Durchführung der Reinheitskontrolle

Das Verfahren der Durchflusszytometrie wurde angewendet um die Reinheit der positiv se-lektierten gd T-Zell-Fraktion zu überprüfen. Dafür wurden nach Abschluss der magnetischen Separation ca. 5x10^5 Zellen aus der gd T-Zell-Fraktion entnommen und in 1,5 ml FACS-Tubes überführt. Nach zweimaligem Waschen mit 200 µl FACS-Puffer bei 250 x g wurden die Zellen zunächst in PBS mit einem fluoreszierenden Antikörper, der an aminreaktive Gruppen auf toten Zellen bindet, gemäß Herstellerprotokoll gefärbt (Fixable dead/live kit, eBio) und für 30 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Dieser Antikörper färbt tote Zellen an (Fixable dead live kit: Viability dye) und erlaubt daher eine Differenzierung zwischen toten und le-benden Zellen.

Nach weiteren Waschschritten wurde die T-Zell-Phänotypisierungsfärbung 1 (siehe Tabelle) der Zelloberfläche vorgenommen, wobei ein Teil der Zellen als ungefärbte Kontrolle diente.

Die Oberfläche der T-Zellen wurde auf die Expression verschiedener Marker hin untersucht.

Da das Ziel der Färbung war, den Anteil der gd T-Zellen in der Kultur zu bestimmen, wurden Marker eingesetzt, die zunächst Leukozyten von allen übrigen Zellen und anschließend T-Zellen von den anderen Immunzellen unterscheiden (CD45 und CD3e). Im Anschluss wurde innerhalb der T-Zellen zwischen ab T-Zellen (TCRab) und gd T-Zellen (TCRgd) differenziert.

Zur Detektion wurden Fluorochrom-gekoppelte Antikörper, die an die entsprechenden Ober-flächenmarker binden, eingesetzt. Sie sind der unten stehenden Tabelle zu entnehmen. Die-se erste Phänotypisierungsfärbung diente zur Reinheitskontrolle der Kulturansätze. Der Her-steller des TCR gd+- Isolation Kit liefert in diesem Kit schon einen Antikörper mit, der der Detektion der gd T-Zellen in der Durchflusszytometrie dienen soll (a-Biotin-APC). Im Verlaufe des magnetischen Separationsprozesses waren die gd T-Zellen zunächst indirekt mit einem Anti-TCRgd-Biotin-Antikörper markiert worden. An das Molekül Biotin soll auch der im Kit

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enthaltene Fluochrom-gekoppelte Antikörper binden und so die gd T-Zellen im Durchflusszy-tometer erkennbar machen. Da dieser Antikörper allerdings nicht einwandfrei funktionierte, setzten wir einen vom Kit unabhängigen TCRgd-Antikörper ein (TCRgd-PE) und konnten so die gd T-Zellen eindeutig markieren.

Nach der Zellfärbung wurden die Proben zweimal mit 200 µl FACS-Puffer gewaschen, zentri-fugiert und nach dem letzten Waschschritt in 100 µl FACS-Puffer resuspendiert.

Erfolgte die Analyse der Proben am gleichen Tag wurde auf die Fixierung der Zellen verzich-tet. War dies nicht der Fall, wurden die Zellen im Anschluss an die Färbung 30 Minuten mit 2

% PFA inkubiert, daraufhin gewaschen und in 200 µl FACS-Puffer aufgenommen und für ma-ximal 72h unter Lichtschutz bei 4°C bis zum Einlesen der Zellen gelagert.

Die Analyse der gd T-Zellen nach MACS Isolation zeigte in allen Experimenten eine Reinheit von 92% oder mehr.

FITC PE PerCP-Cy5.5

PE-Cy7 APC eF780 eF450 eF506

Phänotypisierun-gen T-Zell

Phänotypi-sierung 1

TCRab TCRgd CD3e

a-Biotin

CD45 Fixable viability Dye

1:600 1:100 1:200 1:10 1:600 1:1000

T-Zell Phänotypi-sierung 2

CD8a TCRgd CD3e CD25 TCRb CD4 CD45 live/dead

1:600 1:100 1:200 1:200 1:600 1:600 1:600 1:1000 Tabelle 2: Färbeprotokoll T-Zell-Phänotypisierung 1

32 3.11. Apoptose-und Nekrose-Bestimmung

Um die Viabilität der isolierten Zellen in der Kultur zu bestimmen und zu überprüfen, ob sich das synthetische Retinoid AM80 negativ auf das Überleben der Zellen auswirkt, wird der ApoLive-Glo Multiplex Assay der Firma Promega eingesetzt.

Hierbei werden zwei Chemikalien kombiniert, um zum einen die Aktivität der Protease le-bendiger Zellen und zum anderen die Aktivierung der Caspase 3 und 7, welche ein Biomarker für den programmierten Zelltod ist, zu ermitteln. So ist es möglich mit einem Assay gleich-zeitig Viabilität und Apoptose der Zellen zu messen.

Die Protease lebendiger Zellen, setzt das im Assay verwendete Substrat Glycyl-phenylalanyl-amino fluorocumarin (GF-AFC), welches die Zellmembran passieren kann, um und generiert dadurch ein Fluoreszenz-Signal. Dieses Signal ist proportional zur Zahl lebendiger Zellen in der Kultur und kann mit einem Mikroplattenleser detektiert werden.

Das im Caspase-Glo3/7-Reagenz enthaltene Substrat der Caspase 3/7 wird nach Zugabe zur Zellkultur von dieser umgesetzt. Dadurch wird ein Substrat der Luciferase, das Aminolucife-rin, frei, welches wiederum von der Luciferase umgesetzt wird. Aus dieser Reaktion resultiert die Generierung eines Lumineszenz-Signals, das proportional zur Caspase-Aktivität in der vorliegenden Zellkultur ist.

Durchführung:

Vor dem eigentlichen Versuchsbeginn werden die Reagenzien nach Herstellerangaben her-gestellt.

Um eine Aussage über die Lebendigkeit bzw. den Zelltod der Zellen in der zu untersuchen-den Kultur treffen zu können, müssen verschieuntersuchen-dene Kontrollen mitgeführt weruntersuchen-den. Zum ei-nen werden drei Wells der Kulturplatte ausschließlich mit Medium befüllt und dieei-nen somit als negative Kontrolle ohne Zellen. Zum anderen werden Zellen verwendet, die nur in Medi-um gegeben aber ansonsten nicht weiter behandelt wurden. Sie werden als Kontrolle mit unbehandelten Zellen bezeichnet. Außerdem wird eine Positivkontrolle für die Apoptose angelegt, indem drei Wells der Zellkulturplatte für sechs Stunden mit 10µM Staurosporin inkubiert werden. Dieser Stoff verhindert die Bindung von ATP an die Proteinkinase, was letztendlich zum Zelltod führt.

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Nach den Vorbereitungen wird dann sowohl zu den Kontrollen als auch zu den zu untersu-chenden Proben 20µl des Viabilitäts-Reagenz hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37°C wird dann die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 400-500 nm mit dem Mikroplattenleser GloMax gemessen. Anschließend werden 100µl des Caspase-Glo 3/7-Reagenz in alle Wells gegeben. Es folgt bei Raumtemperatur eine weitere Inkubationszeit von 30 Minuten. Danach wird die Lumineszenz ebenfalls mit dem GloMax bestimmt.

3.12. Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Zur Quantifizierung von Zytokinen in Kulturüberständen kann als Methode der Enzym-Linked Immunosorbent Assay herangezogen werden. Die Nachweismethode beruht auf einer Reak-tion des Antigens mit spezifischen Antikörpern. Bei dem hier verwendeten Sandwich-ELISA werden zwei Antikörper eingesetzt. Ein sog. Capture-Antikörper, der an den Boden einer 96-well Mikrotiterplatte bindet, die im Überstand enthaltenen Antigene abfängt und mit ihnen einen stabilen Immunkomplex bildet. Nach mehrmaligem Waschen und Abblocken der freien Bindungsstellen wird ein biotynilierter Zweitantikörper hinzugefügt, der ebenfalls an das Antigen bindet und Detektions-Antikörper genannt wird. Hierbei ist hervorzuheben, dass beide Antikörper zwar an das gleiche Antigen, aber an unterschiedliche Epitope binden und so den namensgebenden Sandwich-Komplex formen.

In einem weiteren Versuchsschritt wird ein Enzym an den Detektions-Antikörper gebunden, welches nach Zugabe eines Substrates eine Farbreaktion hervorruft. Die Stärke der Farbreak-tion wird mit Hilfe eines Photometers gemessen und abschließend die ZytokinkonzentraFarbreak-tion anhand einer Standardkurve bestimmt.

3.13. Interleukin-17 ELISA

Zur Bestimmung der Menge an IL-17 in den Kulturüberständen wurde der IL-17-Maus DuoSet ELISA der Firma R&D Systems verwendet. Sowohl beim IL17 als auch beim u.g. IFNg -ELISA handelt es sich um einen sog. Indirekten Sandwich -ELISA.

3.13.1. Material und Reagenzien Lösungen:

Reagentpuffer: 1 % BSA in 1xPBS

Waschpuffer: 0,05 % Tween 20 (Polyethylensorbitonmonolaurat) in 1xPBS

34 3.14. Interferon-g ELISA

Zur Bestimmung der Menge an IFNg in den Kulturüberständen wurde der IFNg-Maus DuoSet ELISA der Firma R&D Systems verwendet. Die Durchführung erfolgte in allen Schritten exakt anhand des Herstellerprotokolls.

3.14.1. Material und Reagenzien Lösungen:

Reagentpuffer: 1 % BSA in 1xPBS

Waschpuffer: 0,05 % Tween 20 (Polyethylensorbitonmonolaurat) in 1xPBS

3.14.2. Durchführung

Das Protokoll unterscheidet sich außer in der Zusammensetzung des Reagentpuffers und des Blockpuffers nicht von dem des IL-17 ELISAs (s.o.). Alle Schritte werden exakt anhand der Vorgaben des Protokolls durchgeführt.

3.15. Charakterisierung der T-Zell-Verteilung inkl. des Anteils IL-17 positiver gd T-Zellen mittels Durchflusszytometrie

3.15.1. Oberflächenfärbung

Der Unterschied zu der unter 3.8 beschriebenen T-Zell-Phänotypisierungs-Färbung liegt da-rin, dass nicht die Reinheit der gd T-Zell-Kultur überprüft werden sollte, sondern die Diffe-renzierung der T-Zellen in der Leber von erkrankten Tieren bzw. in Milz und Lymphknoten.

Dabei wurden CD8a- und CD4-Antikörper eingesetzt, um die T-Zellen genauer zu differenzie-ren. Außerdem diente der Antikörper gegen das Oberflächenmolekül CD25 dazu, aktivierte von nicht aktivierten T-Zellen zu unterscheiden. Die gesamte Liste der eingesetzten Antikör-per ist der folgenden Tabelle unter dem Punkt „T-Zell-Phänotypisierung 2“ zu entnehmen.

Der Ablauf der Färbung gleicht dem, der bereits unter dem Punkt „Durchführung der Rein-heitskontrolle“ beschrieben wurde.

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Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Merck, Darmstadt, D

(Ionomycin) Merck, Darmstadt, D

Brefeldin A eBioscience GmbH, Frankfurt, D

Paraformaldehyd (PFA) 2 % in PBS Merck, Darmstadt, D Saponin 0,5 % in FACS Puffer Applichem, Darmstadt, D

3.15.2.2. Durchführung

Die Proben wurden in einer 96-well Platte in 200 µl Kulturmedium wie oben beschrieben im CO2-Inkubator für 24 Stunden restimuliert, um die Zytokinproduktion anzuregen. Am nächs-ten Tag erfolgte die Überführung der Zellen in FACS Röhrchen und neben Oberflächenfär-bung der Zellen wurde auch eine FärOberflächenfär-bung der produzierten Zytokine IFN-g und IL-17a durch-geführt. Zu diesem Zweck erfolgte eine zusätzliche unspezifische Stimulation der Zellen mit 500ng Ionomycin und 50ng Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) pro Probe. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 wurde den Proben das

Brefel-36

din A zugefügt. Es führt in den Zellen einen Zerfall des Golgi-Apparates herbei, sodass keine Proteine mehr sezerniert werden können und die produzierten Zytokine in der Zelle verblei-ben. Nach vier weiteren Stunden der Inkubation wurden die Proben im Anschluss an zwei Waschschritte in 0,5 prozentigem Saponinpuffer aufgenommen um die intrazelluläre IFN-g- und IL-17A-Färbung durchzuführen. Den Proben wurde zu diesem Zweck 200 µl einer Anti-körpermischung in der unten angegeben Konzentration zugesetzt. Im Anschluss an eine 30 minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius wurden die Proben mehrfach gewaschen und schließ-lich zum Einlesen in 100-200 µl FACS-Puffer aufgenommen. Die eingesetzten Antikörper sind in der folgenden Tabelle aufgelistet, wobei die intrazellulären Antikörper farbig hervorgeho-ben sind. 3.16. Cytometric Bead Array (CBA)

3.16.1. Material und Reagenzien

BD™ CBA Mouse Inflammation Kit BD Bioscience, San Jose, USA 3.16.2. Durchführung

Die Methode des Cytometric Bead Array dient ebenfalls dazu, Zytokine z.B. in Kulturüber-ständen zu detektieren und quantifizieren. Anders als bei der ELISA-Technik ist es hier je-doch möglich, die Überstände auf bis zu 12 Zytokine gleichzeitig zu untersuchen.

Es werden Fängerantikörper eingesetzt, die spezifisch mit dem jeweiligen Zytokin interagie-ren. Gleichzeitig sind Beads an die Antikörper gekoppelt, welche jeweils eine individuelle Fluoreszenz aufweisen. Die Zytokine lassen sich so anhand der unterschiedlichen Fluores-zenzeigenschaften der Beads differenzieren. Die Detektion der Zytokine erfolgt mit Hilfe der Bindung spezifischer Detektions-Antikörper, welche direkt mit dem Farbstoff Phycoerythrin

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(PE) konjugiert sind. Dabei ist die Stärke des PE-Fluoreszenzsignals nach Zugabe des sog. De-tektionsreagenz proportional zur Menge des gebundenen Zytokins.

Die zu untersuchenden Überstände werden sowohl mit den Fängerantikörpern als auch mit dem Detektionsreagenz inkubiert, sodass sich Sandwich Komplexe aus Antikörper, Zytokin und Detektionsreagenz bilden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie kann dann die PE-Fluoreszenz gemessen und die Menge der enthaltenen Zytokine bestimmt werden. Getestet wurden in diesem Fall die Zytokine IL-17A, IL-17F, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, GM-CSF und INF-g.

Dabei wird jedem Bead eine alphanumerische Position (z.B. A4, B3, E2 usw.) zugeordnet, welche seine Position im Vergleich zu den übrigen Beads anzeigt.

3.17. RNA Aufreinigung

Um die RNA aus den Zellen der Zellkultur zu isolieren, wurde das RNeasy Micro Kit der Firma Qiagen eingesetzt. Die Isolierung wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Zu-nächst erfolgte unter stark denaturierenden Bedingungen eine Lyse und Homogenisation der Proben, wobei das im Lysepuffer enthaltene Guanidium Isothiocyanat und b-Mercaptoethanol die RNAsen inaktiviert. Die anschließende Zugabe von Ethanol gewährleis-tet optimale Bedingungen für die Bindung der RNA an die Silica-Gel-Membran der RNeasy Säulen. Durch die Bindung der RNA an diese Membran können die Proben von DNA, Protei-nen und anderen KontaminatioProtei-nen befreit werden. Eluiert wird die RNA schließlich durch die Zugabe von RNase-freiem Wasser

3.17.1. Material und Reagenzien

RNeasy Micro Kit (50) Qiagen Science, Maryland, USA 70% und 80% Ethanol

3.17.2. Durchführung

Die RNA Isolierung erfolgte exakt nach den Herstellervorgaben des im RNeasy Micro Kit ent-haltenen Protokolls

38 Abbildung 6: Ablauf RNA Isolierung

Quelle: Internetauftritt der Firma Qiagen (Handbuch RNeasy Micro Kit)

(https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/total-rna/rneasy-micro-kit/#productdetails)

3.18. Bestimmung der RNA-Konzentration

Der Gehalt der RNA in den jeweiligen Probe wurde spektralphotometrisch mit Hilfe des Na-no Drop 2000c (Thermo Fischer Scientific) gemessen. Es wird die Absorption bei 260nm und 280nm bestimmt, wobei die RNA ihr Absorptionsmaximum bei 260nm hat. Die optische Dichte (OD) bei 280nm gibt Aufschluss über die Verunreinigung der Probe mit Proteinen. Bei der Messung sollte daher das Verhältnis der OD bei 260nm zur OD bei 280nm in einem Be-reich zwischen 1,7 und 2,0 liegen.

Nach Bestimmung der RNA-Konzentrationen in den Proben werden diese bis zur cDNA-Synthese bei -80°C gelagert.

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3.19. Reverse-Transkription: cDNA Synthese

Um die aufgereinigte RNA der Polymerase-Kettenreaktion unterziehen zu können, musste sie zunächst in doppelsträngige cDNA (complementary DNA) umgeschrieben werden. Zu diesem Zweck wurde das High Capacity RNA-to-cDNA Kit der Firma Life technologies ver-wendet.

Die im Kit enthaltene reverse Transkriptase (MultiScribe Reverse Transcriptase) ist eine re-kombinante reverse Transkriptase aus dem Moloney murine leukemia virus (MoMLV).

Zur Initiation der cDNA-Synthese benötigt die reverse Transkriptase eine kurze RNA Sequenz, den Primer. Bei den hier verwendeten Primern handelt es sich um sog. Random Primer.

3.19.1. Material und Reagenzien

High Capacity RNA-to-cDNA Kit : Life technologies, Darmstadt, Deutschland

3.19.2. Durchführung

Nach Messung der RNA-Konzentration in den Proben wird zunächst ein Master Mix für die cDNA Synthese gemäß den Herstellerangaben angesetzt. Die Proben werden nach Überfüh-rung des Reaktionsgemisches in 1,5 ml Eppendorf Gefäße so lange auf Eis gelagert, bis mit der reversen Transkription begonnen werden kann. Die Reaktion selbst findet dann in einem Thermal Cycler (Mastercycler gradient) der Firma Eppendorf statt, wo die Proben zunächst für 60 Minuten bei 37°C inkubiert werden. In dieser Zeit erfolgt nach Anlagerung der Primer an die RNA die Umschreibung der RNA in cDNA durch die reverse Transkriptase. Die Reakti-on wird durch fünfminütiges Erhitzen auf 95°C abgestoppt, da das Enzym bei dieser Tempe-ratur inaktiviert wird. Nachdem die Proben im Thermal Cycler auf 4°C abgekühlt wurden, können sie entnommen und bis zur Durchführung der PCR bei -20°C gelagert werden.

3.20. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird das natürliche Prinzip der DNA-Replikation nachgeahmt, wobei kurze DNA Sequenzen exponentiell amplifiziert werden können. Es han-delt sich um einen Prozess der in drei Schritten abläuft: Zunächst wird der DNA-Doppel-strang bei 90-95°C denaturiert, wobei EinzelDNA-Doppel-strang-DNA entsteht. Anschließend lagern sich bei 55-60°C zwei Primer an ihre jeweilige komplementäre Sequenz auf den Einzelsträngen an. Sie sind die Startmoleküle für ein bestimmtes Enzym, die sog. DNA-Polymerase, die bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxy-Nucleosidtriphosphaten (dNTPs)

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für die Verlängerung der Zielsequenz sorgt. Es ist entscheidend, dass die verwendete DNA-Polymerase hitzestabil ist, d.h. dass sie bei Temperaturen von 95°C und mehr nicht denatu-riert. Als Beispiel ist in diesem Zusammenhang die DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus, die sog. Taq-Polymerase, zu nennen⁶⁵.

3.21. Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR)

Basierend auf dem Prinzip der oben beschriebenen Polymerase-Kettenraktion stellt die qRT-PCR eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren dar, bei der zusätzliche eine Quantifi-zierung in Echtzeit vorgenommen werden kann. Diese QuantifiQuantifi-zierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Bestimmungen während eines PCR-Zyklus durchgeführt, wobei die gemessene Fluoreszenz proportional zur Menge der PCR-Produkte ist⁶⁵. Für die qRT-PCR-Untersuchungen wurde der fluoreszierende Farbstoff SYBR Green I, der im Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix der Firma Life technologies enthalten ist, eingesetzt. Der Farb-stoff lagert sich in den synthetisierten doppelsträngigen DNA Molekülen ein und sendet Flu-oreszenzsignale aus. Allerdings bindet dieser Farbstoff nicht spezifisch an die Zielsequenz, sondern kann ggf. auch mit Nebenprodukten der PCR oder Primer-Dimeren interagieren. Um neben der hohen Sensitivität des Verfahrens auch eine gute Spezifität zu gewährleisten wur-de am Enwur-de wur-der PCR eine Schmelzkurvenanalyse zur Bestimmung wur-der spezifischen Schmelz-temperatur (Tm) der DNA-Fragmente durchgeführt.

Unser Hauptaugenmerk bei der qRT-PCR lag auf der Untersuchung, inwieweit die gd T-Zellen in der Zellkultur IL17a und den spezifischen Transkriptionsfaktor RORgt exprimieren. Später wurden die RNA-Proben aus den Experimenten, bei denen die ELISA-Untersuchungen be-sonders aussagekräftig waren, mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR weiteren Expressi-ons-Analysen unterzogen (Zielstrukturen bzw. Primer s. Tabelle). Für jede PCR wurde das Step One Plus Real-Time PCR System der Firma Life technologies eingesetzt.

3.21.1. Primer

Eine Auflistung der verwendeten Primer findet sich im Anhang.

3.21.2. Housekeeping-Gen GAPDH

Zur quantitativen Untersuchung der DNA-Templates wurde eine relative Quantifizierungs-methode verwendet. Hierbei wird ein sog. Housekeeping-Gen als Referenzgen benutzt, um die Expression des Zielgens zu normalisieren. Als Housekeeping-Gen diente in unserem Fall das GAPDH, welches von T-Zellen relativ konstant und unabhängig von ihrer Aktivität

expri-41

miert wird. Von der Menge der detektierten GAPDH messengerRNA (mRNA) kann man also auf die Zahl der Zellen schließen. Bei jeder PCR wurde daher eine Housekeeping PCR mit einem mGAPDH Primer mitgeführt.

3.21.3. Material und Reagenzien

Step One Plus Real-Time PCR System Life technologies, Darmstadt, D

Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix Thermo Fisher Scientific, Bonn, D

3.21.4. Durchführung

Für die PCR wird zunächst ein Reaktionsgemisch angesetzt. Pro Probe d.h. pro Reaktion auf der Platte werden 12,5 µl des SYBR Green Master Mix, 2,5 µl des Primer Assays und 9 µl nuk-leasefreies Wasser verwendet. Falls mehrere Gene untersucht werden sollen, ist für jeden Primer ein Mix aus dem jeweiligen Primer Assay herzustellen. Als erstes wird dann 1 µl der cDNA Probe nach Plattendesign auf die Platte aufgetragen. Anschließend werden 24 µl des Reaktionsgemisches zu jedem well hinzugefügt, die Platte mit einer Folie versiegelt und zur Durchführung in den Step One Plus Real-Time PCR Cycler gestellt.

Es ist zu beachten, dass für jede Probe neben den zu untersuchenden Genen auch eine PCR für das Referenzgen GAPDH durchgeführt werden muss, um die anschließende Auswertung vornehmen zu können. Zusätzlich wird für jeden Primer eine Negativkontrolle mitgeführt, d.h. pro eingesetztem Primer werden drei wells mit allen Komponenten des Reaktionsgemi-sches aber ohne cDNA der Proben gefüllt. Diese sogenannte no template control (NTC) dient dazu, etwaige Verunreinigungen oder die Bildung von Primerdimeren beurteilen zu können.

3.21.4.1. Bedingungen der qRT-PCR

Denaturierung (Schmelzen):

Die doppelsträngige cDNA wird zunächst auf 94 °C erhitzt, was dazu führt, dass die Wasser-stoffbrückenbindungen, die die DNA-Stränge zusammen halten, aufgebrochen werden. Die DNA liegt anschließend in zwei Einzelsträngen vor. Um Sorge zu tragen, dass sowohl die Aus-gangs-DNA als auch die eingesetzten Primer komplett getrennt werden, wird die DNA im ersten Zyklus oft länger erhitzt als in den nachfolgenden Zyklen.

42 Primerhybridisierung:

Damit sich die Primer an die DNA-Stränge anlagern können, wird die Temperatur auf ca. 60

°C gesenkt. Die Temperatur ist je nach Primer unterschiedlich und muss dementsprechend angepasst werden. Für RORgt, IL-17a und IL-23r beträgt die Anlagerungstemperatur 55°C.

Wird eine zu hohe Temperatur eingestellt, ist es möglich, dass sich die Primer aufgrund ihrer verstärkten thermischen Bewegung nur inadäquat anlagern können, was die Produktbildung beeinträchtigt. Zu niedrige Temperaturen können dazu führen, dass unspezifische Produkte gebildet werden.

Elongation (Amplifikation):

Bei 72°C synthetisiert die DNA-Polymerase dann in der letzten Phase des Zyklus ausgehend von den Primern DNA-Doppelstränge. Die Primer werden nicht abgelöst, da sie den Anfang der neuen Einzelstränge bilden.

3.21.5. Auswertung der Daten

3.21.5. Auswertung der Daten

Im Dokument Effekte synthetischer Retinoid-Rezeptor-Liganden auf IL-17 produzierende γδ T-Zellen in der experimentellen Gallengangatresie (Seite 29-0)