2.1. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)
2.1.2. Entwicklung der SPR-Apparatur
Wenn man SPR-Messungen, wie in Abbildung 2.4 dargestellt, in Lösung durchführen möchte, benötigt man eine Durchflusszelle. Daher wurde eine Durchflusszelle nach dem Modell der SPR-Flusszelle angefertigt, wie sie in der Gruppe von Prof. W. Knoll (MPI Mainz) von
R
R
R
R
a b c
R
t
R
t
d e
F. Yu[70] entworfen wurde (siehe Abbildung 2.5). Prisma und Substrat wurden aus hochbre-chendem Schwerflintglas gefertigt. Nach Aufdampfen einer 50 nm dicken Goldschicht wurde das Glassubstrat über einen dünnen Flüssigkeitsfilm eines im Brechungsindex passend gewählten Immersionsöls auf die Basis des Prismas aufgesetzt.
Die Flusszelle wird durch Auflegen einer als Zellwand fungierenden Silikonmaske und einer als Deckel und Fenster fungierenden Quarzplatte gebildet. Letztere ist mit zwei schrägen Boh-rungen versehen, in welche zwei Stahlkanülen als Zu- und Ablauf für die Probenflüssigkeit eingeklebt sind. Der Zufluss der Probelösung wird mittels einer Schlauchpumpe kontrolliert.
Die UV-Bestrahlung durch das Quarzfenster erfolgt mittels eines Flüssiglichtleiters, der über eine Interferenzfiltereinheit an eine UV-Lampe angeschlossen ist (siehe Kapitel 8.2).
Abbildung 2.5: Links: Schemaskizze des Aufbaus der SPR-Durchflusszelle. Rechts: Foto der Zellhalterung.
Für die SPR-Apparatur wurde zunächst auf ein Setup der AG Leiderer im Fachbereich Phy-sik[44] zurückgegriffen, dessen Aufbau schematisch in Abbildung 2.6 dargestellt ist. Die Kon-struktion dieser Apparatur zielt darauf ab, automatisch dem Winkel im Minimum der Reso-nanzkurve zu folgen. Die Variation des Einfallswinkels des Laserstrahls auf die Goldschicht wird durch einen schrittmotorgesteuerten Drehspiegel erreicht.
Der Laserstrahl trifft diesen Spiegel auf seiner Drehachse und wird nach seiner Reflexion durch zwei identische Sammellinsen, die den Abstand zwischen Spiegel und Auftreffpunkt auf dem Gold in die Streckenlängen f, 2f, f unterteilen, auf die Goldschicht gelenkt. Durch diese optische Anordnung wird erreicht, dass der Auftreffpunkt auf dem Gold sich nicht än-dert, wenn man den Einfallswinkel ändert. Die Intensität des an der Prismenbasis
totalreflek-p-polarisiertes
tierten Laserstrahls wird über eine Photodiode detektiert. Diese Intensität wird durch kleine Oszillationen des Einfallswinkels moduliert, die man durch die Ansteuerung eines Piezokri-stalls kontrolliert, auf welchen der Drehspiegel montiert ist. Mittels Lock-In Technik lässt sich das modulierte Signal der Photodiode dann gezielt verstärken. Es ist proportional zur Steigung der Plasmonenresonanzkurve an dem jeweils eingestellten Winkel. Durch eine Rückkopplung mit der Schrittmotorsteuerung kann man dieses Signal benutzen, um den Win-kel des Minimums der Resonanzkurve anzusteuern, bei dem das Lock-In verstärkte Signal ge-gen Null geht. Die Apparatur gestattet es somit, die Lage des Resonanzminimums als Funk-tion der Zeit zu registrieren.[44, 85]
Abbildung 2.6: Schematischer Aufbau der SPR-Apparatur nach H. Elsinger[44].
Die Aufzeichnung der Messdaten erfolgte digital über das Programm „Elli“, welches die Schrittmotorposition als Funktion der Zeit ausgibt. In der feinsten Einstellung des Schrittmo-tors sind 1/8 Schritte möglich, wobei ein Schritt dann einer Winkeländerung von 0.0008° ent-spricht.
Es zeigte sich, dass die Messungen im Resonanzminimum sehr störungsempfindlich waren.
Schon geringe Temperaturunterschiede in der Flusszelle oder im Raum erzeugten große Sig-nalschwankungen. Auch die Laserdiode reagierte sehr empfindlich auf Störungen, was die Signalqualität zusätzlich verschlechterte. Der Schrittmotor wies aufgrund einer Hysterese in der Mechanik Ungenauigkeiten in der Schrittweite auf. Auch dies trug zu Signalschwankun-gen bei. Insgesamt konnte kein hinreichend drift- und rauschfreies Signal erhalten werden.
Laserdiode
Zwar konnten Vorgänge mit starken Signaländerungen, wie bei der Adsorption von Oligonu-kleotiden (14 mere) mit Thiollinker an die Goldoberfläche noch recht gut verfolgt werden, die Adsorption kleinerer Moleküle wie beispielsweise von Mercaptohexanol war hingegen nicht hinreichend von den Signalschwankungen zu unterscheiden. Für die geplanten Messungen, an Monoschichten photolabil geschützter Mononukleotide war das vorgegebene SPR Setup nicht geeignet und musste daher, diesen Anforderungen entsprechend, neu aufgebaut werden.
Hierzu wurde die generelle Messtechnik dahingehend verändert, dass die SPR-Signale bei festem Einfallswinkel im steilen Teil der Flanke der Resonanzkurve ohne Winkelmodulation durch den Piezokristall aufgenommen wurden. Bei dieser Einstellung sollte das Signal weni-ger empfindlich auf äußere Störungen reagieren und damit eine stabilere und weniweni-ger ver-rauschte Grundlinie, sowie bessere Signale liefern. Gemessen wird hierbei jedoch die Reflek-tivität (in mV-Einheiten der Photospannung) als Funktion der Zeit. Der geänderte Aufbau ist in Abbildung 2.7 schematisch dargestellt.
Abbildung 2.7: Schematischer Aufbau der letztendlich eingesetzten SPR-Apparatur. Die Messung erfolgt bei einem festen Winkel im steilen Teil der Flanke der Resonanzkurve.
Die Laserdiode wurde in ein temperierbares Gehäuse eingebaut, welches auch die Einstellung der Laserstärke über eine Regelungseinheit und die Justierung des Laserstrahls durch eine verstellbare Linse zuließ (Foto siehe Kapitel 8.2.1). Dadurch sollte sie weniger anfällig auf äußere Störungen reagieren und damit auch wesentlich stabiler sein. Außerdem wurde eine Photodiode mit besserer Spezifikation (Hochgeschwindigkeit, mit größerem aktiven Bereich, höhere Signalspannungsausgabe möglich) verwendet, um größere Signale und somit ein bes-seres Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Zum Einleiten der Messlösungen in die
Durch-Laserdiode
Photodiode
drehbarer Spiegel
Linse 1
Linse 2
Linse 3
Linse 4 Flusszelle
Laserdiode
Photodiode
drehbarer Spiegel
Linse 1
Linse 2
Linse 3
Linse 4 Flusszelle
flusszelle wurde ein Mehrwegventil benutzt, um Signalstörungen, die beim Wechsel der Lösungen auftreten könnten, zu reduzieren.
Da das Signal nun nicht mehr moduliert wird, kann auf den Funktionsgenerator und die Lock-In Technik verzichtet werden. Der Schrittmotor wird nur noch zur Drehung des Spiegels zur Einstellung des Einfallswinkels verwendet. Der Lichtstrahl der Laserdiode trifft auf den Spie-gel, wird reflektiert und passiert danach die zwei Sammellinsen, wieder in der f 2f f ordnung. Am Prisma wird er reflektiert und erreicht nach zwei Sammellinsen in gleicher An-ordnung die Photodiode. Die AnAn-ordnung der Sammellinsen soll auch hier die Bewegung des Laserpunktes auf der Detektionsfläche beim Ändern des Einfallswinkels verhindern.
Das Signal wird mit einem Datenlogger aufgezeichnet und kann über dessen Software am Computer ausgelesen werden. Die Datenerfassung wurde durch die Änderungen erheblich vereinfacht. Das erhaltene Signal ist deutlich verbessert: die Grundlinie konstant stabil und rauscharm. Selbst geringe Signaländerungen können nun zuverlässig aufgezeichnet werden.
Die Flusszelle wurde beibehalten. Mittels Schlauchpumpe und Mehrwegventil können unter-schiedliche Lösungen eingeleitet werden. Am Anfang einer Messung wird der Einfallswinkel mit Hilfe des Schrittmotors „durchgefahren“ und die reflektierte Intensität der unbehandelten Goldoberfläche mit Lösungsmittel-gefüllter Messzelle gemessen, um einen größeren Winkel-bereich um das Resonanzminimum des Plasmons zu erfassen.
Eine komplette Aufnahme des Plasmons ist mit diesem Aufbau leider nicht möglich. Dazu müsste sich der Arm der optischen Schiene mit dem Photodetektor während des „Durchfah-rens“ mitdrehen. Nachdem ein Teil des Plasmons aufgezeichnet wurde, wird ein optimaler Winkel am steilsten Punkt der Flanke ausgewählt und dieser für die Messung fest eingestellt.
Eine ähnliche Vorgehensweise zur Einstellung des Einfallswinkels bei SPR-Messungen wur-de auch von Knoll und Mitarbeitern[86] beschrieben. Anschließend kann mit der Messung durch Einleiten der zu untersuchenden Lösungen in die Flusszelle begonnen werden. Das re-flektierte Signal wird dann als Funktion der Zeit erfasst.
2.2. Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)
Die Röntgen-Photoelektronenspektroskopie[87, 88] zählt heute zu den wichtigsten spektroskopi-schen Methoden für die Bestimmung der chemispektroskopi-schen Zusammensetzung und der Bindungs-verhältnisse von Festkörpern bzw. deren Oberflächen. Daher wird die Methode auch als ESCA (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis) bezeichnet. Kai Siegbahn erhielt 1981 den Nobelpreis für die Entwicklung der Photoelektronenspektroskopie, was zeigt, welche Be-deutung diese Methode für die Oberflächenanalytik hat. Die Röntgen-Photoelektronenspek-troskopie beruht auf dem photoelektrischen Effekt, wobei durch Anregung der Oberfläche eines Festkörpers mit Röntgenstrahlung Elektronen aus den Rumpfniveaus emittiert werden (siehe Abbildung 2.8 a).
Abbildung 2.8: Prinzip der Röntgen-Photoelektronenspektroskopie XPS, vereinfachte schematische Darstel-lung. a) Atomorbitalenergieschema. b) idealisierter Photoionisationsprozess im Festkörper und resultierendes Photoelektronenspektrum (Ekin = kinetische Energie, EF = Energie auf Ferminiveau, EB = Bindungsenergie, Evac = Energie auf Vakuumniveau, = Austrittsarbeit des Festkörpers).[87-89]
Mittels der Messung der kinetischen Energie Ekin der Photoelektronen kann über die Bezie-hung
B
kin h E
E (Gl. 2.8)
Photon Photo-
elektron
K L L h
e
-a b
h
mit h der Energie der Photonen und der Austrittsarbeit des Festkörpers die Bindungsener-gie EB der Photoelektronen bestimmt werden. Über die Bindungsenergie kann man bei Rumpfniveauelektronen Rückschlüsse auf die Atomsorte und damit auf die chemische Zu-sammensetzung des Festkörpers ziehen. In Abbildung 2.8 b ist ein vereinfachtes Schema des Photoemissionsprozesses bei Festkörpern mit dem resultierenden Photoelektronenspektrum dargestellt. Die Bindungsenergie wird bei Festkörpern vom Ferminiveau EF aus gemessen, der Unterschied zum Vakuumniveau Evac wird durch die Austrittsarbeit beschrieben.[87, 88]
Die XPS-Messungen werden in einer Ultrahochvakuumkammer durchgeführt, um Verunreini-gungen der Probenoberfläche aus der Umgebungsluft zu reduzieren. An wesentlichen Kompo-nenten für diese Messungen werden eine Röntgenquelle und ein Elektronenenergieanalysator mit Elektronendetektor benötigt (siehe Abbildung 2.9). Die XPS-Messungen für diese Arbeit wurden am Fachbereich Physik der Universität Konstanz in der Arbeitsgruppe Rüdiger durch-geführt. Dabei wurden eine Dual-Anoden-Röntgenquelle mit Al K-Strahlung (1486.6 eV) oder Mg K-Strahlung (1253.6 eV) und ein hemisphärischer Energieanalysator verwendet.[90]
Abbildung 2.9: Schematischer Aufbau eines Röntgen-Photoelektronenspektrometers.[91]
Durch Auftragen der Anzahl der Photoelektronen (Intensität) gegen die Bindungsenergie er-hält man das XPS-Spektrum. Ein Beispiel ist in Abbildung 2.10 a dargestellt. Dabei handelt es sich um ein XPS-Spektrum von Gold, wobei den Signalpeaks im Diagramm die entsprechen-den Orbitale zugewiesen wurentsprechen-den. Da die Bindungsenergie für jedes Atomorbital charakte-ristisch ist, kann man sie mit Hilfe einer Datenbank den Signalen zuordnen und erhält so die elementare Zusammensetzung der Oberfläche der Probe. Neben den Photoelektronen können durch die Bestrahlung des Festkörpers mit Röntgenstrahlung auch Röntgenfluoreszenz und
Röntgen- strahlung
Probe Elektronen-
bahn
Detektor
Elektrostatische Linsen Eingangs-
schlitz Ausgangs-
schlitz Hemisphärischer
Analysator
Auger-Elektronen auftreten. Durch die Emission eines Photoelektrons entsteht ein Loch, wel-ches mit einem Elektron aus einer höheren Schale aufgefüllt werden kann. Die dabei frei wer-dende Energie kann zur Röntgenfluoreszenz führen oder ein Auger-Elektron (Sekundärelek-tron) freisetzen. Daher treten in XPS-Spektren auch charakteristische Auger-Signale auf.
Abbildung 2.10: a) XPS-Übersichtsspektrum von Au(111), aufgenommen mit Al K Strahlung. Die den Orbita-len 4 p, 4 d und 4 f entsprechenden Signale sind durch Spin-Bahn-Kopplung in Dubletts aufgespalten. Der VB-Peak ist den Valenzbandelektronen zuzuordnen.[90] b) Mittlere freie Weglänge für Elektronen in Festkörpern.[87]
Die lokale Informationstiefe der XPS-Methode ist abhängig von der mittleren freien Weglän-ge der emittierten Photoelektronen und deren kinetischer Energie. Für verschiedene Materia-lien wurde für den Energiebereich der XPS-Messungen (100 - 1500 eV) eine mittlere freie Weglänge von etwa 5 bis 30 Å gefunden (siehe Abbildung 2.10 b), d.h. es wird eine Informa-tionstiefe von etwa 10 Atomlagen erreicht. Dieser Umstand begründet die starke Oberflächen-selektivität dieser Methode.[87, 88, 92]
a b