Zellbiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von PC12-Zellen

PC12-Zellen wurden erstmals 1976 aus dem Phäochromozytom einer Ratte gewonnen und dienen seitdem als Modellsystem zur Untersuchung neuronaler Differenzierung und Entwicklung (Greene and Tischler, 1976). Chromaffine Zellen aus dem Nebennierenmark gehen wie die Sympathikoblasten aus den Neuralleisten hervor und können somit als modifizierte sympathische Neurone aufgefasst werden.

Durch Zugabe des Nervenwachstumsfaktors (NGF) verlieren sie ihre runde oder polygonale Form und bilden lange dünne, sich verzweigende Ausläufer aus, die sowohl axonale als auch dendritische Eigenschaften besitzen und dementsprechend in Anlehnung an den englischen Wortgebrauch als Neuriten bezeichnet werden.

Für die Kultivierung der PC12-Zellen werden zunächst Zellkulturflaschen mit Poly-L-Lysin

(c=0,5 mg/ml; 33 µg/cm²) für 1 Stunde bei Raumtemperatur beschichtet und danach zwei Mal mit physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gespült. In diesen können die Zellen sich nun in PC12-Proliferationsmedium bei einer Temperatur von 37°C und einer Kohlendioxid-Atmosphäre von 8,5 % in einem befeuchteten Brutschrank proliferieren.

Da PC12-Zellen in Zellhaufen wachsen, müssen sie einmal pro Woche vereinzelt werden, um ein Absterben zu verhindern. Dafür werden sie mit einer 0,05 % (w/v) Trypsin / 0,83 mM EDTA-Lösung vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst. Nach ungefähr 5 Minuten wird die Proteolyse durch Zugabe von Medium gestoppt. Die Zellsuspension wird nun für 5 Minuten bei 1000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert, das Pellet in 2-3 ml Medium gelöst und mit einer über dem Bunsenbrenner enggeschmolzenen Glas-Pasteurpipette trituiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt mit einer Neubauer-Zählkammer. Anschließend kann die gewünschte Zellzahl in eine neue, frisch beschichtete Zellkulturflasche umgesetzt werden.

Material und Methoden

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PC12-Proliferationsmedium (van Bergeijk et al., 2006):

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose 10 % (v/v) Pferde-Serum

5 % (v/v) Fetales Kälberserum 6 mM L-Glutamin

1 mM Natriumpyruvat

100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin

Dulbecco’s PBS:

136,9 mM NaCl 8,1 mM Na₂HPO₄ 2,7 mM KCl 1,5 mM KH₂PO₄

Um für den Fall einer Kontamination Zellen in Reserve zu haben, können diese als Suspensionen in kleinen Mengen eingefroren werden. Um die Bildung von Eiskristallen zu vermeiden, werden dem Proliferationsmedium vor dem Einfrieren 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt.

Zunächst werden die PC12-Zellen wie oben beschrieben vereinzelt und gezählt. Anschließend erfolgt erneutes Zentrifugieren für 5 Minuten bei 1000 x g und Raumtemperatur. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in der gewünschten Menge Proliferationsmedium mit DMSO gelöst. Pro Cryo-Röhrchen wird 1 ml abgefüllt. Diese können nun bis zu einigen Monaten bei -84°C gelagert werden. Bei Bedarf werden die eingefrorenen Zellen in den Röhrchen rasch wieder aufgetaut und sofort in eine mit Proliferationsmedium gefüllte Zellkulturflasche gegeben, um das zellschädigende DMSO zu verdünnen.

3.2.2 Transfektion von PC12-Zellen

Transfektion ist eine Form des Gentransfers, bei der freie, lösliche DNA in eukaryotische Zellen eingeschleust wird. Dadurch kann die bei der Plasmidisolation gewonnene Plasmid-DNA in die PC12-Zellen eingebracht werden.

Es existieren verschiedene Methoden, um eine Transfektion durchzuführen. Für diese Arbeit wurden zwei Verfahren verwendet:

(1) Kationische Lipofektion für eine kleinere Anzahl an PC12-Zellen zum späteren Messen der Neuritenlängen

Material und Methoden

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3.2.4 Elektroporation

Bei der Elektroporation wird durch einen sich entladenden Kondensator kurzzeitig ein elektrisches Feld erzeugt, welches für einige Millisekunden kleine Perforationen in den Zellmembranen hervorruft, durch die freie, sich in Lösung befindende DNA in die Zelle eindringen kann. Verwendet wurde der EasyJecT Elektroporator aus der Abteilung für Neurologie der Medizinischen Hochschule Hannover.

Eine Optimierung des Versuchsaufbaus in Bezug auf die Zellzahl, die Menge an Plasmid-DNA sowie die Spannung und Kapazität an dem Elektroporator war durchgeführt worden (van Bergeijk et al., 2007). Dementsprechend werden für die Elektroporation 4 Millionen PC12-Zellen in 500 µl Proliferationsmedium aufgenommen und mit 120 µg Plasmid-DNA versetzt. Die Transfektion erfolgt in einer 4 mm Küvette bei einer Spannung von 350 V, einer Kapazität von 975 µF und einem Nebenwiderstand von 335 Ω. Dabei dauert ein Puls im Durchschnitt ungefähr 10 Millisekunden.

Direkt im Anschluss werden die Zellen in Proliferationsmedium verdünnt und nach erfolgreicher Elektroporation aller Ansätze auf mit Collagen beschichteten 6 mm Zellkulturschalen gegeben. Die Collagenbeschichtung wird nach denselben Angaben wie bei der Lipofektion durchgeführt. Über Nacht werden die Zellen im Brutschrank inkubiert.

3.2.5 Differenzierung der PC12-Zellen

24 Stunden nach Transfektion wird das Proliferationsmedium gegen Differenzierungsmedium ausgetauscht. Dieses enthält deutlich weniger Serum, dafür zusätzlich NGF, welches nur relativ frisch (haltbar für 2 Wochen bei 4°C) verwendet werden darf und in einer Stammlösung von 2 mg/ml vorliegt.

Differenzierungsmedium (van Bergeijk et al., 2006):

DMEM high glucose 1 % (v/v) Pferde-Serum 6 mM L-Glutamin 1 mM Natriumpyruvat

100 IU/ml / 0,1 mg/ml Penicillin/ Streptomycin 100 ng/ml NGF-β 7S

Neben dem Differenzierungsmedium wird gleichzeitig ein bekannter Inhibitor bzw. Aktivator der ROCK-Signalkaskade zu jeweils einem Ansatz hinzugegeben. Insgesamt werden neben einem

25 Kontrollansatz, der nur Differenzierungsmedium enthält, 3 verschiedene Substanzen verwendet, so dass sich 4 verschiedene Differenzierungsansätze ergeben.

Fasudil (Hydroxyfasudil; Calbiochem) wurde in bidest. H₂O gelöst (10 mM) und muss vor Licht geschützt werden. In dem Differenzierungsmedium soll es eine Konzentration von 30 µM haben.

fMLP (Sigma-Aldrich Chemikalien GmbH) wird in DMSO aufgenommen (7,6 mM) und um das 83fache verdünnt (91,6 nM).

C3bot wurde freundlicherweise von Dr. rer. nat. F. Hofmann aus dem Institut für Toxikologie zur Verfügung gestellt. In der Stammlösung ist das Toxin in 20 mM Hepes (pH 7,3) gelöst (114,1 µM) und soll im Versuchsansatz eine Konzentration von 100 nM erreichen.

Alle drei Substanzen werden bei -20°C gelagert. Unter Berücksichtigung der verschiedenen Vektoren ergeben sich mehrere Ansätze (Ergebnisse, Abb. 5-7) Nach dem Herstellen der Ansätze kann nun das alte Medium, welches sich auf den transfizierten PC12-Zellen befindet, abgenommen und stattdessen durch die einzelnen Ansätze ersetzt werden. Dabei wird in ein well einer 24-well-Platte 500 µl, in eine 6 mm Zellkulturschale 4 ml des Mediums hinzugefügt. Anschließend müssen die Zellen für 72 ± 2 Stunden im Brutschrank inkubieren.