Photokinetik in schwach basischem Puffer (pH 8)

Da sich bei den SPR-Messungen an I-NPPOC-T-SH-SAMs die zweiphasige Photokinetik durch Basenzugabe zum Lösungsmittel, welches während der Bestrahlung durch die Flusszel-le geFlusszel-leitet wird, zu Gunsten des schnelFlusszel-len Teils verschieben ließ (siehe Kapitel 4.7), wurde auch bei den Messungen an biotinylierten Monoschichten mit Streptavidin eine entsprechende Variation der Versuchsbedingungen untersucht. Die Basenzugabe erfolgte hierbei in Form ei-nes schwach basischen PBS-Puffers von pH 8. Von der Verwendung von stärker basischen Puffern wurde abgesehen, damit Streptavidin nicht denaturiert wird.

Zunächst wurde aus einer 1 mM ethanolischen Lösung von Bt-NPPOC-T-SH ein SAM auf ei-nem Goldfilm gebildet (  13 mV, siehe Abbildung 5.9 a). Danach wurde Streptavidin (0.03 mg/ml, 5  10^-7 M in PBS-Puffer) an den SAM adsorbiert (  17 mV, siehe Abbildung

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0

5.9 b) und die Oberfläche für unterschiedliche Intervalle für insgesamt 1 h mit UV-Licht (365 nm) unter konstantem PBS-Pufferfluss (pH 8, 0.5 ml/min) bestrahlt.

Abbildung 5.9: a) Adsorption von NPPOC-T-SH an Gold. b) Adsorption von Streptavidin in PBS an Bt-NPPOC-T-SH-SAM und Bestrahlung für unterschiedliche Intervalle mit einer Dauer von 152 s, 10 s, 20 s, 230 s, 60 s, 120 s, 300 s, 5600 s mit UV-Licht von 365 nm in PBS-Puffer (pH 8) unter konstantem Fluss (0.5 ml/min).

Wie in den Versuchen ohne den Puffer, fand die Signaländerung auch hauptsächlich während der Belichtungsphasen statt. Nach 1 h Bestrahlung umfasst die Signaländerung etwa 18 mV, was ziemlich genau (104%) der ursprünglich adsorbierten Menge an Streptavidin entspricht.

Das zeigt, dass die Oberfläche unter diesen Bedingungen weitgehend entschützt wurde. (Bei einer vollständigen Entschützung sollte die Signalstufe noch etwas größer sein, da außer dem Streptavidin auch der Biotinanker mit dem veränderten Schutzgruppenchromophor abgespal-ten wird).

Die entsprechende Photokinetik wies aber trotzdem ein zweiphasiges Verhalten mit einem überwiegenden schnellen Teil (k= 0.093 s^-1) und einem geringer zur Signaländerung beitra-genden langsamen Teil (k= 0.0008 s^-1) auf (siehe Abbildung 5.10). Der höhere pH-Wert der PBS-Pufferlösung konnte zwar den abgespaltenen Anteil steigern, jedoch das Auftreten der Nitroso-Nebenreaktion nicht vollständig unterdrücken, wenn man den langsamen Teil der Ki-netik durch diese Nebenreaktion interpretiert. Für die Quantenausbeute der Photoreaktion bei pH 8 ergibt sich im schnellen Teil mit 365 = 0.91 ein etwas höherer Wert als bei der Messung mit dem PBS-Puffer von pH 7.4 aus Kapitel 5.2.1. Im langsamen Teil wurde eine Quanten-ausbeute von 365 = 0.008 erreicht.

Zusammenfassend wurde also durch die Verwendung eines etwas basischeren PBS-Puffers die Quantenausbeute nur leicht erhöht, jedoch ergab sich eine deutliche Steigerung des

Um--2

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Zeit [s]

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Zeit [s]

satzes, die einer annähernd vollständigen Entschützung der Oberfläche entspricht. Eine leichte Erhöhung des pH-Wertes der „Waschlösung“ ist somit auch bei den biotinylierten und Strep-tavidin-verstärkten Schutzgruppen vorteilhaft.

Abbildung 5.10: Photokinetik der Signalwerte aus den Dunkelphasen versus Bestrahlungszeit aus der Messung von Abbildung 5.9 b. Inset: Ausschnitt (steiler Teil).

5.3. Photokinetik von Streptavidin-2Bt-, 3Bt- und 4Bt-NPPOC-T-SH-SAMs

2Bt-NPPOC-T-SH

Im Vergleich zu Bt-NPPOC-T-SH weist 2Bt-NPPOC-T-SH eine Esterbindung anstelle einer Amidbindung zur Anknüpfung des Biotinlinkers an den Nitrophenylring auf. Die Absorp-tionsspektren von 2Bt-NPPOC-T-SH in Ethanol (siehe Abbildung 5.11) zeigen bei Bestrah-lung mit UV-Licht (365 nm) ein ähnliches Verhalten wie bei Bt-NPPOC-T-SH. Auch hier entstehen neue Absorptionsbanden bei etwa 242 nm und 316 nm, welche nach 30 min Be-strahlung voll ausgebildet sind. Die Absorptionsbande bei etwa 256 nm wird auch bei dieser Verbindung leicht bathochrom verschoben und nimmt in der Intensität etwas zu.

Für die wieder nach Gleichung 5.4 (siehe Kapitel 5.2) ausgewertete Pseudoquantenausbeute ergab sich Q = 6.13  10⁴ cm²mol^-1, was mit dem Absorptionskoeffizienten 365 = 519 M^-1cm^-1 nach Gleichung 5.5 zu einer Quantenausbeute von 365 = 0.12 führt. Damit wurde in Lösung ein analoges Verhalten zu Bt-NPPOC-T-SH gefunden, wobei für 2Bt-NPPOC-T-SH die Quantenausbeute etwas kleiner ausfiel. Ein Vorteil der Anbindung des Biotinlinkers über eine Esterbindung könnte jedoch darin bestehen, dass dadurch das Molekül etwas hydrophiler

wür-0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 -4

de und damit, bei sonst analogem Verhalten, weniger unspezifische Adsorption von Streptavi-din auftreten könnte.

Abbildung 5.11: Absorptionsspektren von 2Bt-NPPOC-T-SH (3.45  10^-5 M) nach zunehmenden Bestrahlungs-zeiten mit UV-Licht (365 nm) in Ethanol.

Nach den Experimenten in Lösung wurde 2Bt-NPPOC-T-SH aus einer 1 mM ethanolischen Lösung an einen Goldfilm adsorbiert (siehe Abbildung 5.12 a). Nach Waschen mit Ethanol um nicht gebundene Moleküle zu entfernen, konnte eine Signaländerung von insgesamt etwa 8 mV gemessen werden. Wiederholte Messungen lieferten Signaländerungen von etwa 14 mV für die SAM-Bildung. Im Mittel kann mit einem Wert von etwa 12 mV gerechnet werden.

An den SAM aus 2Bt-NPPOC-T-SH wurde dann Streptavidin (0.03 mg/ml, 5  10^-7 M in PBS-Puffer) adsorbiert, was zu einer Signaländerung von etwa 13 mV führte (siehe Abbildung 5.12 b). Die Wiederholung dieser Messung ergab Werte in einem Bereich von etwa 19 - 22 mV, so dass der Mittelwert der durch die Adsorption von Streptavidin bewirkten Signaländerung bei etwa 18 mV liegt. Vergleichbare Werte konnten mit SAMs aus Bt-NPPOC-T-SH erhalten werden.

Bei der intervallweisen Bestrahlung der Oberfläche mit UV-Licht (365 nm) für insgesamt 1 h unter konstantem PBS-Pufferfluss verringerte sich das SPR-Signal um etwa 9 mV, was etwa 68% der ursprünglich adsorbierten Menge an Streptavidin entspricht und damit deutlich

gerin-0

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Wellenlänge  [nm]

ger ausfiel als bei Bt-NPPOC-T-SH. Das Ergebnis zeigt, dass die Oberfläche in diesem Fall nach 1 h UV-Bestrahlung noch nicht vollständig entschützt wurde.

Abbildung 5.12: a) Adsorption von 2Bt-NPPOC-T-SH an Gold. b) Adsorption von Streptavidin in PBS-Puffer an 2Bt-NPPOC-T-SH-SAM und Bestrahlung für unterschiedliche Intervalle mit einer Dauer von 102 s, 25 s, 10 s, 20 s, 230 s, 60 s, 120 s, 300 s, 5600 s mit UV-Licht von 365 nm in PBS-Puffer unter konstantem Fluss (0.5 ml/min).

Nach Auftragen der Signalwerte aus den Dunkelphasen gegen die Bestrahlungszeit wurde auch eine zweiphasige Photokinetik mit einem schnellen (k= 0.073 s^-1) und einem langsamen Teil (k= 0.0006 s^-1) erhalten (siehe Abbildung 5.13), wobei der langsame Teil einen deutlich größeren Anteil an der gesamten Signaländerung ausmacht als dies mit Bt-NPPOC-T-SH der Fall war. Nach 60 s Bestrahlung wurden erst etwa 59% der Gesamtänderung erreicht (72% bei Bt-NPPOC-T-SH).

Abbildung 5.13: Photokinetik zu Abbildung 5.12 b. Inset: Ausschnitt (steiler Teil).

-5

0 500 1000 1500 2000 2500

Zeit [s]

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Zeit [s]

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4

Für die Quantenausbeute der Photoreaktion von 2Bt-NPPOC-T-SH ergab sich im schnellen Teil der Kinetik ein Wert von 365 = 0.48 und im langsamen Teil ein Wert von 365 = 0.004.

Die Quantenausbeute im schnellen Teil ist damit viel kleiner als bei Bt-NPPOC-T-SH.

3Bt-NPPOC-T-SH

Bei 3Bt-NPPOC-T-SH ist der Biotinlinker in benzylischer Position als Seitenkette angebun-den. An dieser Position sind keine elektronischen Effekte auf den Primärschritt der Photoreak-tion zu erwarten. Änderungen der Gesamtkinetik, die sich gegenüber der nicht biotinylierten Verbindung ergeben sollten, müssten daher auf den sterischen Einfluss bzw. die geänderte Pa-ckung des SAMs infolge des Biotinlinkers zurückgeführt werden.

Zur Untersuchung in homogener Lösung wurde, wie in den Fällen zuvor, eine Serie von Ab-sorptionsspektren nach unterschiedlicher Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm) aufgenommen (siehe Abbildung 5.14). Dabei entstand bei etwa 320 nm eine neue Absorptionsbande, die, wie auch schon bei den anderen Verbindungen, der Nebenreaktion mit Bildung eines Nitroso-derivats zugeordnet werden kann.

Abbildung 5.14: Absorptionsspektren von 3Bt-NPPOC-T-SH (3.48  10^-5 M) nach zunehmenden Bestrahlungs-zeiten mit UV-Licht (365 nm) in Ethanol.

0

200 300 400 500 600