Wirkung von AM80 auf die IL-17 Produktion pathogener gd T-Zellen ex vivo

4. ERGEBNISSE

4.2. AM80 SUPPRIMIERT DIE IL-17 P RODUKTION VON LEBERINFILTRIERENDEN gd T-Z ELLEN AUS M ÄUSEN MIT

4.2.1. Wirkung von AM80 auf die IL-17 Produktion pathogener gd T-Zellen ex vivo

4.2.1.1. Koinkubation mit AM80 führt auch bei geprimten Lymphozyten zu einer Re-duktion der IL-17-ProRe-duktion

Abbildung 15: Hepatische Leukozyten erkrankter Tiere in verschiedenen Kulturansätzen mit und ohne Ko-Inkubation von AM80

Legende:

Analyse der IL-17-Konzentration aus dem Überstand einer Zellkultur mit hepatischen Leuko-zyten erkrankter Tiere (Zellzahl 1x10⁵) mittels ELISA. Vorherige Stimulation mit einem an-tiCD3 Antikörper (Klon 2C11) und IL-23 (10 ng/ml) über 72h. Ein Ansatz mit zusätzlicher Sti-mulation durch antiCD28 (1µg/ml). Pro StiSti-mulationsbedingung jeweils ein Ansatz ohne Zuga-be von AM80 und ein Ansatz mit ZugaZuga-be von 100 nM AM80; ** = p<0.01

Die bisherigen Versuche zeigten die Wirkung von AM80 in einem artifiziellen Zellkultur-System, in welchem gd T-Zellen aus gesunden Mäusen zur Produktion von IL-17 stimuliert werden mussten. Im nächsten Schritt prüften wir gemäß Kernfrage 3, ob AM80 einen Ein-fluss auf die Effektorfunktion von im Tiermodell der Gallengangatresie geprägten, leberinfilt-rierenden gd T-Zellen hat. Hierfür wurden die Zellen aus erkrankten Lebern isoliert und

ana-0

Tiere in der Kontrollgruppe (grüne Kurve). Als Behandlung wurde den Tieren alle 2 Tage 1 µg AM80 gelöst in 50 µl CMC intraperitoneal injiziert, die Kontrollgruppe erhielt 50 µl PBS.

B) Gewichtsverlauf der in A) genannten Tiere. Das Gewicht (in g) wurde täglich bestimmt und protokolliert; *** = p<0.001, ** = p<0.01, * = p<0.1

Nach den eindeutigen in vitro Versuchen und dem zuvor geführten Nachweis, dass IL-17 im Mausmodell der Gallengangatresie ausschließlich von gd T Zellen produziert wird, behandel-ten wir im nächsbehandel-ten Schritt Mäuse, die zuvor gemäß des BA-Tiermodells mit Rhesus Rotavi-ren infiziert worden waRotavi-ren, ab dem 1. Lebenstag mit 1 µg AM80 intraperitoneal alle zwei Tage mit dem Ziel, die gd T-Zellen an der IL-17 Produktion zu hindern und so den Erkran-kungsverlauf der behandelten Tiere zu verbessern.

Insgesamt wurden in der Behandlungsgruppe 42 Tiere und in der Kontrollgruppe 49 Tiere beobachtet. Es ist zu erkennen, dass die meisten Tiere bis zum 13. Lebenstag überleben (Abb. 16 A). Bei den mit AM80 behandelten Mäusen findet sich ein deutlicher Einbruch der Überlebenskurve nach dem dreizehnten Tag und es leben anschließend nur noch ca. 50 Pro-zent der Tiere. Diese Zahl bleibt allerdings bis zum Ende des Beobachtungszeitraums stabil.

Die Überlebenskurve der Kontrollgruppe ähnelt lange Zeit der Kurve der behandelten Tiere, wobei der Einbruch der Überlebenszahlen am 15. Lebenstag und damit etwas später erfolgt.

Dafür leben nach dem 15. Lebenstag nur noch knapp 30 Prozent der unbehandelten Tiere und diese Zahl sinkt zum Ende der Beobachtungsperiode noch auf 20 Prozent ab. Nach 20 bzw. 21 Tagen leben somit von den mit AM80 behandelten Tieren noch rund 50 Prozent und von den Tieren, denen lediglich PBS injiziert wurde noch ca. 20 Prozent. Diese überlebenden Tiere wurden nach Ende der Beobachtungszeit dekapitiert. Insgesamt findet sich zwischen den beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied bzgl. des Überlebens (Abb. 16 A).

Betrachtet man den Gewichtsverlauf der Tiere (Abb. 16 B), ist bis zum siebten Lebenstag bei Behandlungs- und Kontrollgruppe ein nahezu identischer Verlauf zu erkennen, wobei der Gewichtsverlaufs bereits ab Tag 5 signifikant unterschiedlich ist. Im Anschluss nehmen die Tiere der Behandlungsgruppe weiter mehr zu und erreichen am 20. Lebenstag ein durch-schnittliches Gewicht von zehn Gramm. Der Gewichtsverlauf der PBS-Gruppe ist weniger steil und flacht zusätzlich nach dem 17. Lebenstag ab, sodass die Mäuse nach 21 Tagen nur rund acht Gramm im Durchschnitt wiegen. Insbesondere zwischen Lebenstag 13 und 15 fin-det sich ein hochsignifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.

4.3.1.2. Konzentrationen von Bilirubin, GOT, GPT und LDH im Serum von Mäusen sind unter AM80-Behandlung leicht reduziert

Abbildung 17: Konzentrationen von Bilirubin (A), GOT (B), GPT (C) und LDH (D) im Serum von AM80-behandelten Tieren im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe

Legende:

A) Messung der Serumkonzentration von Bilirubin im Blut der AM80-behandelten Mäuse und der Kontrollgruppe an Lebenstag 14. Behandlungsgruppe n=13, Kontrollgruppe n=12. Serum-Gewinnung durch Zentrifugation des Vollblutes, anschließend Verdünnung des Serums im Verhältnis 1:2 und Messung von Bilirubin mittels AU 400 Olympus Analyzer; ** = p<0.01 B) Messung der Serumkonzentration von GOT im Blut der AM80-behandelten Mäuse und der Kontrollgruppe an Lebenstag 14 (s. A)); * = p<0.1

C) Messung der Serumkonzentration von GPT im Blut der AM80-behandelten Mäuse und der Kontrollgruppe an Lebenstag 14 (s. A)).

D) Messung der Serumkonzentration von LDH im Blut der AM80-behandelten Mäuse und der Kontrollgruppe an Lebenstag 14 (s. A)); *** = p<0.001

Die Tiere wurden nicht nur im Hinblick auf das Überleben und ihren Gewichtsverlauf unter-sucht, sondern gleichzeitig wurden einige Tiere am 14. Lebenstag zur Untersuchung des Se-rums herangezogen. Zu diesem Zweck wurden aus der Behandlungsgruppe 13 Tiere und aus der Kontrollgruppe 12 Tiere per Dekapitation euthanasiert.

Die Ergebnisse der Serumanalyse zeigen, dass bei allen Parametern der Mittelwert in der Behandlungsgruppe unter dem der Kontrollgruppe liegt. Besonders deutlich ist dies bei der Aktivität der Laktatdehydrogenase (LDH) zu erkennen, welche im Serum der behandelten Tiere im Mittel ca. 2500 U/L beträgt und bei den Tieren der Kontrollgruppe knapp 4000 U/L (Fig. 17D). Neben dem hoch signifikanten Unterschied der Serummittelwerte der LDH ergab auch der Vergleich der Serumkonzentrationen von Bilirubin und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) bei Behandlungs- und Kontrollgruppe einen signifikanten Unterschied.

4.3.1.3. Genexpression von IL-6 und MCP-1, nicht aber von Kollagen 1a1, wird durch prophylaktische Behandlung mit AM80 supprimiert

Abbildung 18: Genexpression von Il-6, MCP-1 und Kollagen 1a1 in den Lebern von AM80-behandelten Mäuse im Vergleich zur unAM80-behandelten Kontrollgruppe

Legende:

A) Genexpression von IL-6 in den Hepatozyten von AM80-behandelten Tieren (n=13) an Le-benstag 14 verglichen mit der IL-6-Genexpression in Hepatozyten der Kontrolltiere (n=12).

Die Lebern der Tiere wurden an Lebenstag 14 präpariert, bei -80 °C gelagert und im Verlauf mittels quantitativer real-time PCR analysiert.

B) Genexpression von MCP-1 in den Hepatozyten von AM80-behandelten Tieren (n=13) an Lebenstag 14 verglichen mit der MCP-1-Genexpression in Hepatozyten der Kontrolltiere (n=12) (vgl. A)).

C) Genexpression von Collagen1a1 in den Hepatozyten von AM80-behandelten Tieren (n=13) an Lebenstag 14 verglichen mit der Kollagen1a1-Genexpression in Hepatozyten der Kontroll-tiere (n=12) (vgl. A)).

Neben den Blutuntersuchungen erfolgten auch Analysen hinsichtlich der genetischen Ex-pression proinflammatorischer Zytokine bzw. der genetischen ExEx-pression von Fibrosemar-kern in den Lebern behandelter und nicht behandelter Tiere. MCP-1 auch bekannt als CCL-2 gehört der großen Familie der CC Chemokine an und ist einer der entscheidenden Faktoren bei der Rekrutierung von Monozyten bzw. Makrophagen zum Ort der Entzündung⁶⁶. Nach Behandlung mit AM80 kam es in den Mäusen zu einer Herabregulation der genetischen Ex-pression von MCP-1, welche allerdings nicht signifikant war. Auch die ExEx-pression des IL-6-Gens zeigte sich nach Anwendung des synthetischen Retinoids im Vergleich zur Kontroll-gruppe reduziert. IL-6 führt über Bindung an den IL-6-Rezeptor zur Aktivierung des JAK-STAT- und MAP-Kinase-Signalwegs und wirkt u.a. stimulierend auf Lymphozyten. Die Differenzie-rung von Monozyten hin zu Makrophagen wird durch IL-6 gefördert⁶⁷.

In Bezug auf die genetische Expression von Kollagen 1a1, einem Fibrosemarker, zeigte sich kein Unterschied zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe.

Abbildung 19.1.: Anzahl GR-1 (A) und F4/80 (B) positiver Zellen in der murinen Leber, quantifiziert mittels GR-1 bzw. F4/80 cell score

Legende:

A) Auswertung der immunhistochemischen Färbung der Leberschnitte von AM80-behandelten Tieren (n=13) im Vergleich zur Kontrollgruppe (n=12). Quantifizierung der GR-1-positiven Zellen mittels GR-1+ cell score (Zellen pro Gesichtsfeld); *** = p<0.001

B) Auswertung der immunhistochemischen Färbung der Leberschnitte von AM80-behandelten Tieren (n=13) im Vergleich zur Kontrollgruppe (n=12). Quantifizierung der F4/80 positiven Zellen mittels F4/80+ cell score (Zellen pro Gesichtsfeld).

F4/80 ist ein typischer Oberflächenmarker für Makrophagen. Während hepatischer Entzün-dungs- und Fibroseprozesse spielen verschiedene Makrophagen Unterarten eine Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass im Falle einer Entzündungsreaktion zirkulierende GR-1 positive Monozyten die Leber infiltrieren und sich zu GR-1+ F4/80+ Makrophagen entwickeln kön-nen, welche wiederrum Zytokine wie z.B.: TGF-b sezernieren und über längere Sicht Leber-fibrose induzieren können^68,69.

In den Versuchen mit dem Tiermodell der experimentellen BA wurden die Lebern der am 14.

Lebenstag euthanasierten Tiere (s.o.) histologisch untersucht. Hierbei wurde eine immunhis-tochemische Färbung der Oberflächenmarker GR-1 und F4/80 durchgeführt. In den unbe-handelten Kontrolltieren zeigen sich GR-1 positive Zellen quasi ausschließlich im Bereich der Gallengänge. F4/80 positive Zellen finden sich im gesamten Leberparenchym mit einer Häu-fung ebenfalls im Bereich der Gallengänge. Nach Behandlung mit AM80 sind

immunhisto-63

chemisch nahezu keine GR-1 positiven Zellen mehr nachzuweisen (Abb. 19). Die Anzahl an F4/80+ Zellen ist nach AM80-Behandlung nicht signifikant reduziert (Abb. 19.1. B). Zwar zeigt sich bildmorphologisch eine reduzierte F4/80-Färbung des Parenchyms, im Bereich der Gal-lengänge scheint allerdings weiterhin eine Kumulation F4/80 positiver Zellen zu bestehen.

Zusammenfassend lässt sich im Hinblick auf Fragestellung 4 (Verbesserte die Anwendung des Retinoids AM80 im Tiermodell der Gallengangatresie den Krankheitsverlauf der Tiere) feststellen, dass AM80 einige inflammatorische Marker im Tiermodell signifikant verminder-te, jedoch das Gesamtüberleben von der Therapie nicht beeinflusst werden konnte.

64 5. Diskussion

Die Gallengangatresie ist eine exklusiv in den ersten Lebensmonaten auftretende, entzünd-lich-destruierende Erkrankung der Gallengänge, die bei den meisten Säuglingen innerhalb von Monaten ein Leberversagen zur Folge hat. Eine kausale Therapie ist nicht verfügbar, somit ist die Gallengangatresie die häufigste Ursache für eine Lebertransplantation im Kin-desalter. Die Ätiologie dieser seltenen Erkrankung ist unklar. Klinische und experimentelle Daten deuten auf einen viral getriggerten, autoimmunen Prozess hin, doch bleiben die ge-nauen Mechanismen und beteiligten Immunzellen dieser überschießenden Immunreaktion unklar. Basierend auf der Annahme, dass die Entzündung der Gallengänge durch Aktivierung der für das neonatale Immunsystem spezifischen Zellen bedingt ist, suchten wir die initialen Träger der Entzündungsreaktion. Hierzu nutzen wir das BA-Mausmodell, in welchem durch Injektion von Rotavirus in Neonaten eine hepatobiliäre Entzündung mit konsekutiver Atresie der extrahepatischen Gallengänge induziert wird. Unsere Analysen der leberinfiltrierenden Leukozyten zeigten, dass ausschließlich in erkrankten Tieren ein stark erhöhter Anteil von IL-17 produzierenden gd T-Zellen nachweisbar ist⁵². Antikörperbasierte Hemmung der IL-17-Produktion verbesserte den Krankheitsverlauf der experimentellen BA⁵². Hieraus leiteten sich folgende Ziele für die vorliegende Arbeit ab: 1) gd T-Zellen zu isolieren und ein in vitro System zur Untersuchung ihrer Modulation bzw. Hemmung zu etablieren sowie 2) die Effek-te von Retinoiden auf die IL-17 Produktion der gd T-Zellen in vitro und 3) im Tiermodell zu untersuchen, um einen möglichen, neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung der bisher unheilbaren Erkrankung Gallengangatresie zu evaluieren.

5.1.Suppression von IL-17 durch Retinoide

IL-17 ist ein potentes, pro-inflammatorisches Zytokin, das Entzündungen initiiert und unter-hält, indem es die Produktion anderer inflammatorischer Zytokine und Chemokine, Matrix-remodelling Proteine und akute Phase Proteine verstärkt. In den letzten Jahren konnte für eine Reihe von Erkrankungen eine wesentliche, entzündungsinduzierende Rolle von IL-17 gezeigt werden. Als Hauptkonsequenz von IL-17-Signalen tritt eine starke Rekrutierung von pro-inflammatorischen Zellen, im Besonderen neutrophilen Granulozyten an den Entzün-dungsort auf. Neben den Beobachtungen unserer Arbeitsgruppe, die gd T-Zellen und nicht ab T-Zellen als Hauptproduzenten von IL-17 in der experimentellen BA identifizierten, wurde auch in anderen autoimmunen Tiermodellen die pathogenetische Rolle IL-17 produzierender

gd T-Zellen nachgewiesen^70,45. Bei gd T-Zellen wurde eine Inhibition der Differenzierung zum Th17 Phänotyp durch Retinoide beschrieben. Voraussetzung für die Produktion von IL-17 durch T Zellen ist die Expression des Transkriptionsfaktor Retinoid-Orphan-Receptor gamma t (RORgt). Die Differenzierung und Effektorfunktion von RORgt+ CD4+ ab T Zellen (Th17-Zellen) wird durch Retinoidadministration effektiv verhindert: Retinoide wirken auf Th17 Zellen durch eine Retinoid-Acid-Receptor-alpha (RARa) vermittelte Herabregulation des Master-Transkriptionsfaktors RORgt, sowie einer Herabregulation des IL-6 Rezeptors und STAT3-Phosphorylierung⁶³. Weiterhin induzieren Retinoide die Differenzierung von Foxp3+ T regulatorischen T Zellen⁶³, die bei adoptivem Transfer den klinischen Verlauf der Gallen-gangatresie in der Maus positiv beeinflussen können. Die Wirkung von Retinoiden auf gd T-Zellen im Modell der Gallengangatresie wurde bisher nicht untersucht. Daher war es unser Ziel ein System zur Zellkultur von IL-17 produzierenden gd T Zellen zu entwickeln, um einen möglichen Effekt von Retinoiden zu erforschen.

5.2.Etablierung der Zellkultur für gd T-Zellen

Für unser Zellkultur-System isolierten wir gd T-Zellen aus Lymphknoten und Milzen gesunder Mäuse. Da gd T-Zellen im LK adulter Mäuse nur ca. 1% der T Zellen und in der Milz lediglich rund 5% der T Zellen ausmachen, mussten für einen Zellkulturansatz die Lymphknoten und Milzen mehrerer Mäuse gepoolt werden, um eine ausreichende Zellausbeute zu gewährleis-ten. Entscheidend war zudem, die initiale Zellsuspension auf verschiedene MACS-Säulen aufzuteilen, um die Säulen nicht zu überfrachten und ein Verstopfen zu verhindern. Nach der Separation überprüften wir die Reinheit der isolierten Zellen mittels FACS. Im nächsten Schritt mussten die gd T-Zellen stimuliert und zur Bildung von IL-17 angeregt werden. Initial setzten wir, analog zu Differenzierungskulturen von ab T Zellen, verschiedene Kombinatio-nen von IL-6 und TGFb ein. Hierbei zeigte sich allerdings im Gegensatz zu ab T Zellen keiner-lei IL-17 Produktion (Abb. 7 B) Dies könnte dafür sprechen, dass IL6/TGFb zwar bei der Diffe-renzierung zum Th17 Phänotyp eine Rolle spielen, jedoch bei gd T Zellen, die in verschiede-nen ‚Thymic waves‘ während der embryonalen Entwicklung terminal differenzieren und so-mit bereits funktionell programmiert sind⁷¹, keinen Effekt auf die Fähigkeit IL-17 zu produ-zieren haben können.

Bei Zusatz von IL-23, auch ohne IL6/TGFb, zu der Zellkultur zeigte sich dann hingegen eine substantielle Menge IL-17 (Abb. 7B). Dies spricht für eine Schlüsselrolle von IL-23 bei der Produktion von IL-17, welche auch in verschiedenen Arbeiten belegt ist^38,45.

Neben dem Zytokinmilieu war auch die Art der T Zell Stimulation entscheidend für die Men-ge des produzierten IL-17. T Zell Rezeptorstimulation erfolgte mit einem pan-T Zell antiCD3 Antikörper sowie auch mit einem TCRgd-spezifischen Antikörper (GL3) (Abb. 7A). Die Co-Stimulation mit aCD28 führte zu einem deutlichen Anstieg der gemessenen IL-17 Werte in beiden Kulturansätzen. Hieraus schließen wir, dass die TCR vermittelte Aktivierung einen ausreichend starken Stimulus zur IL-17 Produktion in unserem System darstellt.

Bezüglich der zeitlichen Kinetik war ein deutlicher Anstieg des sezernierten IL-17 bis zum dritten Tag in Kultur zu beobachten (Abb. 7D), anschließend stieg die IL-17 Produktion nur noch wenig an, jedoch zeigte sich mikroskopisch ein deutliches Absterben der Zellen. Somit wurde in den folgenden in vitro Experimenten eine Stimulation mit GL3 über 3 Tage in An-wesenheit von IL-23 durchgeführt, um eine stabile und ausreichend hohe IL-17 Induktion zu erhalten. Da IL-17 ein recht stabiles Protein ist und in der Kultur keine anderen Zellen, die das IL-17 verbrauchen könnten, anwesend waren, gehen wir somit davon aus, dass der ge-messene Wert die kumulative Produktion der IL-17+ gd Subpopulation darstellt. Initial ver-muteten wir, dass kürzere Stimulationszeiten ausreichen würden, da gd T-Zellen im neona-talen Organismus zu den Vertretern der frühen Immunabwehr gehören und nach Stimulati-on innerhalb weniger Stunden proliferieren und Zytokine produzieren. Als Mediator der In-fektabwehr gegenüber extrazellulären Bakterien wie Klebsiella pneumoniae⁷² Staphylococ-cus aureus⁷³ wird IL-17 in vivo rasch sezerniert. Daher führten wir zusätzlich durchflusszyto-metrische Experimente durch, in denen wir reine gd T-Zellen auf die Produktion von intrazel-lulärem IL-17 hin untersuchten. Hier zeigte sich, dass nur in frühen Zeitpunkten intrazellulär IL-17 nachweisbar war, wohingegen es nach 72h kein messbares Signal mehr gab. Dies ist am ehesten durch die Methodik der intrazellulären Zytokinfärbung zu erklären, für die eine 4-6h Re-Stimulation mit PMA/INO erforderlich ist, und die vorstimulierten Zellen dies nicht in aus-reichender Anzahl überlebten bzw. durch die Prä-Stimulation ihren TCRgd herunterregulier-ten⁷⁴.

Wir hatten somit ein robustes Kultursystem etabliert, mit welchem sich gd T-Zellen zur Se-zernierung von IL-17 anregen ließen und sich diese Menge zuverlässig und verhältnismäßig einfach via ELISA messen ließ.

5.3.Dosisabhängige Suppression der IL-17 Produkti on von gd T-Zellen durch Retino-ide

Für unsere pharmakologischen Studien verwendeten wir den synthetischen Retinoid-Rezeptor-a-Agonisten AM80, der sich gegenüber anderen Retinoiden wie z.B. All-trans-retinoic-acid (ATRA) durch eine ausgesprochen hohe Rezeptorspezifität und deutlich überle-gene pharmakologische Eigenschaften in Bezug auf Resistenz gegenüber Hitze, Licht und Oxidation auszeichnet. Weiterhin ist AM80 unter dem Handelsnamen Tamibarotene zur Be-handlung der ATRA-refraktären akuten myeloischen Leukämie im Menschen zugelassen. In niedriger Dosierung kann AM80 die Differenzierung von Th17-Zellen effektiver modulieren als ATRA, gleichzeitig wird durch seinen Einsatz die Expression des Transkriptionsfaktor RORgt effektiv herunterreguliert⁶³.

Unsere Daten zeigen, dass AM80 nicht nur auf die Differenzierung von CD4+ TH17-Zellen supprimierend wirkt, sondern auch gd T-Zellen signifikant beeinflusst. Bei Co-Inkubation mit AM80 unter den oben diskutierten Kulturbedingungen kam es zuverlässig zu einer dosisab-hängigen Reduktion sowohl des in die Überstände sezernierten IL-17 (Abb. 9 und 10) als auch der mRNA-Expression (Abb. 12). Der Master-Transkriptionsfaktor RORgt+ wurde nach Co-Inkubation mit AM80 vermindert exprimiert (Abb. 12).

Schon eine sehr geringe Menge des Retinoids AM80 führte nahezu zu einer Halbierung des IL-17-Gehalts in den Kulturüberständen (Abb. 9). Bei dieser geringen Retinoid-Konzentration von 0,1 nM war nicht damit zu rechnen, dass die Substanz eine generelle Immunsuppression oder Toxizität aufweist, sondern spezifische Effekte erzielt. Auffällig war, dass nach einer Inkubationszeit von 24h auf die zu diesem Zeitpunkt sehr geringen Mengen IL-17 im Über-stand kein Effekt zu erkennen war. In den oben genannten durchflusszytometrischen Expe-rimenten konnte zu diesem Zeitpunkt Il-17 intrazellulär in gd T-Zellen nachgewiesen werden.

Eine Ko-Inkubation der Zellen mit AM80 führte zu einer Halbierung des intrazellulären IL-17 Gehaltes (Abb. 14). IL-17 ist, wie zuvor beschrieben, methodisch bedingt intrazellulär nur zu frühen Zeitpunkten nachweisbar.

5.3.1. Dosisabhängige Reduktion von IL-17A, IL-17F, IFN-g sowie reziproke In-duktion von IL-4 in gd T Zellen durch AM80

Die Ergebnisse des ELISA-Verfahrens wurden durch den Cytometric Bead Array (CBA) bestä-tigt. 1 nM AM80 führte zu einer Reduktion der 17A Konzentration von 5000 pg/ml. Die

IL-68

17F Konzentration wurde durch die Zugabe dieser Menge AM80 halbiert. Der CBA Assay zeigt bei einer Erhöhung der Retinoid-Konzentration auf 100 nM keinen weiteren Effekt.

Im Gegensatz zu seinem Effekt auf proinflammatorische Zytokine führte die Zugabe von AM80 zu einem kontinuierlichen Anstieg des Zytokins IL-4 (Abb. 10). IL-4 ist ein antiinflamm-atorisches Zytokin, welches in vivo von verschiedenen Zellen des angeborenen und adapti-ven Immunsystems, v.a. Th2-Zellen, produziert wird⁷⁵. Im Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis korrelierte die IL-4 Produktion mit einem verbesserten kli-nischen Bild der Erkrankung. Einer der vermuteten Mechanismen ist, dass IL-4 produzieren-de T-Zellen im ZNS das Nervengewebe über eine Aktivierung produzieren-der Mikroglia vor Stoffen wie TNF-a und Stickoxid schützen können⁷⁶.

Während der Erstellung dieser Dissertation wurden zwei Arbeiten publiziert, die ebenfalls zeigten, dass Retinoide grundsätzlich auf gd T-Zellen wirken können Mielke et al. konnten im Rahmen eines Kolitismodells nachweisen, dass Retinsäure die in vitro Produktion von IL-22 und von IFNg durch gd T-Zellen signifikant verstärken kann⁷⁷. Im Gegensatz dazu, wurde die IL-22 Produktion von CD4+ T-Zellen durch die Retinsäure nicht beeinflusst. In der gleichen Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anwendung von Retinsäure die intestinale Entzün-dungsreaktion in vivo abschwächt und gleichzeitig die Anzahl von IL-22 produzierenden gd T-Zellen im Kolon erhöht⁷⁷. Mittels Promotoranalysen ließ sich feststellen, dass RA-Rezeptoren an bestimmte RARg-Bindungsmuster im IL-22 Promotor der gd T-Zellen binden. Das bedeu-tet, dass die Retinsäure die IL-22 Produktion direkt und unabhängig von Signalen des T-Zellrezeptors über die Bindung von RAR Transkriptionsfaktoren fördert⁷⁷. Auch im Modell der experimentellen autoimmunen Uveitis zeigte sich wie oben beschrieben ein deutlicher Effekt des Retinoids ATRA auf die gd T-Zellen. Nicht nur ihre Anzahl wurde durch die Behand-lung vermindert, sondern auch ihre IL-17 Produktion supprimiert⁷⁸.

Im Dokument Effekte synthetischer Retinoid-Rezeptor-Liganden auf IL-17 produzierende γδ T-Zellen in der experimentellen Gallengangatresie (Seite 55-0)