3. MATERIAL UND METHODEN
3.13. I NTERLEUKIN -17 ELISA
Zur Bestimmung der Menge an IL-17 in den Kulturüberständen wurde der IL-17-Maus DuoSet ELISA der Firma R&D Systems verwendet. Sowohl beim IL17 als auch beim u.g. IFNg -ELISA handelt es sich um einen sog. Indirekten Sandwich -ELISA.
3.13.1. Material und Reagenzien Lösungen:
Reagentpuffer: 1 % BSA in 1xPBS
Waschpuffer: 0,05 % Tween 20 (Polyethylensorbitonmonolaurat) in 1xPBS
34 3.14. Interferon-g ELISA
Zur Bestimmung der Menge an IFNg in den Kulturüberständen wurde der IFNg-Maus DuoSet ELISA der Firma R&D Systems verwendet. Die Durchführung erfolgte in allen Schritten exakt anhand des Herstellerprotokolls.
3.14.1. Material und Reagenzien Lösungen:
Reagentpuffer: 1 % BSA in 1xPBS
Waschpuffer: 0,05 % Tween 20 (Polyethylensorbitonmonolaurat) in 1xPBS
3.14.2. Durchführung
Das Protokoll unterscheidet sich außer in der Zusammensetzung des Reagentpuffers und des Blockpuffers nicht von dem des IL-17 ELISAs (s.o.). Alle Schritte werden exakt anhand der Vorgaben des Protokolls durchgeführt.
3.15. Charakterisierung der T-Zell-Verteilung inkl. des Anteils IL-17 positiver gd T-Zellen mittels Durchflusszytometrie
3.15.1. Oberflächenfärbung
Der Unterschied zu der unter 3.8 beschriebenen T-Zell-Phänotypisierungs-Färbung liegt da-rin, dass nicht die Reinheit der gd T-Zell-Kultur überprüft werden sollte, sondern die Diffe-renzierung der T-Zellen in der Leber von erkrankten Tieren bzw. in Milz und Lymphknoten.
Dabei wurden CD8a- und CD4-Antikörper eingesetzt, um die T-Zellen genauer zu differenzie-ren. Außerdem diente der Antikörper gegen das Oberflächenmolekül CD25 dazu, aktivierte von nicht aktivierten T-Zellen zu unterscheiden. Die gesamte Liste der eingesetzten Antikör-per ist der folgenden Tabelle unter dem Punkt „T-Zell-Phänotypisierung 2“ zu entnehmen.
Der Ablauf der Färbung gleicht dem, der bereits unter dem Punkt „Durchführung der Rein-heitskontrolle“ beschrieben wurde.
35
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Merck, Darmstadt, D
(Ionomycin) Merck, Darmstadt, D
Brefeldin A eBioscience GmbH, Frankfurt, D
Paraformaldehyd (PFA) 2 % in PBS Merck, Darmstadt, D Saponin 0,5 % in FACS Puffer Applichem, Darmstadt, D
3.15.2.2. Durchführung
Die Proben wurden in einer 96-well Platte in 200 µl Kulturmedium wie oben beschrieben im CO2-Inkubator für 24 Stunden restimuliert, um die Zytokinproduktion anzuregen. Am nächs-ten Tag erfolgte die Überführung der Zellen in FACS Röhrchen und neben Oberflächenfär-bung der Zellen wurde auch eine FärOberflächenfär-bung der produzierten Zytokine IFN-g und IL-17a durch-geführt. Zu diesem Zweck erfolgte eine zusätzliche unspezifische Stimulation der Zellen mit 500ng Ionomycin und 50ng Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) pro Probe. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 wurde den Proben das
Brefel-36
din A zugefügt. Es führt in den Zellen einen Zerfall des Golgi-Apparates herbei, sodass keine Proteine mehr sezerniert werden können und die produzierten Zytokine in der Zelle verblei-ben. Nach vier weiteren Stunden der Inkubation wurden die Proben im Anschluss an zwei Waschschritte in 0,5 prozentigem Saponinpuffer aufgenommen um die intrazelluläre IFN-g- und IL-17A-Färbung durchzuführen. Den Proben wurde zu diesem Zweck 200 µl einer Anti-körpermischung in der unten angegeben Konzentration zugesetzt. Im Anschluss an eine 30 minütige Inkubation bei 4 Grad Celsius wurden die Proben mehrfach gewaschen und schließ-lich zum Einlesen in 100-200 µl FACS-Puffer aufgenommen. Die eingesetzten Antikörper sind in der folgenden Tabelle aufgelistet, wobei die intrazellulären Antikörper farbig hervorgeho-ben sind. 3.16. Cytometric Bead Array (CBA)
3.16.1. Material und Reagenzien
BD™ CBA Mouse Inflammation Kit BD Bioscience, San Jose, USA 3.16.2. Durchführung
Die Methode des Cytometric Bead Array dient ebenfalls dazu, Zytokine z.B. in Kulturüber-ständen zu detektieren und quantifizieren. Anders als bei der ELISA-Technik ist es hier je-doch möglich, die Überstände auf bis zu 12 Zytokine gleichzeitig zu untersuchen.
Es werden Fängerantikörper eingesetzt, die spezifisch mit dem jeweiligen Zytokin interagie-ren. Gleichzeitig sind Beads an die Antikörper gekoppelt, welche jeweils eine individuelle Fluoreszenz aufweisen. Die Zytokine lassen sich so anhand der unterschiedlichen Fluores-zenzeigenschaften der Beads differenzieren. Die Detektion der Zytokine erfolgt mit Hilfe der Bindung spezifischer Detektions-Antikörper, welche direkt mit dem Farbstoff Phycoerythrin
37
(PE) konjugiert sind. Dabei ist die Stärke des PE-Fluoreszenzsignals nach Zugabe des sog. De-tektionsreagenz proportional zur Menge des gebundenen Zytokins.
Die zu untersuchenden Überstände werden sowohl mit den Fängerantikörpern als auch mit dem Detektionsreagenz inkubiert, sodass sich Sandwich Komplexe aus Antikörper, Zytokin und Detektionsreagenz bilden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie kann dann die PE-Fluoreszenz gemessen und die Menge der enthaltenen Zytokine bestimmt werden. Getestet wurden in diesem Fall die Zytokine IL-17A, IL-17F, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, GM-CSF und INF-g.
Dabei wird jedem Bead eine alphanumerische Position (z.B. A4, B3, E2 usw.) zugeordnet, welche seine Position im Vergleich zu den übrigen Beads anzeigt.
3.17. RNA Aufreinigung
Um die RNA aus den Zellen der Zellkultur zu isolieren, wurde das RNeasy Micro Kit der Firma Qiagen eingesetzt. Die Isolierung wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Zu-nächst erfolgte unter stark denaturierenden Bedingungen eine Lyse und Homogenisation der Proben, wobei das im Lysepuffer enthaltene Guanidium Isothiocyanat und b-Mercaptoethanol die RNAsen inaktiviert. Die anschließende Zugabe von Ethanol gewährleis-tet optimale Bedingungen für die Bindung der RNA an die Silica-Gel-Membran der RNeasy Säulen. Durch die Bindung der RNA an diese Membran können die Proben von DNA, Protei-nen und anderen KontaminatioProtei-nen befreit werden. Eluiert wird die RNA schließlich durch die Zugabe von RNase-freiem Wasser
3.17.1. Material und Reagenzien
RNeasy Micro Kit (50) Qiagen Science, Maryland, USA 70% und 80% Ethanol
3.17.2. Durchführung
Die RNA Isolierung erfolgte exakt nach den Herstellervorgaben des im RNeasy Micro Kit ent-haltenen Protokolls
38 Abbildung 6: Ablauf RNA Isolierung
Quelle: Internetauftritt der Firma Qiagen (Handbuch RNeasy Micro Kit)
(https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/total-rna/rneasy-micro-kit/#productdetails)
3.18. Bestimmung der RNA-Konzentration
Der Gehalt der RNA in den jeweiligen Probe wurde spektralphotometrisch mit Hilfe des Na-no Drop 2000c (Thermo Fischer Scientific) gemessen. Es wird die Absorption bei 260nm und 280nm bestimmt, wobei die RNA ihr Absorptionsmaximum bei 260nm hat. Die optische Dichte (OD) bei 280nm gibt Aufschluss über die Verunreinigung der Probe mit Proteinen. Bei der Messung sollte daher das Verhältnis der OD bei 260nm zur OD bei 280nm in einem Be-reich zwischen 1,7 und 2,0 liegen.
Nach Bestimmung der RNA-Konzentrationen in den Proben werden diese bis zur cDNA-Synthese bei -80°C gelagert.
39
3.19. Reverse-Transkription: cDNA Synthese
Um die aufgereinigte RNA der Polymerase-Kettenreaktion unterziehen zu können, musste sie zunächst in doppelsträngige cDNA (complementary DNA) umgeschrieben werden. Zu diesem Zweck wurde das High Capacity RNA-to-cDNA Kit der Firma Life technologies ver-wendet.
Die im Kit enthaltene reverse Transkriptase (MultiScribe Reverse Transcriptase) ist eine re-kombinante reverse Transkriptase aus dem Moloney murine leukemia virus (MoMLV).
Zur Initiation der cDNA-Synthese benötigt die reverse Transkriptase eine kurze RNA Sequenz, den Primer. Bei den hier verwendeten Primern handelt es sich um sog. Random Primer.
3.19.1. Material und Reagenzien
High Capacity RNA-to-cDNA Kit : Life technologies, Darmstadt, Deutschland
3.19.2. Durchführung
Nach Messung der RNA-Konzentration in den Proben wird zunächst ein Master Mix für die cDNA Synthese gemäß den Herstellerangaben angesetzt. Die Proben werden nach Überfüh-rung des Reaktionsgemisches in 1,5 ml Eppendorf Gefäße so lange auf Eis gelagert, bis mit der reversen Transkription begonnen werden kann. Die Reaktion selbst findet dann in einem Thermal Cycler (Mastercycler gradient) der Firma Eppendorf statt, wo die Proben zunächst für 60 Minuten bei 37°C inkubiert werden. In dieser Zeit erfolgt nach Anlagerung der Primer an die RNA die Umschreibung der RNA in cDNA durch die reverse Transkriptase. Die Reakti-on wird durch fünfminütiges Erhitzen auf 95°C abgestoppt, da das Enzym bei dieser Tempe-ratur inaktiviert wird. Nachdem die Proben im Thermal Cycler auf 4°C abgekühlt wurden, können sie entnommen und bis zur Durchführung der PCR bei -20°C gelagert werden.
3.20. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird das natürliche Prinzip der DNA-Replikation nachgeahmt, wobei kurze DNA Sequenzen exponentiell amplifiziert werden können. Es han-delt sich um einen Prozess der in drei Schritten abläuft: Zunächst wird der DNA-Doppel-strang bei 90-95°C denaturiert, wobei EinzelDNA-Doppel-strang-DNA entsteht. Anschließend lagern sich bei 55-60°C zwei Primer an ihre jeweilige komplementäre Sequenz auf den Einzelsträngen an. Sie sind die Startmoleküle für ein bestimmtes Enzym, die sog. DNA-Polymerase, die bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxy-Nucleosidtriphosphaten (dNTPs)
40
für die Verlängerung der Zielsequenz sorgt. Es ist entscheidend, dass die verwendete DNA-Polymerase hitzestabil ist, d.h. dass sie bei Temperaturen von 95°C und mehr nicht denatu-riert. Als Beispiel ist in diesem Zusammenhang die DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus, die sog. Taq-Polymerase, zu nennen65.
3.21. Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR)
Basierend auf dem Prinzip der oben beschriebenen Polymerase-Kettenraktion stellt die qRT-PCR eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren dar, bei der zusätzliche eine Quantifi-zierung in Echtzeit vorgenommen werden kann. Diese QuantifiQuantifi-zierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Bestimmungen während eines PCR-Zyklus durchgeführt, wobei die gemessene Fluoreszenz proportional zur Menge der PCR-Produkte ist65. Für die qRT-PCR-Untersuchungen wurde der fluoreszierende Farbstoff SYBR Green I, der im Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix der Firma Life technologies enthalten ist, eingesetzt. Der Farb-stoff lagert sich in den synthetisierten doppelsträngigen DNA Molekülen ein und sendet Flu-oreszenzsignale aus. Allerdings bindet dieser Farbstoff nicht spezifisch an die Zielsequenz, sondern kann ggf. auch mit Nebenprodukten der PCR oder Primer-Dimeren interagieren. Um neben der hohen Sensitivität des Verfahrens auch eine gute Spezifität zu gewährleisten wur-de am Enwur-de wur-der PCR eine Schmelzkurvenanalyse zur Bestimmung wur-der spezifischen Schmelz-temperatur (Tm) der DNA-Fragmente durchgeführt.
Unser Hauptaugenmerk bei der qRT-PCR lag auf der Untersuchung, inwieweit die gd T-Zellen in der Zellkultur IL17a und den spezifischen Transkriptionsfaktor RORgt exprimieren. Später wurden die RNA-Proben aus den Experimenten, bei denen die ELISA-Untersuchungen be-sonders aussagekräftig waren, mit Hilfe der quantitativen Real-Time-PCR weiteren Expressi-ons-Analysen unterzogen (Zielstrukturen bzw. Primer s. Tabelle). Für jede PCR wurde das Step One Plus Real-Time PCR System der Firma Life technologies eingesetzt.
3.21.1. Primer
Eine Auflistung der verwendeten Primer findet sich im Anhang.
3.21.2. Housekeeping-Gen GAPDH
Zur quantitativen Untersuchung der DNA-Templates wurde eine relative Quantifizierungs-methode verwendet. Hierbei wird ein sog. Housekeeping-Gen als Referenzgen benutzt, um die Expression des Zielgens zu normalisieren. Als Housekeeping-Gen diente in unserem Fall das GAPDH, welches von T-Zellen relativ konstant und unabhängig von ihrer Aktivität
expri-41
miert wird. Von der Menge der detektierten GAPDH messengerRNA (mRNA) kann man also auf die Zahl der Zellen schließen. Bei jeder PCR wurde daher eine Housekeeping PCR mit einem mGAPDH Primer mitgeführt.
3.21.3. Material und Reagenzien
Step One Plus Real-Time PCR System Life technologies, Darmstadt, D
Maxima SYBR Green/Rox qPCR Master Mix Thermo Fisher Scientific, Bonn, D
3.21.4. Durchführung
Für die PCR wird zunächst ein Reaktionsgemisch angesetzt. Pro Probe d.h. pro Reaktion auf der Platte werden 12,5 µl des SYBR Green Master Mix, 2,5 µl des Primer Assays und 9 µl nuk-leasefreies Wasser verwendet. Falls mehrere Gene untersucht werden sollen, ist für jeden Primer ein Mix aus dem jeweiligen Primer Assay herzustellen. Als erstes wird dann 1 µl der cDNA Probe nach Plattendesign auf die Platte aufgetragen. Anschließend werden 24 µl des Reaktionsgemisches zu jedem well hinzugefügt, die Platte mit einer Folie versiegelt und zur Durchführung in den Step One Plus Real-Time PCR Cycler gestellt.
Es ist zu beachten, dass für jede Probe neben den zu untersuchenden Genen auch eine PCR für das Referenzgen GAPDH durchgeführt werden muss, um die anschließende Auswertung vornehmen zu können. Zusätzlich wird für jeden Primer eine Negativkontrolle mitgeführt, d.h. pro eingesetztem Primer werden drei wells mit allen Komponenten des Reaktionsgemi-sches aber ohne cDNA der Proben gefüllt. Diese sogenannte no template control (NTC) dient dazu, etwaige Verunreinigungen oder die Bildung von Primerdimeren beurteilen zu können.
3.21.4.1. Bedingungen der qRT-PCR
Denaturierung (Schmelzen):
Die doppelsträngige cDNA wird zunächst auf 94 °C erhitzt, was dazu führt, dass die Wasser-stoffbrückenbindungen, die die DNA-Stränge zusammen halten, aufgebrochen werden. Die DNA liegt anschließend in zwei Einzelsträngen vor. Um Sorge zu tragen, dass sowohl die Aus-gangs-DNA als auch die eingesetzten Primer komplett getrennt werden, wird die DNA im ersten Zyklus oft länger erhitzt als in den nachfolgenden Zyklen.
42 Primerhybridisierung:
Damit sich die Primer an die DNA-Stränge anlagern können, wird die Temperatur auf ca. 60
°C gesenkt. Die Temperatur ist je nach Primer unterschiedlich und muss dementsprechend angepasst werden. Für RORgt, IL-17a und IL-23r beträgt die Anlagerungstemperatur 55°C.
Wird eine zu hohe Temperatur eingestellt, ist es möglich, dass sich die Primer aufgrund ihrer verstärkten thermischen Bewegung nur inadäquat anlagern können, was die Produktbildung beeinträchtigt. Zu niedrige Temperaturen können dazu führen, dass unspezifische Produkte gebildet werden.
Elongation (Amplifikation):
Bei 72°C synthetisiert die DNA-Polymerase dann in der letzten Phase des Zyklus ausgehend von den Primern DNA-Doppelstränge. Die Primer werden nicht abgelöst, da sie den Anfang der neuen Einzelstränge bilden.
3.21.5. Auswertung der Daten
Für die Datenauswertung wurde die geräteeigene Step one plus-Software (Life technologies) verwendet. Für die grafische Darstellung wird die gemessene Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen aufgetragen.
Die Werte der relativen Genexpression wurden mit Hilfe des sog. Houskeeping-Gen GAPDH berechnet und normalisiert. Die Berechnung des Expressionsunterschiedes erfolgt über die sog. DDCP Methode. In einem ersten Schritt wird für jede Probe der CP-Wert des Referenz-gens (GAPDH) vom CP-Wert des zu untersuchenden Gens abgezogen (DCP). Von diesem DCP Wert wird anschließend der DCP-Wert einer Kontrolle abgezogen. Diese Methode wird als 2-DD CT-Berechnungsmodell bezeichnet.
3.22. Statistische Auswertung und Erstellen von Graphen
Die in dieser Dissertation gezeigten graphischen Darstellungen wurden mit der Software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA) erstellt. Mit dieser Software erfolgte ebenfalls die statistische Auswertung der Daten mittels einer mehrfaktoriellen Varianzanaly-se (2way-ANOVA). Zur statistischen Auswertung der Überlebenskurven der Tiere (s. Kapitel 4.3.1.1.) wurden jeweils die bedingten Überlebenswahrscheinlichkeiten berechnet und mit-tels Kaplan-Meier-Kurve dargestellt.
43 4. Ergebnisse
4.1.TCRgd-Stimulation, CD28-Co-Stimulation und IL-23 induzieren IL-17 Produktion von gd T-Zellen in vitro
4.1.1. Das in vitro System
4.1.1.1. Etablierung einer Zellkultur für IL-17 produzierende gd T-Zellen
Die Untersuchung von Effekten des Retinoid-Rezeptor-Liganden AM80 auf gd T-Zellen erfor-derte die Etablierung eines stabilen Zellkultur-Systems. In diesem mussten gd T-Zellen kon-trolliert zur Produktion von IL-17 angeregt werden.
Für diese Induktion haben wir uns auf drei Einflussfaktoren fokussiert: Die Dauer der Stimu-lationszeit, das Zytokinmilieu in der Kultur sowie die Antikörper, die die gd T-Zellen stimulie-ren.
Abbildung 7: Etablierung der gd T-Zell-Kultur hinsichtlich Zytokinmilieu, Stimulationszeit und stimulierendem Antikörper
44 Legende:
A) Stimulation von 2x105 MACS-gesorteten gd T Zellen durch Zugabe von IL-23 (10 ng/ml) im Vergleich zur Zugabe von TGF-b und IL-6, Kulturplatten jeweils gecoated mit anti-TCRgd Anti-körper GL3 (10 µg/ml); *** = p<0.001
B) Zusätzliche Stimulation der MACS-gesorteten gd T Zellen (Zellzahl 2x105) durch Zugabe des löslichen Antikörpers anti-CD28 bei gleichzeitiger Stimulation via anti-TCRgd Antikörper GL3 in der Dosis 2 µg oder 10 µg; ** = p<0.01, * = p<0.1
C) Stimulation von 2x105 MACS-gesorteten gd T Zellen via anti-CD3 Antikörper 2C11 oder an-ti-TCRgd Antikörper GL3-gecoateten Kulturplatten und Zusatz von anti-CD28 und IL-23
D) Menge der IL17-Produktion MACS-gesorteter gd T Zellen (Zellzahl 2x105) nach 24h, 48h, 72h und 96h Stimulationszeit bei Stimulation mit GL3 (10 µg/ml), antiCD28 (1µg/ml), IL-23 (10 ng/ml) und IL-1b(5 ng/ml)
Bezüglich der gd T Zell Stimulation waren der standardmäßig und alle T Zellen stimulierende antiCD3 Antikörper (Klon 2C11) und der aTCRgd-Antikörper (Klon GL3) gleichwertig (Fig. 7B).
Da die Verwendung des TCRgd spezifischen GL3-Antikörpers die Stimulation von evtl. kon-taminierenden ab T-Zellen ausschließt, wurde dieser bei den folgenden Versuchen einge-setzt. Als Dosierung erbrachte eine Beschichtung der Platten mit 10 µg/ml GL3 die höchste IL-17 Produktion (Fig. 7 C), eine weitere Dosissteigerung erbrachte keine höheren IL-17 Wer-te (DaWer-ten nicht gezeigt). Auffallend war, dass eine Co-Stimulation via anti-CD28 in unserem System unbedingt erforderlich war um die gd T Zellen zur Produktion einer substantielle Mengen IL-17 anzuregen (Fig. 7 C).
gd T Zellen erfordern ein spezifisches Zytokinmilieu während der Stimulation um IL-17 zu produzieren. Ohne Zytokin-Zusatz produzierten die aus gesunden Mäusen isolierten gd T Zellen gar kein IL-17 (Fig. 7A, Kontrolle). TGF-b und IL-6, welche die klassischen Zytokine zur Differenzierung von Th-17-Zellen sind, hatten keine IL-17 induzierende Wirkung auf gd T Zel-len. IL-23 hingegen induzierte die Produktion von IL-17 zuverlässig (Fig. 7A). Titrationen der Konzentration erbrachten 10 ng/ml als ideale Konzentration (Daten nicht gezeigt). Eine zu-sätzliche Induktion der IL-17-Produktion konnte durch die Zugabe von IL-1b (5 ng/ml) er-reicht werden (Daten nicht gezeigt). Im letzten Schritt überprüften wir die IL-17 Konzentrati-on im Kulturüberstand zu verschiedenen Zeitpunkten und identifizierten 72h als ideale
Kul-45
turdauer (Fig. 7D). Nachdem die optimalen Zellkultur-Bedingungen gefunden waren, wurde die Versuchsreihe insgesamt acht Mal durchgeführt. Dabei entfielen vier Versuche auf den Nachweis der Dosis-Wirkungsbeziehung von AM80 bei einer Inkubationszeit von 72 Stunden auf Proteinebene. Da die Effekte auf Transkriptionsebene schon früher zu erwarten waren, wurden zusätzlich jeweils zwei Ansätze mit einer Inkubationszeit von 24 Stunden bzw. 40 Stunden durchgeführt und anschließend die gd T-Zell mRNA bzw. cDNA via qPCR untersucht.
In Fragestellung 1 (Was sind die optimalen Kulturbedingungen in Hinblick auf Stimulations-zeit und Zugabe von Zytokinen um gd T-Zellen in vitro zur IL-17 Produktion anzuregen?) suchten wir die optimalen Kulturbedingungen in Hinblick auf Stimulus, Stimulationszeit und Zugabe von Zytokinen um gd T-Zellen in vitro zur IL-17 Produktion anzuregen. Zusammenfas-send ist eine Stimulation mit dem aTCRgd-Antikörper (Klon GL3) (10 µg/ml) in Anwesenheit von IL-23 (10ng/ml) und IL-1b (5 ng/ml) sowie dem löslichen Antikörper aCD28 (1µg/ml) ide-al, die optimale Stimulationszeit betrug 72 Stunden.
4.1.1.2. Hohe Reinheit der gd T-Zell-Zellkultur
Eine entscheidende Voraussetzung für die Validität und damit auch für die richtige Interpre-tation der Ergebnisse, die mit Hilfe der Zellkultur generiert wurden, war, dass die überwie-gende Mehrheit der stimulierten Zellen wirklich gd T-Zellen sind. Andernfalls wäre es schwie-rig zu differenzieren, welche Effekte diesen neonatalen T-Zellen und nicht anderen Zellen, die die Kultur eventuell kontaminieren, zuzuschreiben sind. Im Verlauf der ersten Versuchs-reihen wurden daher die durch die MACS-Technologie isolierten Zellen mit Hilfe der oben beschriebenen Durchflusszytometrie untersucht. Es wurden neben der Vitalitätsfärbung aus-schließlich Oberflächenmarker gefärbt, um die isolierten Zellen näher zu charakterisieren.
46
Abbildung 8: Nachweis einer hohen Reinheit der gesorteten gd T-Zellen mittels FACS-Analyse (B). Darstellung der mangelhaften Reinheitskontrolle mittels Biotin-Markierung (A).
Legende:
A) Durchflusszytometrische Darstellung der anti-Biotin und CD3e doppelt positiven Zellen unter allen lebenden CD45 positiven Zellen nach MACS-Sorting; G--: Zellen negativ für CD3e und anti-Biotin, G+-: Zellen CD3e positiv aber anti-Biotin-negativ, G-+: Zellen anti-Biotin posi-tiv aber CD3e negaposi-tiv, G++: Zellen doppelt posiposi-tiv für CD3e und anti-Biotin
B) Durchflusszytometrische Darstellung der CD3e positiven Zellen mit gleichzeitigem Nach-weis eines gd T-Zell-Rezeptors (TCRgd+) unter allen lebenden CD45 positiven Zellen nach MACS Sorting; Gating: alle gd T-Zellen
Unter den Zellen, die CD45 exprimieren, wurden die CD3e und TCRgd positiven Zellen ge-genüber gestellt. CD45 ist mit Ausnahme von Erythrozyten auf der Zelloberfläche aller Zellen des hämatopoetischen Systems vorhanden. CD3e ist ein Marker für T-Zellen und unter die-sen waren diejenigen Zellen für uns von Bedeutungen, die gleichzeitig den gd T-Zellrezeptor exprimieren. Die Grafik zeigt, dass nahezu alle T-Zellen in der Kultur gd T-Zellen sind, was in diesem Fall eine Reinheit der Zellkultur von rund 98% bedeutet (Fig. 8B). Die Reinheitskon-trolle wurde viermal wiederholt und es ergaben sich bei jeder Durchführung Werte von 92%
oder mehr gd T-Zellen nach Isolierung mit dem TCR gd+- Isolation Kit der Firma Miltenyi
oder mehr gd T-Zellen nach Isolierung mit dem TCR gd+- Isolation Kit der Firma Miltenyi