Kalibrierung des SPR-Signals

Nachdem der SPR-Aufbau fertig gestellt war (siehe Kapitel 2.1.2), war es wichtig, die ersten Messungen mit bekannten Stoffen durchzuführen, um das in Einheiten von Millivolt ge-messene Signal in Einheiten des effektiven Brechungsindexes bzw. der effektiven optischen Schichtdicke umrechnen zu können.

Dazu wurden verschiedene Ethanol/Wasser-Mischungen hergestellt und deren Brechungsin-dex bestimmt (siehe Tabelle 2). Mit Hilfe eines Mehrwegventils wurden diese Mischungen nacheinander durch die Flusszelle gepumpt und das resultierende SPR-Signal bei festem Ein-fallswinkel des Laserlichts zeitabhängig gemessen (siehe Abbildung 4.2).

% Ethanol in Wasser Brechungsindex nD20 Literaturwert^[131] nD20 n Literatur

Tabelle 2: Gemessene Brechungsindices der Ethanol-Wasser-Mischungen und die entsprechenden Literaturwer-te, Prozentangaben in Massenprozent.

Abbildung 4.2: SPR-Messung der verschiedenen Ethanol-Wasser-Lösungen.

Der Brechungsindexunterschied zwischen den einzelnen Lösungen ist laut Literatur konstant und beträgt 0.0006 Einheiten (siehe Tabelle 2). Dieses Verhalten wird durch die hier durchge-führten Messungen sehr gut bestätigt. Bei der SPR-Messung dieser Lösungen erhält man ein stufenförmiges Signal. Im Mittel ergibt sich für die etwa äquidistanten Stufen ein Wert von 3.0 mV. Folglich entspricht eine Signaländerung von 3.0 mV einer Änderung im Brechungs-index in der an die Goldoberfläche angrenzenden Schicht von 0.0006 Einheiten.

Weiterhin wäre es interessant zu wissen, um wieviel Grad sich der Resonanzwinkel  des Plasmons bei einer Signaländerung von 3.0 mV verschiebt. Dazu wurden die theoretischen Resonanzkurven der einzelnen Ethanol-Wasser-Mischungen für ein Mehrschichtsystem

beste-20

hend aus Schwerflintglas, Gold und Lösungsmittelschicht mit dem Programm Winspall^[132]

berechnet (siehe Abbildung 4.3).

Abbildung 4.3: Links: theoretische Berechnung der Plasmonenresonanzkurve für die unterschiedlichen Ethanol-Wasser-Mischungen, rechts: vergrößerter Ausschnitt aus der Resonanzkurve.

Die Reflektivität am Prisma wurde gegen den Reflexionswinkel  aufgetragen. Bei etwa 57.6°

tritt für die 1% ige Ethanollösung ein Minimum auf, welches sich bis zu der 5% igen Ethanol-lösung auf etwa 57.9° verschiebt. Die Abstände der einzelnen Resonanzkurven sind auch na-hezu äquidistant, so dass man die zugehörigen Winkel bei einem festen Reflektivitätswert gut miteinander vergleichen kann (siehe Tabelle 3). Bei einer Reflektivität von beispielsweise 0.4 erhält man für den Unterschied im Winkel zwischen den verschiedenen Ethanol-Wasser-Lö-sungen im Mittel 0.066°. Somit kann man sagen, dass eine Änderung der Ethanol-Wasser-Mi-schung um 1% eine Änderung im Brechungsindex um 0.0006 Einheiten, eine Änderung des SPR-Signals um etwa 3 mV und eine Verschiebung des Resonanzwinkels um etwa 0.066° be-wirkt. Mit diesen Angaben kann man die bei unterschiedlichen SPR-Messungen erhaltenen Signale besser bewerten und besser mit literaturbekannten Werten vergleichen.

% Ethanol

Tabelle 3: Theoretischer Reflexionswinkel  der verschiedenen Ethanol-Wasser-Mischungen im Minimum und bei einer Reflektivität von 0.4, der Winkelunterschied der entsprechenden Lösungen in ° und deren Mittel-wert.

Da für viele Standardanwendungen kommerziell erhältliche SPR-Geräte der Firma Biacore verwendet werden, und man in der Literatur dann meist auch die dort verwendeten RU-Werte (reflective units) als Einheiten angibt, wäre es für den Vergleich der hier ermittelten Daten mit solchen aus der Literatur wichtig festzustellen, wieviele Millivolt einer RU-Einheit entspre-chen.

Dazu wurden die zuvor verwendeten Ethanol-Wasser-Mischungen in einem Biacore-Gerät über einen Gold-Dextran-Streptavidin-Chip geleitet und die resultierende Signaländerung ge-messen. Die Lösungen blieben jeweils 30 s in Kontakt mit dem Chip, dazwischen wurde für 60 s mit Wasser gespült. Im Mittel wurden für die Differenzen zwischen den einzelnen Etha-nol-Wasser-Mischungen etwa 618 RU erhalten.

% Ethanol

in Wasser RU Mittelwert

RU

1

2 560

3 612 618

4 638

5 660

Tabelle 4: Unterschied der RU-Werte für die einzelnen Ethanol-Wasser-Mischungen gemessen mit einem Bia-core-Gerät und deren Mittelwert.

Laut Literatur^[133] entsprechen 1000 RU einer Winkeländerung von etwa 0.1°, so dass 618 RU einer Verschiebung im Resonanzwinkel von etwa 0.062° entsprechen. Dies steht im Einklang mit den theoretisch erhaltenen Werten aus dem vorherigen Abschnitt. Da die Messungen am Biacore-Gerät auf wässrige Lösungen beschränkt sind und eine längere Einwirkzeit nur bis zu 10% Ethanol empfohlen wird, können leider keine vergleichenden Messungen mit den photo-labil geschützten Nukleosiden mit Thiollinker durchgeführt werden, denn diese lösen sich nur in organischen Lösungsmitteln. Zusammenfassend lässt sich also folgende Äquivalenz fest-halten

10^-4 RIU (reflective index units)  0.5 mV  0.01°  100 RU

4.3. Blindtests

Nach der Kalibrierung der SPR-Anlage wurden zunächst die Auswirkungen des UV-Lichts, welches später zur Bestrahlung der photolabilen SAMs verwendet werden sollte, auf die SPR-Messung untersucht.

Dazu wurde ein unbehandelter Goldfilm unter konstantem Ethanolfluss von 0.5 ml/min mit UV-Licht von 365 nm für 15 s Intervalle bestrahlt (siehe Abbildung 4.4). Dabei wurde das SPR-Signal über die Zeit bei konstantem Winkel im Bereich der linken Flanke (d.h. bei klei-neren Winkeln als dem Resonanzwinkel) der SPR-Kurve aufgenommen.

Abbildung 4.4: SPR-Signal während der Bestrahlung eines unbehandelten Goldfilms mit UV-Licht von 365 nm für 15 s Intervalle unter konstantem Ethanolfluss von 0.5 ml/min.

Das Einschalten des UV-Lichtes bewirkt eine unmittelbare Signaländerung von etwa 2.5 mV, was wohl auf die Temperaturänderung durch das UV-Licht in der Flusszelle zurückzuführen ist. Nach Abschalten des UV-Lichtes kehrt das Signal wieder zur Grundlinie zurück. Dies än-dert sich auch nicht nach mehreren Bestrahlungsintervallen, so dass man sagen kann, dass durch den Einsatz des UV-Lichtes während der SPR-Messung keine irreversiblen Signalände-rungen oder andere StöSignalände-rungen entstehen.

16 17 18 19 20 21 22

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Zeit [s]

Reflektivität [mV]

UV-Licht an

UV-Licht aus

Zusätzlich wurde untersucht, wie eine nicht-photolabile Nukleosidmonoschicht auf das UV-Licht reagiert. Eine 1 mM Lösung von DMT-T-SH in Ethanol wurde durch die Flusszelle über einen unbehandelten Goldfilm gepumpt und die Ausbildung der Monoschicht online über das zeitaufgelöste SPR-Signal verfolgt (siehe Abbildung 4.5). Nach Waschen mit Etha-nol wurde die Oberfläche für 15 s Intervalle mit UV-Licht von 365 nm bestrahlt.

Abbildung 4.5: Adsorption der nicht-photolabilen Verbindung DMT-T-SH an eine Goldoberfläche und Bestrah-lung des SAMs mit UV-Licht von 365 nm für 15 s Intervalle unter konstantem Ethanolfluss von 0.5 ml/min.

Das Anschalten des UV-Lichtes bewirkte wieder eine Signaländerung, aber abgesehen von einer leichten Drift in der Grundlinie war diese auch nach mehreren Bestrahlungsintervallen völlig reversibel. Die Dimethoxytrityl-Schutzgruppe zeigt wie erwartet keine Photoaktivität, so dass photoinduzierte irreversible Signaländerungen in späteren Messungen ausschließlich der photochemischen Spaltung der Schutzgruppen zugeschrieben werden können.

Jedoch berichten Siffalovic et al.^[134], dass bei oberflächengebundenen Iodophenylgruppen durch Bestrahlung mit UV-Licht von 266 nm die Bindung zwischen Iod und dem Phenylring gespalten wird. Sie belegen diese Aussage anhand von XPS-Messungen mit der Verringerung des Iodsignals nach Bestrahlung mit UV-Licht. Daher war es notwendig zu beweisen, dass die in dieser Arbeit eingesetzte I-NPPOC-Schutzgruppe durch die Bestrahlung mit langwellige-rem UV-Licht von 366 nm an der Oberfläche vollständig entfernt und nicht nur

photodeio--2 0 2 4 6 8 10 12

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Zeit [s]

 Reflektivität [mV]

UV-Licht an

UV-Licht aus waschen

Adsorption

diert wird. Dazu wurde eine nicht-photolabile Modellverbindung I-Bn-SH mit iodiertem Phe-nylring und Thiollinker synthetisiert. Eine 1 mM Lösung dieser Verbindung in Ethanol wurde durch die Flusszelle gepumpt und die resultierenden SPR-Signale zeitaufgelöst aufgezeichnet (siehe Abbildung 4.6).

Abbildung 4.6: Adsorption der nicht-photolabilen Verbindung I-Bn-SH an eine Goldoberfläche und Bestrah-lung des SAMs mit UV-Licht von 365 nm für 15 s Intervalle unter konstantem Ethanolfluss von 0.5 ml/min.

Nach der Adsorption der Verbindung an die Goldoberfläche wurde mit Ethanol gewaschen.

Da die Moleküle dieser Verbindung viel kleiner sind als im Falle von DMT-T-SH, wurde auch ein deutlich kleineres Adsorptionssignal erhalten. Signalschwankungen fallen hierbei na-türlich auch stärker ins Gewicht.

Anschließend wurde die Oberfläche unter konstantem Ethanolfluss von 0.5 ml/min für 15 s Intervalle mit UV-Licht von 365 nm bestrahlt. Selbst nach mehreren Bestrahlungsintervallen wurden dabei keine irreversiblen Signaländerungen erhalten, so dass man annehmen kann, dass bei Verwendung dieser Wellenlänge im UVA-Bereich keine Photodeiodierung auftreten sollte.

-1 0 1 2 3 4

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Zeit [s]

 Reflektivität [mV]

Adsorption

waschen

UV-Licht aus

UV-Licht an