Antigen Herkunft Spezifität WB Hersteller
4.2 Pharmakologische Intervention in Rho-GTPasen vermittelten Signalkaskaden verändert die Länge neuronaler Ausläufer von PC12-Zellen nach SMN
Abb. 4 ShRNA-vermittelter SMN knock-down in PC12-Zellen hemmt das Neuritenwachstum signifikant. (A) PC12-Zellen wurden mit dem shRNA-kodierenden pSupp.SMN-Plasmid, welches eine Reduktion des endogenen SMN-Proteinspiegels bewirkt, bzw. mit einem leeren Vektor zur Kontrolle (pSupp.control) transfiziert. Anschließend wurden die Zellen für 24h unter Proliferationsbedingungen kultiviert, dann für 72h mit NGF differenziert und fixiert. Durch Co-Transfektion mit dem Vektor pDsRed2 können die erfolgreich transfizierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop dargestellt und ausgemessen werden. Abgebildet sind repräsentative DsRed2-positive PC12-Zellen: oben nach Transfektion mit dem Kontrollvektor, unten unter SMN knock-down Bedingungen. (B) In vier voneinander unabhängigen Experimenten (n=4) wurde bei mindestens n=336 DsRed2-positiven Zellen pro Bedingung nur der jeweils längste neuronale Ausläufer gemessen. Dieser Neurit musste eine Mindestlänge von 40 μm haben und durfte die doppelte Länge des Zelldurchmessers nicht unterschreiten. Dargestellt sind die Mittelwerte der relativen Neuritenlänge mit dem Standardfehler. Signifikante Unterschiede wurden durch einen zweiseitigen Mann-Whitney-Test ermittelt (***, p<0,001).
4.2 Pharmakologische Intervention in Rho-GTPasen vermittelten Signalkaskaden verändert die Länge neuronaler Ausläufer von PC12-Zellen nach SMN knock-down
Das Aktin-Zytoskelett spielt eine elementare Rolle in der Bildung neuronaler Ausläufer und wird unter anderem durch das Aktin-bindende Protein Cofilin reguliert, welches essentiell für den dynamischen Auf- und Abbau von F-Aktin ist (Marsick et al., 2010). Phosphorylierung durch die Lim-Kinase führt zur Inaktivierung von Cofilin (Arber et al., 1998; Endo et al., 2003). Die Regulation der Lim-Kinase wiederum erfolgt über verschiedene Signalkaskaden der kleinen Rho-GTPasen: RhoA führt über ROCK zur Phosphorylierung und Aktivierung der Lim-Kinase (Maekawa et al., 1999).
0,8 0,9 1,0 1,1
Kontrolle SMN knock-down
relative Neuritenlänge
***
37 Aber auch die p21-aktivierte Kinase (PAK), deren Aktivierung sowohl durch Cdc42 als auch durch Rac1 vermittelt wird, ist in der Lage, die Lim-Kinase zu phosphorylieren und so zu aktivieren (Edwards et al., 1999; Abb. 2, Einleitung).
Unter SMN knock-down Bedingungen können in PC12-Zellen direkte Effekte stromabwärts der kleinen Rho-GTPasen beobachtet werden. Durch Reduktion des SMN-Proteinspiegels kommt es zu veränderten Phosphorylierungsmustern von Effektorproteinen von ROCK, was wiederum in Zusammenhang mit einer Hyperphosphorylierung von Profilin 2, einem weiteren Aktin-modulierenden Faktor, steht (Nölle et al., 2011). Eine pharmakologische Intervention an verschiedenen Angriffspunkten dieser Signalkaskaden sollte nun eine Veränderung der durch SMN knock-down reduzierten Neuritenlängen der PC12-Zellen provozieren. Die dabei eingesetzten Substanzen wurden während der neuronalen Differenzierung für 72h zusammen mit NGF und Differenzierungsmedium auf die bereits transfizierten PC12-Zellen gegeben. Als Vergleich wurden sowohl mit dem pSupp.SMN-Plasmid als auch mit dem pSupp.control-Plasmid transfizierte Zellen unter Kontrollbedingungen, also in Abwesenheit der eingesetzten Substanz, differenziert. Der potente ROCK-Inhibitor Fasudil führt bei Ntera-2 Neuronen und bei PC12-Zellen zu einer partiellen Wiederherstellung der Neuritenlänge trotz Inhibition des neuronalen Wachstums durch Chondroitinsulfat-Proteoglykane (Gopalakrishnan et al., 2008; Lingor et al., 2007). Um zu untersuchen, ob Fasudil eine durch SMN knock-down ausgelöste neuronale Wachstumshemmung in PC12-Zellen kompensieren kann, wurden die mit den entsprechenden pSuppressor-Plasmiden (pSupp.SMN vs. pSupp.control) transfizierten Zellen während der neuronalen Differenzierung mit 30 μM Fasudil inkubiert (Abb. 5, A). Bei der quantitativen Auswertung zeigte sich, dass das Längenwachstum des größten neuronalen Ausläufers unter Kontrollbedingungen durch die Anwesenheit des ROCK-Inhibitors nicht stimuliert wurde. Mit durchschnittlich 99,8 3,3 μm waren die längsten Neuriten sogar tendenziell kürzer als die im Mittel 105 3,6 μm langen Fortsätze der ohne Fasudil differenzierten PC12-Zellen (Abb. 5,B). Dagegen führte die Anwesenheit von Fasudil unter SMN knock-down Bedingungen zu einer signifikanten Wachstumssteigerung des längsten neuronalen Ausläufers (p<0,05) von durchschnittlich 88,9 3,3 μm auf 99 3,6 μm. Außerdem war zwischen den mit Kontrollvektor transfizierten und den mit pSupp.SMN Plasmid transfizierten Zellen unter Fasudil keine signifikante Längendifferenz mehr vorhanden, so dass Fasudil die Neuritenlängen funktionell wiederherstellen konnte (Abb. 5, B).
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP) induziert die Aktivierung von PAK und beeinflusst somit die Signalkaskade, die von Rac1 bzw. Cdc42 über PAK zu LimK führt (Huang et al., 1998;
Knaus et al., 1995). Wie bei Fasudil generiert auch die Zugabe von 91,6 nM fMLP während der neuronalen Differenzierung der PC12-Zellen keine Längenzunahme unter Kontrollbedingungen, die durchschnittlichen Werte liegen mit 105,4 2,6 μm in Abwesenheit und 102,3 2,9 μm in Anwesenheit von fMLP sehr nah beieinander (Abb. 6, A und B). Zwar steigerte fMLP unter SMN
39 A Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3 Ansatz 4
Vektor pSupp.control pSupp.SMN pSupp.control pSupp.SMN
Zugabe von — — fMLP fMLP
Abb. 6 Beeinflussung des Neuritenwachstums durch fMLP unter SMN knock-down Bedingungen. (A) PC12-Zellen wurden wie zuvor beschrieben mit pDsRed2 und pSupp.control bzw. pSupp.SMN transfiziert, für 24 h kultiviert und anschließend 72 h in Anwesenheit von NGF differenziert. Hierbei wurde der PAK-Aktivator fMLP zu zwei Ansätzen hinzugefügt, um eine mögliche Beeinflussung der Neuritenlängen unter Kontroll- und unter knock-down Bedingungen zu bestimmen. (B) Die Ausmessung des längsten Neuriten erfolgte nach den bereits erwähnten Selektionskriterien in drei voneinander unabhängigen Experimenten (n=3) mit mindestens n >
285 Zellen pro Ansatz. Die statistische Auswertung erfolgte über einen zweiseitigen Mann-Whitney-Test (***, p
< 0,001; n.s., nicht signifikant), abgebildet ist der Mittelwert mit dem Standardfehler. Auch fMLP ist in der Lage, eine Verkürzung der neuronalen Ausläufer unter SMN knock-down Bedingungen zu verhindern.
neuronalen Fortsätze (Ahnert-Hilger et al., 2004; Lehmann et al., 1999; Nishiki et al., 1990) und der wachstumshemmende Einfluss von Myelinsubstraten auf PC12-Zellen und primäre Retinazellen kann durch C3bot ausgeglichen werden (Lehmann et al., 1999). Um zu erproben, ob sich die stimulierende Wirkung von C3bot auch in einem SMA-Zellkulturmodell entfaltet, wurden die transfizierten PC12- Zellen in An- bzw. Abwesenheit von 100 nM C3bot für 72h differenziert (Abb. 7, A). Bei der quantitativen Auswertung zeigte sich, dass schon bei den mit Kontrollvektor behandelten Zellen die Zugabe von C3bot zu einer tendenziellen Wachstumssteigerung des längsten neuronalen Ausläufers um 5 % führte (Abb. 7, B). Unter SMN knock-down Bedingungen kam es in Anwesenheit des Rho-Inhibitors sogar zu einer massiven, signifikanten Zunahme des Neuritenwachstums von durchschnittlichen 88,9 3,3 μm auf 111,1 3,4 μm (p<0,001). Auch die negativen Auswirkungen des SMN knock-downs auf die Neuritenlänge konnten in Anwesenheit von C3bot vollständig kompensiert werden, denn mit durchschnittlich 111,1 3,4 μm waren die mit pSupp.SMN Plasmid
0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2
Kontrolle fMLP
relative Neuritenlänge
B
pSupp.control pSupp.SMN
*** n.s.
Ergebnisse
40 A Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3 Ansatz 4
Vektor pSupp.control pSupp.SMN pSupp.control pSupp.SMN
Zugabe von — — C3bot C3bot
Abb. 7 Das Rho A inhibierende C3bot hat von allen eingesetzten pharmakologischen Substanzen die stimulierenste Wirkung auf das Längenwachstum neuronaler Ausläufer der PC12-Zellen. (A) Transfektion, Kultivierung und neuronale Differenzierung von PC12-Zellen erfolgte wie bei den zuvor genannten Versuchen.
Als pharmakologische Substanz wurde C3bot bei der Differenzierung hinzugegeben. (B) Auch C3bot hebt den signifikanten Längenunterschied zwischen pSupp.control- und pSupp.SMN transfizierten PC12-Zellen auf.
Außerdem ist unter Kontrollbedingungen in Anwesenheit von C3bot eine tendenzielle Längenzunahme der neuronalen Ausläufer zu beobachten. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardfehler nach drei unabhängigen Versuchen (n=3) mit mindestens n > 145 PC12-Zellen je Bedingung. Die Messung der Längen erfolgte nach den bereits beschriebenen Selektionskriterien und wurde durch einen zweiseitigen Mann-Whitney-Test ausgewertet (***, p < 0,001; n.s., nicht signifikant).
transfizierten PC12-Zellen minimal länger als die im Mittel 110,2 3,9 μm langen Zellen, die mit dem Kontrollvektor transfiziert waren (Abb. 7, B). Somit zeigte C3bot von allen eingesetzten Substanzen den stärksten Effekt auf das Wachstum neuronaler Ausläufer in diesem SMA-Zellmodell, wobei sowohl Fasudil, fMLP als auch C3bot eine funktionelle Wiederherstellung des Neuritenwachstums unter reduziertem SMN-Proteinspiegel bewirken konnten und keiner der Substanzen eine signifikante Steigerung der Neuritenlänge unter Kontrollbedingungen gelang.
0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2
Kontrolle C3bot
relative Neuritenlänge
B
pSupp.control pSupp.SMN
***
***
n.s.
n.s.
41