht werden, die entsprechenden Experimente, mit Hilfe der RIfS-Methode an Glasoberflächen durchzuführen, um so die Leistungsfähigkeit und Aussagekraft der beiden Methoden direkt vergleichen zu können.
2. Messmethoden
2.1. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)
2.1.1. Grundlagen
Oberflächenplasmonen sind kollektive Schwingungen der elektrischen Ladungen der Lei- tungselektronen an der Grenzfläche zwischen einem Metall und einem Dielektrikum (siehe Abbildung 2.1). Die Plasmaoszillationen verlaufen longitudinal zur Grenzfläche (x-Richtung).
Das dabei auftretende elektromagnetische Feld weist ein Maximum an der Oberfläche auf und klingt senkrecht zur Grenzfläche von Metall und Dielektrikum (z-Richtung) beidseitig expo- nentiell ab. Diese elektromagnetischen Felder werden evaneszente Felder genannt. Aufgrund der damit verbundenen Oberflächensensitivität sind Oberflächenplasmonen gut geeignet, um Änderungen nahe der Metalloberfläche zu untersuchen.[43, 45, 46]
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Ladungsverteilung und des elektromagnetischen Feldes von Oberflächenplasmonen, die sich entlang einer metallisch/dielektrischen Grenzfläche in x-Richtung ausbreiten.
Das elektromagnetische Feld klingt senkrecht zur Grenzfläche exponentiell in beiden Richtungen ab.[46]
Das elektromagnetische Feld der Oberflächenplasmonen wird beschrieben durch die Glei- chung
) (
0
, z t
k x k
i x z
e E
E
(Gl. 2.1)wobei + für z > 0 (Dielektrikum) und – für z < 0 (Metall) steht. Der Parameter kx bezeichnet die Komponente des Wellenvektors in x-Richtung, d.h. die Ausbreitungsrichtung des Polari-
1
2
Dielektrikum
Metall
E kz
kx
z
Ez z k z
e z
E ~
tons (Plasmaoszillation mit elektromagnetischem Feld), wobei zwischen dem Wellenvektor kx
und der Wellenlänge der Plasmaoszillationen p die Beziehung besteht:
p
kx
2 (Gl. 2.2)
Die Werte für kz, , die Wellenvektorkomponenten senkrecht zur Grenzfläche in Richtung des positiven und negativen Halbraums sind rein imaginär, woraus sich der exponentielle Abfall des elektrischen Feldes in den beiden Richtungen entlang der z-Achse ergibt. Die beiden Wel- lenvektorkomponenten kx und kz, stehen in folgendem Zusammenhang:
2 2
,
2
k c
kx z (Gl. 2.3)
Darin steht für die Dielektrizitätskonstante der beiden Medien, für die Kreisfrequenz des Polaritons und c für die Lichtgeschwindigkeit im Vakuum. Umformen von Gleichung 2.3 lie- fert:
2 2
, x
z k
k c
(Gl. 2.4)
Aus den Maxwell-Gleichungen ergibt sich der Zusammenhang
, 0
,
kz kz
(Gl. 2.5)
Kombiniert mit den beiden Fällen der Gleichung 2.4 erhält man die Dispersionsrelation für Oberflächenplasmonen:
kx c (Gl. 2.6)
Für eine optische Anregung der Oberflächenplasmonen an der Grenzfläche mit Licht muss diese Dispersionsrelation durch das Anregungslicht erfüllt werden. In Abbildung 2.2 ist der
Zusammenhang der Dispersionsrelationen von Licht im Vakuum bzw. in einem brechendem Medium, sowie der Oberflächenplasmonen an einer metallisch/dielektrischen Grenzfläche dargestellt. Die Lichtgerade im Vakuum (
kx c
) schneidet die Kurve der Oberflächenplas- monen kSPR nicht. Daher können Oberflächenplasmonen mit Licht nur über ein Medium n0 > 1 (z.B. Glas) angeregt werden, das die Steigung der Lichtgeraden verkleinert und damit ermög- licht, dass sich die Dispersionsrelationen schneiden. Aus diesem Grund wird zur Anregung der Oberflächenplasmonen mit Licht ein Prisma aus hochbrechendem Glas verwendet.
Dabei sind prinzipiell zwei Anordnungen möglich. Diese wurden bereits 1968 zum einen von Otto[78] und zum anderen von Kretschmann und Raether[79] entwickelt,[80, 81] nachdem Ober- flächenplasmonen theoretisch erstmals 1957 von Ritchie[82] beschrieben worden waren. In Abbildung 2.3 a ist die Anordnung nach Otto dargestellt. Dabei sind Prisma und Metallfilm durch einen Luftspalt im Abstand der Anregungswellenlänge getrennt, so dass sie keinen Kontakt miteinander haben. Dies kann nützlich sein, wenn man die Metalloberfläche vor Be- schädigungen schützen möchte. Das evaneszente Feld koppelt in diesem Fall mit den Oberflä- chenplasmonen an der Grenzfläche zwischen Luft und Metall. Die Schwierigkeit besteht je- doch darin, den Luftspalt zu stabilisieren.
Abbildung 2.2: Dispersionsrelation für Licht im Vakuum und in einem Medium mit Brechungsindex n0 > 1 so- wie für Oberflächenplasmonen an einer metallisch/dielektrischen Grenzfläche.[45]
In der vorliegenden Arbeit wurde die Anordnung nach Kretschmann-Raether aus Abbildung 2.3 b verwendet. Das Prisma steht hierbei in direktem Kontakt mit dem Metallfilm. Dieser kann auch als Spalt fungieren, wenn er ausreichend dünn genug ist, um eine Anregung der
kx
kx c n c
kx
0
kSPR
Oberflächenplasmonen über das evaneszente Feld zu ermöglichen. Die Spaltbreite wird dabei durch die Dicke des Metallfilms bestimmt.
Abbildung 2.3: a) Otto Konfiguration. b) Kretschmann-Raether Konfiguration.[46]
Das evaneszente Feld des totalreflektierten Lichtstrahls klingt exponentiell in den Metallfilm ab und regt dadurch die Oberflächenplasmonen an der Grenzfläche zwischen Medium 1 und 2 (in der Abbildung Metall und Luft) an, wenn die Dispersionsrelation erfüllt wird. Durch den Einfallswinkel kann man die x-Komponente des Wellenvektors des Lichts gemäß Gleichung 2.7 variieren und ihn so einstellen, dass die Dispersionsrelation (siehe Gleichung 2.6) zwi- schen kx und für das Oberflächenplasmon erfüllt ist.
0 sin 0 sin n c
kx c (Gl. 2.7)
Das Erreichen dieser Resonanzsituation äußert sich in einer Abschwächung der totalreflektier- ten Lichtintensität, weshalb dieses Verfahren auch als ATR-Methode bezeichnet wird (ATR = attenuated total reflection). Bei Messung der Reflektivität gegen den Einfallswinkel des Messlichts zeigt sich im Resonanzfall ein deutliches Minimum in der Signalkurve (siehe Abbildung 2.4 b). Dieser Intensitätsverlust entsteht durch die Anregung der Oberflächenplas- monen in der Metallschicht.
Bei Anwesenheit einer dielektrischen Schicht beispielsweise durch Adsorption von Molekü- len an den Metallfilm ändert sich der Resonanzwinkel, bei welchem die Oberflächenplasmo- nen angeregt werden (siehe Abbildung 2.4 a, b). Über die Verschiebung der Minima der SPR-Kurve lässt sich die Änderung des effektiven Brechungsindexes des Dielektrikums und darüber die Schichtdicke bestimmen.
Luft
Luft
Metall Metall
kx
a b
Abbildung 2.4: Bestimmung der Änderung der Schichtdicke von Adsorbatschichten an Metalloberflächen mit- tels SPR. a) Schemaskizze der Anordnung, die Indizes beziehen sich auf Prisma (0), Goldfilm (1), adsorbierte Schicht (2) und überstehendes Lösungsmittel (3). Für Adsorbate, deren Schichtdicke kleiner ist als die Eindring- tiefe der evaneszenten Welle, ergibt sich ein effektives 2 als von der Adsorbatschichtdicke abhängiges, gewich- tetes Mittel aus 2 und 3. b) Reflektivität als Funktion des Einfallswinkels , eine Dickenänderung der Schicht 2 verursacht eine Verschiebung der Resonanzkurve um den Winkel . c) Kinetik der Adsorption von Molekülen an der Metalloberfläche, beobachtet über die Verschiebung des Resonanzwinkels. d) alternative Detektions- methode über Messung der Änderung der Reflektivität bei festem Einfallswinkel. e) Kinetik der Moleküladsorp- tion, verfolgt über die Änderung der Reflektivität bei festem Einfallswinkel.[44]
Die Kinetik des Adsorptionsprozesses kann über die zeitaufgelöste Änderung des Resonanz- winkels beobachtet werden (siehe Abbildung 2.4 c). Eine andere Möglichkeit zur Bestim- mung der Dicke einer molekularen Schicht auf dem Metallfilm ist die Verfolgung der Ände- rung der Reflektivität bei festem Einfallswinkel (siehe Abbildung 2.4 d). Man beobachtet da- bei nicht im Minimum sondern im steilen Teil der SPR-Kurve. Die Kinetik der Adsorption er- hält man über die Messung der zeitaufgelösten Änderung der Reflektivität (siehe Abbildung 2.4 d). Man kann diese Methode zur Untersuchung einer Vielzahl von Oberflächenprozessen verwenden.[42-46, 83, 84]
2.1.2. Entwicklung der SPR-Apparatur
Wenn man SPR-Messungen, wie in Abbildung 2.4 dargestellt, in Lösung durchführen möchte, benötigt man eine Durchflusszelle. Daher wurde eine Durchflusszelle nach dem Modell der SPR-Flusszelle angefertigt, wie sie in der Gruppe von Prof. W. Knoll (MPI Mainz) von
R
R
R
R
a b c
R
t
R
t
d e
F. Yu[70] entworfen wurde (siehe Abbildung 2.5). Prisma und Substrat wurden aus hochbre- chendem Schwerflintglas gefertigt. Nach Aufdampfen einer 50 nm dicken Goldschicht wurde das Glassubstrat über einen dünnen Flüssigkeitsfilm eines im Brechungsindex passend gewählten Immersionsöls auf die Basis des Prismas aufgesetzt.
Die Flusszelle wird durch Auflegen einer als Zellwand fungierenden Silikonmaske und einer als Deckel und Fenster fungierenden Quarzplatte gebildet. Letztere ist mit zwei schrägen Boh- rungen versehen, in welche zwei Stahlkanülen als Zu- und Ablauf für die Probenflüssigkeit eingeklebt sind. Der Zufluss der Probelösung wird mittels einer Schlauchpumpe kontrolliert.
Die UV-Bestrahlung durch das Quarzfenster erfolgt mittels eines Flüssiglichtleiters, der über eine Interferenzfiltereinheit an eine UV-Lampe angeschlossen ist (siehe Kapitel 8.2).
Abbildung 2.5: Links: Schemaskizze des Aufbaus der SPR-Durchflusszelle. Rechts: Foto der Zellhalterung.
Für die SPR-Apparatur wurde zunächst auf ein Setup der AG Leiderer im Fachbereich Phy- sik[44] zurückgegriffen, dessen Aufbau schematisch in Abbildung 2.6 dargestellt ist. Die Kon- struktion dieser Apparatur zielt darauf ab, automatisch dem Winkel im Minimum der Reso- nanzkurve zu folgen. Die Variation des Einfallswinkels des Laserstrahls auf die Goldschicht wird durch einen schrittmotorgesteuerten Drehspiegel erreicht.
Der Laserstrahl trifft diesen Spiegel auf seiner Drehachse und wird nach seiner Reflexion durch zwei identische Sammellinsen, die den Abstand zwischen Spiegel und Auftreffpunkt auf dem Gold in die Streckenlängen f, 2f, f unterteilen, auf die Goldschicht gelenkt. Durch diese optische Anordnung wird erreicht, dass der Auftreffpunkt auf dem Gold sich nicht än- dert, wenn man den Einfallswinkel ändert. Die Intensität des an der Prismenbasis totalreflek-
p-polarisiertes Licht (658 nm)
reflektiertes Licht
UV- Bestrahlung
(365 nm) Prisma Substrat
Goldfilm
Silikonfenster
Quarzfenster Zulauf
Ablauf p-polarisiertes Licht (658 nm)
reflektiertes Licht
UV- Bestrahlung
(365 nm) Prisma Substrat
Goldfilm
Silikonfenster
Quarzfenster Zulauf
Ablauf
